河南省驢寄生圓線蟲的研究----相關(guān)知識

1、系統(tǒng)發(fā)生樹（英文：Phylogenetic tree）又稱為演化樹（evolutionary tree），是表明被認(rèn)為具有共同祖先的各物種間演化關(guān)系的樹。是一種親緣分支分類方法（cladogram）。在樹中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表其各分支的最近共同祖先，而節(jié)點(diǎn)間的線段長度對應(yīng)演化距離（如估計(jì)的演化時(shí)間）。分子診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷是預(yù)測診斷的主要方法，既可以進(jìn)行個(gè)體遺傳病的診斷，也可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。分子診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。 1.核酸分子雜交技

2、術(shù) 具有一定互補(bǔ)序列和核昔酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對特定DNA或RNA序列進(jìn)行定性或定量檢測。 2.聚合酶鏈反應(yīng)(即lymerase chain reaction，PCR) 原理：PCR是模板DNA,引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需目的DNA。包括三個(gè)基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈(變性)；在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(退火)；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。 3.生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的分子生

3、物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸分析檢測技術(shù)。最初的生物芯片技術(shù)主要目標(biāo)是用于DNA序列測定、基因表達(dá)譜鑒定和基因突變體檢測和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術(shù)。由于目前這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片、免疫芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術(shù)更符合發(fā)展趨勢。PCR原理 DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，

4、加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。 發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶-Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大 量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一

5、定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。限制性片段長度多態(tài)性（

6、RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技術(shù)于1980年由人類遺傳學(xué)家Bostein提出。它是第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)。DonisKeller利用此技術(shù)于1987年構(gòu)建成第一張人的遺傳圖譜。DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致

7、酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個(gè)探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點(diǎn)，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，對于不同種群的生物個(gè)體而言，他們的DNA序列存在差別。如果這種差別剛好發(fā)生在內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，并使內(nèi)切酶識別序列變成了不能識別序列或是這種差別使本來不是內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的DNA序列變成了內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。這樣就

8、導(dǎo)致了用限制性內(nèi)切酶酶切該DNA序列時(shí)，就會少一個(gè)或多一個(gè)酶切位點(diǎn)，結(jié)果產(chǎn)生少一個(gè)或多一個(gè)的酶切片段。這樣就形成了用同一種限制性內(nèi)切酶切割不同物種DNA序列時(shí)，產(chǎn)生不同長度大小、不同數(shù)量的限制性酶切片段。后將這些片段電泳、轉(zhuǎn)膜、變性，與標(biāo)記過的探針進(jìn)行雜交，洗膜，即可分析其多態(tài)性結(jié)果。PCR-RFLP: 是在 PCR 和 DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的 RFLP 技術(shù)。該方法是通過 PCR 擴(kuò)增一段 DNA 片段，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)電泳，可得到有特異性的電泳譜帶，從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的。 Tris中文品名: 三羥甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 緩血酸胺 英文

9、品名: Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane 英文別名: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol THAM; Tris base; Trometamol 通用CAS : 77-86-1 產(chǎn)品純度: 100%(USP藥典級) / 99.9%(實(shí)驗(yàn)室技術(shù)級) 產(chǎn)品級別: USP藥典級,符合USP/EP/cGMP對藥物賦形劑的要求 分 子 式: NH2C(CH2OH)3 分 子 量: 121.14 使用用途: 生物制藥,體外診斷,個(gè)人護(hù)理及化妝品原料等 保存溫度: 常溫密封避光保存 TRIS是一種最常用的生物緩沖液，常

10、配成PH值為6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值隨溫度變化很大。一般來說，溫度每升高一度，PH值下降0.03。 1M TRIS-HCl 6.8和1.5M TRIS-HCl 8.8是SDS-PAGE最常用的試劑。 而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA電泳最常用的試劑，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。TE為 Tris加EDTA合稱。 緩沖特性：Tris為弱堿，在室溫（25）下，它的pKa為8.1；根據(jù)緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH7.0到9.2之間。Tris堿的水溶液pH在10.5左右，一般加入鹽酸以調(diào)節(jié)pH值至所需值，即可獲得該pH值的緩沖液。但同時(shí)應(yīng)注意溫度對于Tris的pKa的影響。由于Tris緩沖液為弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會被去質(zhì)子化，從而提高其溶解性。人們常常在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA制成“TE緩沖液”，TE緩沖液被用于DNA的穩(wěn)定和儲存。如果將調(diào)節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，則獲得“TAE緩沖液”（Tris/Acetate/EDTA），而換成硼酸則獲得“TBE緩沖液”（Tris/Borate/EDTA）。這兩種緩沖液通常用于核酸電泳實(shí)驗(yàn)中。 制備：Tris可以由兩步反應(yīng)生成：先由硝基甲烷生成中間體三羥甲基硝基甲烷（(HOCH2)3CNO2），然后再由該中間體還原得到Tris。 用途：Tris緩