第八章植物體細胞雜交

1、.第八章第八章 植物體細植物體細胞雜交胞雜交第一節(jié)第一節(jié) 植物體細胞雜交的概念植物體細胞雜交的概念第二節(jié)第二節(jié) 原生質體融合原生質體融合第三節(jié)第三節(jié) 雜種細胞的選擇和體細胞雜種的鑒定雜種細胞的選擇和體細胞雜種的鑒定第四節(jié)第四節(jié) 細胞質雜種細胞質雜種第五節(jié)第五節(jié) 原生質體的遺傳修飾原生質體的遺傳修飾第六節(jié)第六節(jié) 體細胞雜交的技術的應用體細胞雜交的技術的應用.1 植物體細胞雜交的概念植物體細胞雜交的概念一 植物原生質體融合技術的發(fā)展二 植物細胞雜交類型.一 植物原生質體融合技術的發(fā)展1 原生質體融合技術發(fā)展 1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質體首次獲得成功；1970年，Power首

2、次用硝酸鈉進行為誘導劑進行了較大規(guī)模的原生質體 誘導融合；1971年，Takebe首次從離體煙草原生質體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這也是第 一個植物細胞雜種1974年，Kao將聚乙二醇誘導融合法應用于植物細胞融合并建立了相應 的融合技術；1978年，Melchers獲得了第一個屬間細胞雜種（番茄馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年，Schweiger建立了單對原生質體電融合技術程序。.一 植物原生質體融合技術的發(fā)展2 植物體細胞雜交（somatic hybridization):

3、 將植物不同種、屬甚至科間的原生質體通過人工誘導方法融合，然后進行離體培養(yǎng)再生植株的技術。v1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這也是第一個植物體細胞雜種。v19781978年梅爾徹斯年梅爾徹斯(Melchers)(Melchers)等首次獲得了番茄和馬等首次獲得了番茄和馬鈴薯的屬間體細胞雜種鈴薯的屬間體細胞雜種“Potamato”“Potamato”。.去掉細胞壁去掉細胞壁原生質體融合原生質體融合. 白菜白菜甘藍甘藍.3 意義克服有性不親和性障礙。使喪失形態(tài)發(fā)生能力的細胞恢復形態(tài)發(fā)生雙親葉綠體，線粒體DNA重組產生新的核 外遺傳系統(tǒng)。.二 植物細胞雜交類型1 植物

4、體細胞雜交類型（1）體細胞雜交 雙親的體細胞原生質體進行融合，培養(yǎng)篩選鑒定，從而獲得雜種植株的過程。（2）配子-體細胞雜交 一個為體細胞原生質體，一個為性細胞原生質體，融合獲得三倍體植株。.二 植物細胞雜交類型（3）配子間細胞雜交 均為性細胞的原生質體融合，精-精，卵-卵，精-卵原生質體融合。（4）微細胞雜交 誘導細胞產生高頻率的微核，分離制備含有微核的原生質體，只攜帶一條染色體。微小原生質體：只含有細胞核或部分染色體。通過轉移單個完整的染色體，建立單染色體添加系，解決細胞雜交出現(xiàn)的難題。.二 植物細胞雜交類型（5）細胞質雜交 受體親本的原生質體與供體親本的細胞質雜交，主要改變細胞質遺傳，改良

5、葉綠體和線粒體基因組成。細胞質雜交可以縮短育種時間。（6）細胞核的吸收 受體親本原生質體與供體親本原生質體細胞核融合，只是供體的核基因轉移。.二 植物細胞雜交類型2 原生質體融合類型（1）對稱融合：兩個完整原生質體的融合，在合子中包含兩個親本全套染色體和部分細胞質。（2）非對稱融合：使親本的細胞質或細胞核失活再融合。 A細胞核B細胞質 A完整細胞B細胞質 A完整細胞B細胞質和部分細胞核.2 原生質體融合原生質體融合一 融合方法二 影響原生質體融合的因素三 融合產物的細胞學.原生質體融合.雜交的兩個細胞雜交的兩個細胞用纖維素酶、果膠酶處用纖維素酶、果膠酶處理細胞壁理細胞壁原生質體、原生質體、經離

