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1、鹿茸多肽對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 作者:王旭凱 王英 楊有庚 冷向陽(yáng)【摘要】 目的探討鹿茸多肽對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法體外進(jìn)行胎鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)傳代,細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT比色法檢測(cè)不同濃度淀粉樣蛋白作用24 h后細(xì)胞活力變化;檢測(cè)25molL 淀粉樣蛋白作用24 h后,細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)和觀察細(xì)胞caspase3表達(dá)情況。結(jié)果不同濃度的淀粉樣蛋白作用24 h后對(duì)細(xì)胞活力均明顯下降,并呈劑量依賴(lài)性(P0.05);鹿茸多肽可明顯抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(P0.05),且可使caspase3的表達(dá)量下降。結(jié)論鹿茸多肽通過(guò)
2、抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞caspase3表達(dá)增高而對(duì)其細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)為探索新的脊髓神經(jīng)損傷的藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 鹿茸多肽 脊髓神經(jīng)細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 淀粉樣蛋白 casepase3脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是外科常見(jiàn)的創(chuàng)傷,其年發(fā)病率逐年升高。在脊髓損傷中,除了原發(fā)的物理打擊因素造成神經(jīng)細(xì)胞損傷外,已發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)及臨近部位的神經(jīng)細(xì)胞存在遲發(fā)性的死亡現(xiàn)象,這種死亡與常見(jiàn)的壞死不同1,表現(xiàn)為一種程序性死亡(細(xì)胞凋亡),細(xì)胞凋亡可能參與了脊髓損傷的病理生理過(guò)程。caspase3是凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶,降低其的表達(dá)有助于脊髓損傷的修
3、復(fù)和再生2。鹿茸系鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角3。關(guān)于鹿茸多肽混合物,近兩年,有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明鹿茸多肽對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用4,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鹿茸多肽作用于淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,以進(jìn)一步闡述其對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)理。1 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 15d孕鼠購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自invitrogen公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板購(gòu)自Castar公司;神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)購(gòu)自Sigma公司;鹿茸多肽由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)惠贈(zèng);淀粉樣蛋白(A25-35)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自
4、(Sigma公司);兔多克隆caspase3抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.3 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS14.0分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示,兩兩比較采用t檢驗(yàn),P0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1 2 結(jié)果2.1 脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 單細(xì)胞懸液接種后第2d,細(xì)胞聚集成團(tuán)狀,第3d出現(xiàn)大量懸浮的neurosphere(約3060個(gè)細(xì)胞),而且neurosphere越來(lái)越多。到第7d細(xì)胞胞體十分飽滿(mǎn),輪廓清晰,有的細(xì)胞可見(jiàn)明顯的鳥(niǎo)眼狀細(xì)胞核,也有的細(xì)胞伸出樹(shù)枝狀突起,突起相互連成。用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)標(biāo)記神經(jīng)元。鏡下觀察,可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞體
5、飽滿(mǎn),突起明顯并連成網(wǎng)狀。見(jiàn)圖1。圖1 烯醇化酶(NSE)標(biāo)記神經(jīng)元(略)2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的A25-35(0、5、10、20、25、30molL)作用24h后,均可引起細(xì)胞活力下降,并呈一定的劑量依賴(lài)性(P0.05)。本實(shí)驗(yàn)選擇A25-35 25mol /ml劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖2。圖2 MTT法檢測(cè)A25-35細(xì)胞活力的影響(略)表1 鹿茸多肽對(duì)A誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用(略)圖3 鹿茸多肽對(duì)A誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用(略)2.4 免疫組化檢測(cè)caspase3結(jié)果 caspase3陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)著棕色。結(jié)果顯示:對(duì)照組無(wú)caspase3陽(yáng)性染
6、色的細(xì)胞;A(25molL)+鹿茸多肽(400mg/ml)組caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,比單純A(25molL)組少,其作用與NGF陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)差異,鹿茸多肽對(duì)脊髓細(xì)胞凋亡具有抑制作用。見(jiàn)圖4。a 對(duì)照組b A組(25molL)c A(25molL)+鹿茸多肽(400mg/ml)d A(25molL)+NGF(20ng/ml)圖4 鹿茸多肽對(duì)A(25M)誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞caspase3的表達(dá)的影響(略)3 討論 脊髓損傷的是神經(jīng)領(lǐng)域內(nèi)一道尚未解決的難題,雖然人們采取了許多種方法促進(jìn)損傷后的脊髓軸突再生修復(fù),但存在許多限制因素,很難達(dá)到理想效果,許多學(xué)者進(jìn)行了深入研究脊髓神經(jīng)組織損傷后
7、再生不良,其重要原因是傷后繼發(fā)性損害不斷加重所致,而細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵,抑制細(xì)胞凋亡是阻止或減少繼發(fā)性損傷,保護(hù)神經(jīng)功能的治療所在。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因包括:Caspases(半胱氨酸蛋白酶基因家族)、bcl2(B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因家族2)、p53等。Caspases家族對(duì)細(xì)胞,特別是神經(jīng)元凋亡程序的啟動(dòng)具有核心作用。它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征性改變密切相關(guān)的蛋白,又稱(chēng)為死亡蛋白酶。迄今已發(fā)現(xiàn)14個(gè)家族成員,其中caspase3是凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶,是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路5。因此抑制caspase3的表達(dá)是成為探索的治療途徑
8、之一。淀粉樣蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)通過(guò)一定降解途徑產(chǎn)生的6,其主要的活性片段為A25-35,A25-35可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,本實(shí)驗(yàn)利用輻射誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡,觀察鹿茸多肽對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡后caspase3表達(dá)的影響。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:應(yīng)用A25-35誘導(dǎo)胎鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡后,在細(xì)胞中加400mg/ml鹿茸多肽后,通過(guò)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)目和免疫組化觀察caspase3表達(dá)量下降,提示,鹿茸多肽具有抑制A25-35誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用,其作用是通過(guò)調(diào)控凋亡基因的表達(dá),即caspase3表達(dá)下調(diào)而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,鹿茸多肽主要是通過(guò)有效地降低死亡蛋
9、白酶caspase3的表達(dá)量,進(jìn)而抑制脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡起到保護(hù)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的作用。【】 1 Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injuryJ.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911920.2 Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injuryJ. Nature Medicine,1999, 5(8): 943946.3 王本祥,周秋麗.鹿茸的化學(xué)、藥理及臨床研究進(jìn)展J. 藥學(xué)學(xué)報(bào),1991, 26(9) : 714720.4 冷向陽(yáng).鹿茸多肽對(duì)輻射誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用J.實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(3):319321.5 Daigle I, Simon HU.Critical role for caspases3 and8 in neutrophil but not eosino
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