酶的分離純化

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上酶的分離純化摘要：本文概述了在實驗中由于酶濃度、飽和度等不同條件下對酶進行分離純化的適用方法。酶的分離純化有很多種方法，在純化的工藝上有很大的不同，不同來源的酶在分離純化中表現(xiàn)出不同的洗脫特性。現(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。關(guān)鍵詞：酶；分離；純化；方法前言：酶的分離純化工作，是酶學研究的基礎(chǔ)。酶的純化過程在目前來說仍是一門實驗科學。一個特定酶的提純往往需要經(jīng)過多個實驗的探索才能總結(jié)出一般經(jīng)驗規(guī)律。酶的分離純化又與其他蛋白質(zhì)的純化過程存在很大的差異，酶的分離純化有其自己獨有的特點：一是特定酶在細胞中的含量少，二是酶通過測定活力的方法可以加

2、以跟蹤，前者給實驗帶來困難，后者為實驗提供了捷徑。正文：1. 酶的分離與純化的概念1 酶的分離與純化是指將酶從細胞或其他含酶材料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，從而獲得符合使用目的、有一定純度和濃度的酶制劑的過程。 酶分離純化的一般原則：防止酶變性失活1）酶純化一般在低溫條件下進行（04） 2.）各種溶液應該用緩沖液，PH應調(diào)到使酶最穩(wěn)定的PH 3.）各種溶液中還可以加入酶保護劑 建立一個可靠和快速的測活方法 方法專一、靈敏、精確、簡便、經(jīng)濟 酶原料的選取 選擇目的酶含量豐富的原料，且要考慮取材方便、經(jīng)濟節(jié)約等因素2. 酶的分離純化2.1 細胞破碎2各種生物組織的細胞具有不同的特點，在采用破碎方法時

3、，要根據(jù)細胞的性質(zhì)，酶的性質(zhì)來選取合適的破碎方法。1.）機械破碎法通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力作用，使細胞破碎的方法，稱為機械破碎法，常用的有如下幾種。搗碎法：利用高速組織搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力，將組織細胞破碎。常用于動物內(nèi)臟、植物葉芽等脆嫩組織細胞破碎，也可用于微生物，尤其是細菌的細胞破碎。此法在實驗寶和生產(chǎn)規(guī)模均可采用。研磨法：用研缽直接研磨。常用于微生物的微生物材料的破碎。勻漿法：利用高壓勻漿泵、玻璃或Teflon加研棒勻漿器高速球磨機將細胞破碎。常用于動植物細胞的破碎。2.）物理破碎通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素作用，使組織細胞破碎的方法，該稱為物理破碎法。溫度差破碎法：

4、通過溫度的突然變化使細胞破碎。即將冷凍的細胞突然放進較高溫度的水中，或?qū)⒃谳^高溫度中的細胞突然冷凍都可使細胞破壞。溫度差破碎法應用在脆弱易破的細胞上效果顯著。壓力差破碎法：通過壓力的突然變化使細胞破碎。常用的有高壓沖擊、突然降壓和滲透壓差法。滲透壓法，滲透破碎是破碎細胞最溫和的方法之一。細胞在低滲溶液中由于滲透壓的作用，溶脹破碎。如紅血球在純水中會發(fā)生破壁溶血現(xiàn)象。但這種方法對具有堅韌的多糖細胞壁的細胞，如植物、細菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細胞外層堅韌的細胞壁。超聲波破碎法：超聲波破碎是利用超聲波振蕩器發(fā)射的超聲波處理細胞懸浮液。一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，液體中局

5、部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性漩渦在細胞上造成了剪切力，使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。超聲處理的主要問題是超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時間應盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理，盡量減小熱效應引起的酶的失活。超聲波破碎適用于很多微生物的破碎。3.)化學破碎通過各種化學試劑對細胞膜的作用，使得細胞膜的結(jié)構(gòu)改變和破壞，從而破碎細胞。常用有機溶劑，如甲苯、丙酮丁醇、氯仿等；表面活性劑：Triton、Tween。4.）酶促破碎通過細胞本身的酶系或外加酶試劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，從而達到破碎細胞。常用方法有自溶法和外加酶制劑法。在外