6、心、振經離心、振動、電刺激動、電刺激用聚二乙醇用聚二乙醇（）（）誘導誘導融合后的原生質體融合后的原生質體再生細胞壁再生細胞壁雜種細胞雜種細胞脫分化脫分化細胞分裂細胞分裂愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株再分化再分化（植物體細胞（植物體細胞融合完成的標融合完成的標志）志）植植物物細細胞胞融融合合植物植物組織組織培養(yǎng)培養(yǎng).一一 融合方法融合方法1自發(fā)融合自發(fā)融合在酶解細胞壁的過程中，有些相鄰的原生質體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個同核體包含240個核。 形成的原因：由不同細胞間胞間連絲的擴展和粘連造成的。 減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細胞受到強烈的質壁分離藥物的作用，

7、切斷胞間連絲。 .一一 融合方法融合方法2.誘發(fā)融合 （1）NaNO3處理 1909年，Kuster在一個發(fā)生了質壁分離的表皮細胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個亞原生質體的融合。 缺點：異核體(heterokaryon)形成頻率不高，對細胞具有毒害作用。.一一 融合方法融合方法（2）多聚化合物法 加入一些多聚化合物如多聚鳥氨酸，改變原生質體表面的物理特性，增強原生質體內吞作用。缺點：可能使細胞膜不可逆破壞。.一一 融合方法融合方法（3）高PH-高濃度鈣離子處理 改變膜的通透性，使細胞融合，可以使種間細胞融合。 缺點：但對于有些原生質體系統(tǒng)，這樣高的pH值是有毒的。.一一 融合方法融合方法（

8、4）PEG誘導v原理：PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成氫鍵，從而在原生質體之間形成分子橋，其結果是使原生質體發(fā)生粘連進而促使原生質體的融合。另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。.一一 融合方法融合方法v特點： 異核體形成的頻率高，可重復性強，對大多數(shù)細胞低毒；形成雙核異核體的頻率高。.一一 融合方法融合方法v注意事項：PEG的分子量: (MW 15006000)分子量大融合效果好，但有毒害作用；分子量小，不易誘導融合。使用濃度15%-45%。一年生植物用低分子量，多年生植物用高分子量。酶溶液濃度。原生質體來

9、源。PEG的稀釋逐步進行。在PEG溶液中，加入鈣離子可以提高融合效率。.一一 融合方法融合方法vPEG融合的技術要點融合劑的配制：A液：氯化鈣，磷酸二氫鉀，甘露醇，PEG；B液：氯化鈣，磷酸二氫鉀，甘露醇融合原生質體的密度與比例：105原生質體/mL，比例1:1原生質體融合方式：將原生質體懸浮液均勻地滴入培養(yǎng)皿底部，然后加入融合劑；在原生質體懸浮液滴中間加入融合液A；在原生質體懸浮液頂部加入融合液B。.完整洋蔥原生質體（完整洋蔥原生質體（4040） 完整煙草原生質體完整煙草原生質體（40）.PEG法原生質體的融合圖示法原生質體的融合圖示圖一煙草葉肉細胞和洋蔥根尖細胞原生質體融合（40） 圖二煙

10、草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質體的異源融合PEG法原生質體的融合圖示法原生質體的融合圖示圖一煙草葉肉細胞和洋蔥根尖細胞原生質體融合（40）.一一 融合方法融合方法（5）電融合v原理：在電場中原生質體排列在一起，在高頻電流作用下，原生質膜發(fā)生可逆擊穿，而導致融合，然后細胞膜恢復完整。v優(yōu)點：對細胞無毒害；融合效率高；操作簡單，利用細胞融合儀。v融合參數(shù)：交流電壓電流強弱，電脈沖大小，處理時間，脈沖寬度，脈沖次數(shù)。.兩個電極間串珠狀原生質體. 細胞電融合儀.二 影響原生質體融合的因素1 原生質體的質量 必須要活力強的原生質體，活力弱在融合過程中導致原生質體死亡。2 融合方法 首先應選擇電融合，其次考慮

11、PEG。3 融合參數(shù) PEG法一般考慮PEG的相對分子質量，純度，濃度處理時間，原生質體的生理狀態(tài)。電融合主要考慮原生質體密度，融合液的成分，電流強度，脈沖次數(shù)和寬幅。.三 融合產物的細胞學v在膜融合以后的數(shù)小時內，2個細胞的細胞質混在一起，形成一個雙核異核體。 在雙親親緣關系較近的異核體中，兩個核有可能同步進行第一次有絲分裂，而且在這個過程中，二者的染色體被一個共同的紡錘體所牽引，在有絲分裂末期形成兩個雜種子細胞。最終分化出體細胞雜種，其核內具有雙親的染色體組。v在雙親親緣關系比較遠的雜種細胞中，兩個來源不同的染色體組常常不能完全結合在一起。.3 雜種細胞的選擇和體細胞雜種的鑒定雜種細胞的選