6、加酶法中常用的溶酶有溶菌酶（Lysozyme）、-1,3-葡聚糖酶（Glucanase）、-1,6葡聚糖酶、蛋白酶（Protease）、甘露糖酶（Mannanase）、糖苷酶（Glycosidase）、肽鍵內(nèi)切酶（Endopeptidase）、殼多糖酶等。5.) 凍融法 生物組織經(jīng)冰凍后，細胞胞液結(jié)成冰晶，使細胞壁脹破。凍融法所需設(shè)備簡單，普通家用冰箱的冷凍室即可進行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡合劑EDTA、還原劑DTT (二硫蘇糖醇) 等以防破壞目的酶。6.) 干燥法通過干燥是細胞壁膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。如氣流干燥、噴霧干燥、真空干

7、燥等等方法。3.2酶的提取3把酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液細胞破碎后，可采用兩種方式進行抽提：普遍抽提和先后用不同溶劑進行選擇性抽提。抽提條件的選擇：一般用稀鹽、稀酸、稀堿的水溶液進行抽提。主要提取方法4：1.）鹽溶液提取大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱之為鹽溶現(xiàn)象，然而酶濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。所以一般采用稀鹽溶液進行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.020.5 mol/L的范圍內(nèi)。例如，用固體發(fā)酵生產(chǎn)的麩曲中的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15 mol/L的氯化鈉溶

8、液或0.020.05 mol/L的磷酸緩沖液提?。唤湍复济摎涿赣?.50.6 mol/L的磷酸氫二鈉溶液提?。?磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1 mol/L的碳酸鈉提?。嚎莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1 mol/L的氯化鎂提取等。有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。如：采用（NH4）2SO4分段鹽析、透析、陰離子交換柱層析52.)酸溶液提取有的酶在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。例如從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12 mol/L的硫酸溶液進行提取。3.）堿溶液提取有的酶在堿溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好，宜用堿溶液提取。例如，細菌L天門冬酰胺酶的提取

9、是將含酶菌體懸浮在pH 1112.5的堿溶液中，振蕩20 min，即達到顯著的提取效果。4.)有機溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機溶劑提取。常用的有機溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇對脂蛋白的解離能力較強，提取效果較好，已成功地用于琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶、膽堿酯酶等的提取。 如：豆殼氧化物酶液經(jīng)硫酸銨-丙酮協(xié)同沉淀，丙酮分級沉淀，最后用硫酸鋅除雜6。3.2酶分離純化的方法的選擇7工作前應對要分離純化的酶的理化性質(zhì)（溶解度、分子大小和解離特性等）以及酶的穩(wěn)定性等有一個較為全面的了解。根據(jù)溶解度大小不

10、同建立的分離方法有：鹽析法、有機溶劑沉淀法、選擇性沉淀法、共沉淀法、PEG沉淀法、等電點沉淀法等。根據(jù)分子大小差異建立的分離方法有：凝膠過濾法、超過濾法、離心法、超離心法、根據(jù)電學、解離特性差異建立的分離方法有：吸附法、離子交換法、電泳法（區(qū)帶、等電聚焦）、聚焦層析、疏水層析、高壓層析（HPLC）等。根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離方法有：選擇性熱變性、選擇性酸堿變性、選擇性表面變性。根據(jù)特殊集團差異建立的分離方法：親和層析。根據(jù)分子所帶電荷正負及多少的差異建立的分離方法：離子交換層析法、電泳分離法、聚集層析法等，如：運用離子層析技術(shù)對酶分離純化；運用電泳等技術(shù)研究理化特性9 。3.3酶的干燥、濃縮和

11、結(jié)晶濃縮：離心、過濾和膜分離、沉淀、層析等都能起到濃縮作用，用各種吸水劑，也能達到濃縮的效果。通常采用真空濃縮。即在一定的真空條件下，使酶液在60以下進行濃縮。干燥：為便于保存、運輸和使用，一般都必須進行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥。結(jié)晶：結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶分離純化的一種手段。不僅為酶的結(jié)構(gòu)、功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高的純度的酶的獲得和和應用創(chuàng)造了條件。酶在結(jié)晶之前，酶液必須經(jīng)過純化達到一定的程度。常用的結(jié)晶方法有：鹽析結(jié)晶、有機溶劑結(jié)晶、透析平衡結(jié)晶、等電點結(jié)晶、氣象擴散法、PH誘導法、溫度誘導法等。

12、3.4酶純度的檢查常用方法：超離心法、凝膠色譜法、SDS-PAGE、離子交換色譜、自由電泳、區(qū)帶電泳、等電聚焦、聚焦色譜等。目前廣泛采用的是電泳，從電泳分析的結(jié)果可判斷試樣中是否存在雜質(zhì)，并選擇有針對性的分離方法對試樣進行進一步的純化處理。3.5酶純化步驟的定量評價一、酶活力(Enzyme activity) 酶活力是指酶催化反應的能力，它表示樣品中酶的含量1961 年國際酶學會規(guī)定l min催化lmol 分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個活力單位(國際單位)，溫度為25，其它條件(pH、離子強度)采用最適條件。二、比活力比活力是在一定條件下樣品中每毫克蛋白質(zhì)（包括非目的酶蛋白、非酶蛋白、變性酶蛋

13、白和目的酶蛋白）所含酶的活力單位數(shù)。U/mg蛋白質(zhì) 或 U/mg氮。3.5影響酶分離純化的因素在顯微鏡下，可觀察到凝膠過濾層析介質(zhì)具有海綿狀結(jié)構(gòu)。將凝膠裝于層析柱中，加入混合液，內(nèi)含不同分子量的物質(zhì)12，小分子溶質(zhì)能在凝膠海綿狀網(wǎng)格內(nèi)，即凝膠內(nèi)部空間全都能為小分子溶質(zhì)所達到，凝膠內(nèi)外小分子溶質(zhì)濃度一致。在向下移動的過程中，它從一個凝膠顆粒內(nèi)部擴散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒，如此不斷地進人與流出，使流程增長，移動速率慢故最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分送入凝膠顆粒，從而在大分子與小分子物質(zhì)之間被洗脫。大分子溶質(zhì)不能透人凝膠內(nèi)，而只能沿著凝膠顆粒間隙流運動，因

14、此流程短，下移速度較小分子溶質(zhì)快而首先流出層析柱。因而樣品通過定距離的層析柱后，不同大小的分子將按先后順序依次流出，彼此分開。圖 凝膠過濾層析的原理小分子由于擴散作用進入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過。 (1)蛋白質(zhì)混合物上柱 (2) 洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)大分子被排阻在顆粒外(3) 小分子被截留，大分子向下移動，大小分子分開 (4) 大小分子完全分開 (5) 大分子行程較短，已洗脫出層析柱,小分子尚在行進中4酶的分離純化新技術(shù)在生產(chǎn)中的應用 4.1三種方法 （1）組織提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶 （2）微生物發(fā)酵：最大量的來源 （3）化學及生物合成：生物重

15、組 4.2高新技術(shù)的應用： (1)酶的修飾 (2)固定化 (3)基因重組 (4)膜分離技術(shù) (5)冷凍干燥(6)微膠囊總結(jié)：21世紀，生物科學與生物工程的發(fā)展將進一步揭示生命的奧秘在世界科技和經(jīng)濟發(fā)展中起主導和支柱作用。作為生物工程重要組成部分的酶工程亦將飛速發(fā)展，前景廣闊。酶制劑的品種、規(guī)模不斷擴大，目前30多家600多個品種，應用于18個工業(yè)領(lǐng)域。酶的應用領(lǐng)域也不斷在擴大，美國酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學工業(yè)。酶制劑的生產(chǎn)不僅看數(shù)量，更要看質(zhì)量。酶是否可用關(guān)鍵在于酶的分離純化，因此我們應該好好掌握酶的分離純化的要領(lǐng)。參考文獻：1 郭勇.酶工程.第2版.北京：科學出版社，2004.2