12、擇和體細胞雜種的鑒定一 原生質體融合產物及雜種細胞發(fā)育二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)三 雜種細胞再生植株的鑒定四 體細胞雜種的遺傳特性.一一 原生質體融合產物及雜種細胞發(fā)育原生質體融合產物及雜種細胞發(fā)育1 原生質體融合產物原生質體融合產物原生質體融合是一個混合體，同核體，異核體，未融合的雙親原生質體。v同核體：細胞質融合，細胞核也融合，形成真正雜種細胞。v異核體：細胞質融合而細胞核未融合，兩個細胞核共同存在一個細胞質中。v 不對稱雜種：異核體中兩個細胞核，若親緣關系較遠，其中一個核中的染色體會被排除掉，形成不對稱雜種。v細胞質雜種：細胞質依舊是雜合的，其中一個細胞核完全消失。.一一 原生質體融合產物及

13、雜種細胞發(fā)育原生質體融合產物及雜種細胞發(fā)育2 雜種細胞的發(fā)育動態(tài) v核質重組核質重組v細胞器重組細胞器重組v部分核物質或細胞器丟失部分核物質或細胞器丟失v核分裂的非同步性核分裂的非同步性.一一 原生質體融合產物及雜種細胞發(fā)育原生質體融合產物及雜種細胞發(fā)育3 體細胞雜種的特點v形態(tài)上的趨中性形態(tài)上的趨中性 v變異幅度大變異幅度大 v非整倍性非整倍性 v雙親性狀的共顯性雙親性狀的共顯性 v偏親現(xiàn)象偏親現(xiàn)象.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)1 互補選擇系統(tǒng) 根據(jù)兩個具有不同生理或遺傳特性的親本，在形成雜種細胞時，能產生互補作用，根據(jù)這一特性只有發(fā)生互補作用的雜種細胞在特定的培養(yǎng)基上才能生長

14、，而淘汰非雜種細胞。（1）激素自養(yǎng)互補選擇 兩個親本都需要外源生長素，融合后由于互補作用，能產生內源激素，可以在無外源激素的培養(yǎng)基中生長，采用無外源生長激素培養(yǎng)基可以篩選出雜種細胞。.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（2）葉綠體缺失互補系統(tǒng) 利用葉綠體缺失突變體與野生互補來選擇雜種細胞。突變體能生長，野生不能生長，雜種細胞能生長。.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（3）營養(yǎng)缺陷型互補選擇 利用營養(yǎng)缺陷型突變體，在有某種營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中不能生長，而雜種細胞起互補作用可以生長。如硝酸還原酶缺陷突變體不能在以硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長，而雜合可以生長。CnX-, nia-

15、.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（4）抗性互補選擇系統(tǒng) 利用兩個抗性有差異的原生質體，每個親本對藥物敏感性分別被對方的抗性所掩蓋。兩個單抗親體融合后會產生雙抗的雜種細胞，利用選擇培養(yǎng)基可以把雜種細胞選擇出來。.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（5）抗光性互補選擇系統(tǒng) 利用兩個突變體，由非等位隱性基因控制，正常光照生長緩慢，葉色淡綠，經過融合，具有兩隱性基因的雜種細胞，經抗光互補，在光照下正常生長。對高光強具有抗性。.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)2 根據(jù)物理特性選擇（可見標志可見標志）（1）根據(jù)可見標志選擇 根據(jù)不同原生質體具有不同顏色，雜種細胞具有不同顏色，

16、或細胞質狀態(tài)不同。如：非綠色原生質體與含有葉綠體的原生質體的融合。（半綠半白）.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（2）根據(jù)熒光標記選擇 將兩種原生質體群體分別用不同的熒光染料標記，然后通過熒光顯微鏡鑒別異核體。（3）應用熒光激活細胞分選儀自動分離雜種細胞。.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)3 組織培養(yǎng)篩選法（1）根據(jù)愈傷組織生長差別選擇 在曼陀羅和煙草種間體細胞雜交以及在小麥和某些其他禾谷類植物屬間體細胞雜交中，發(fā)現(xiàn)雜種愈傷組織表現(xiàn)生長優(yōu)勢現(xiàn)象，因此融合處理后只要挑選生長快、長的最大的愈傷組織，就會從中分化出體細胞雜種.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（2）植株再

17、生能力的差別選擇 不同來源的原生質體分化再生植株的能力不同。 在體細胞雜交中，只要有一個親本的原生質體能夠再生植株，融合產生的雜種細胞就能再生植株。.二二 雜種細胞的選擇系統(tǒng)雜種細胞的選擇系統(tǒng)（3）根據(jù)生長和分化對培養(yǎng)基要求的差別選擇 不同來源的原生質體對培養(yǎng)基成分和激素的要求不同。 設計的培養(yǎng)基只有雜種細胞能夠生長。.三三 雜種細胞的再生植株鑒定雜種細胞的再生植株鑒定1 形態(tài)學鑒定 體細胞雜交具有兩個親本的形態(tài)學性狀，通過葉片大小、顏色、花形、株高等，表面毛狀體特征進行初步鑒定。.三三 雜種細胞的再生植株鑒定雜種細胞的再生植株鑒定2 細胞學鑒定 染色體數(shù)目和形態(tài)具有種的特征，融合體細胞染色體

18、會加倍，有不同染色體形態(tài)特征。.三三 雜種細胞的再生植株鑒定雜種細胞的再生植株鑒定3 生化分析 主要是同工酶分析，雜種細胞的同工酶表現(xiàn)為雙親的酶帶的綜和，或出現(xiàn)雙親特有的譜帶。.三三 雜種細胞的再生植株鑒定雜種細胞的再生植株鑒定4 分子生物學分析 對雜種細胞進行DNA進行分析，用Southern 印記雜交法和分子標記， 另外對雜種細胞的細胞器DNA進行比較分析，比較葉綠體和線粒體中DNA不同。.四四 體細胞雜種的遺傳特性體細胞雜種的遺傳特性1 細胞分裂與染色體丟失v分裂幾次細胞死亡v發(fā)育過程某一親本的細胞核部分或全部丟失v雜種細胞染色體數(shù)目發(fā)生變化，細胞質內含物變化。.四四 體細胞雜種的遺傳特

19、性體細胞雜種的遺傳特性2 基因轉移和性狀表達v由于染色體丟失，會使一方親本的部分或個別基因與另一方親本的染色體發(fā)生整合，實現(xiàn)親本間基因轉移，某些性狀在后代得以表達。v性狀分離相當嚴重.四四 體細胞雜種的遺傳特性體細胞雜種的遺傳特性3 體細胞雜種在遺傳上不穩(wěn)定 雜種細胞在遺傳上不穩(wěn)定。原因：親緣關系的遠近，培養(yǎng)過程中的染色體變異，細胞質和細胞核遺傳物質的重組。.4 細胞質雜種一 細胞質雜種的概念二 細胞質雜種獲得途徑三 細胞質雜種的鑒定.一一 細胞質雜種的概念細胞質雜種的概念1 細胞質雜種：原生質體融合時，一方的原生質體只得到另一方的細胞質形成的雜種細胞。胞質雜種(cybrid): 兩種來源不同

20、的核外遺傳成分（細胞器）與一個特定的核基因組結合在一起。核質雜種(nucleo-cytoplasmic hybrid): 一個親本的細胞核與另一個親本的細胞質基因組結合。.一一 細胞質雜種的概念細胞質雜種的概念2 特點 只有一個親本的核基因，雙親的細胞質，可以實現(xiàn)對雄性不育性狀表達的控制。細胞質雄性不育容易實現(xiàn)不育系、保持系和恢復系的配套，是當前玉米育種中利用的主要類型 .二 獲得細胞質雜種的途徑常先把異種胞質供體物種原生質體的核滅活，然后再將它與異種胞質受體物種的原生質體融合。紫外照射可以使核滅活。1 一個正常的原生質體與一個失去核的原生質體融合。2 一個正常的原生質體與一個核失活的原生質體融合。3 用原生質體與亞原生質體或微原生質體融合。4 在雜種細胞的增殖過程中，一個親本染色體丟失。5 用抑制劑處理得到細胞質雜種。.三三 細胞質雜種的鑒定細胞質雜種的鑒定1 葉綠體，線粒體DNA 的分析2 雄性不育性狀的表現(xiàn)，光合作用變化，與碳代謝有關的酶類，對抗生素抗性的變化。.5 原生質體的遺傳修飾原生質體的遺傳修飾一 細胞核移植二 葉綠體移植三 染色體的攝取四 微生物移植.一一 細胞核移植細胞核移植1 細胞核分離（1）方法：勻漿直接從植物組織中分離細胞核，將組織搗碎進行勻加入去污劑，溶解細胞膜，