鹿茸多肽對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

1、鹿茸多肽對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 作者：王旭凱 王英 楊有庚 冷向陽【摘要】 目的探討鹿茸多肽對(duì)淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法體外進(jìn)行胎鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)傳代，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT比色法檢測(cè)不同濃度淀粉樣蛋白作用24 h后細(xì)胞活力變化；檢測(cè)25molL 淀粉樣蛋白作用24 h后，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)和觀察細(xì)胞caspase3表達(dá)情況。結(jié)果不同濃度的淀粉樣蛋白作用24 h后對(duì)細(xì)胞活力均明顯下降，并呈劑量依賴性(P0.05)；鹿茸多肽可明顯抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(P0.05)，且可使caspase3的表達(dá)量下降。結(jié)論鹿茸多肽通過

2、抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞caspase3表達(dá)增高而對(duì)其細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)為探索新的脊髓神經(jīng)損傷的藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 鹿茸多肽 脊髓神經(jīng)細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 淀粉樣蛋白 casepase3脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是外科常見的創(chuàng)傷，其年發(fā)病率逐年升高。在脊髓損傷中，除了原發(fā)的物理打擊因素造成神經(jīng)細(xì)胞損傷外，已發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)及臨近部位的神經(jīng)細(xì)胞存在遲發(fā)性的死亡現(xiàn)象，這種死亡與常見的壞死不同1，表現(xiàn)為一種程序性死亡（細(xì)胞凋亡），細(xì)胞凋亡可能參與了脊髓損傷的病理生理過程。caspase3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，降低其的表達(dá)有助于脊髓損傷的修

3、復(fù)和再生2。鹿茸系鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角3。關(guān)于鹿茸多肽混合物，近兩年，有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證明鹿茸多肽對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用4，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鹿茸多肽作用于淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，以進(jìn)一步闡述其對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)理。1 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 15d孕鼠購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板購(gòu)自Castar公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）購(gòu)自Sigma公司；鹿茸多肽由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)惠贈(zèng)；淀粉樣蛋白(A25-35)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自

4、(Sigma公司)；兔多克隆caspase3抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.3 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS14.0分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1 2 結(jié)果2.1 脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 單細(xì)胞懸液接種后第2d，細(xì)胞聚集成團(tuán)狀，第3d出現(xiàn)大量懸浮的neurosphere(約3060個(gè)細(xì)胞)，而且neurosphere越來越多。到第7d細(xì)胞胞體十分飽滿，輪廓清晰，有的細(xì)胞可見明顯的鳥眼狀細(xì)胞核，也有的細(xì)胞伸出樹枝狀突起，突起相互連成。用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)標(biāo)記神經(jīng)元。鏡下觀察，可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞體

5、飽滿，突起明顯并連成網(wǎng)狀。見圖1。圖1 烯醇化酶(NSE)標(biāo)記神經(jīng)元（略）2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的A25-35（0、5、10、20、25、30molL)作用24h后，均可引起細(xì)胞活力下降，并呈一定的劑量依賴性(P0.05)。本實(shí)驗(yàn)選擇A25-35 25mol /ml劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。圖2 MTT法檢測(cè)A25-35細(xì)胞活力的影響（略）表1 鹿茸多肽對(duì)A誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用（略）圖3 鹿茸多肽對(duì)A誘導(dǎo)脊髓細(xì)胞凋亡的抑制作用（略）2.4 免疫組化檢測(cè)caspase3結(jié)果 caspase3陽性細(xì)胞胞質(zhì)著棕色。結(jié)果顯示：對(duì)照組無caspase3陽性染

6、色的細(xì)胞；A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）組caspase3陽性細(xì)胞數(shù)減少，比單純A（25molL）組少，其作用與NGF陽性對(duì)照組比較無差異，鹿茸多肽對(duì)脊髓細(xì)胞凋亡具有抑制作用。見圖4。a 對(duì)照組b A組（25molL）c A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）d A（25molL）+NGF（20ng/ml）圖4 鹿茸多肽對(duì)A（25M）誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞caspase3的表達(dá)的影響（略）3 討論 脊髓損傷的是神經(jīng)領(lǐng)域內(nèi)一道尚未解決的難題，雖然人們采取了許多種方法促進(jìn)損傷后的脊髓軸突再生修復(fù)，但存在許多限制因素，很難達(dá)到理想效果，許多學(xué)者進(jìn)行了深入研究脊髓神經(jīng)組織損傷后

7、再生不良，其重要原因是傷后繼發(fā)性損害不斷加重所致，而細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵，抑制細(xì)胞凋亡是阻止或減少繼發(fā)性損傷，保護(hù)神經(jīng)功能的治療所在。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因包括：Caspases（半胱氨酸蛋白酶基因家族）、bcl2（B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因家族2）、p53等。Caspases家族對(duì)細(xì)胞，特別是神經(jīng)元凋亡程序的啟動(dòng)具有核心作用。它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征性改變密切相關(guān)的蛋白，又稱為死亡蛋白酶。迄今已發(fā)現(xiàn)14個(gè)家族成員，其中caspase3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路5。因此抑制caspase3的表達(dá)是成為探索的治療途徑

8、之一。淀粉樣蛋白是淀粉樣前體蛋白(APP)通過一定降解途徑產(chǎn)生的6，其主要的活性片段為A25-35，A25-35可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)利用輻射誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡，觀察鹿茸多肽對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡后caspase3表達(dá)的影響。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：應(yīng)用A25-35誘導(dǎo)胎鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡后，在細(xì)胞中加400mg/ml鹿茸多肽后，通過MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)目和免疫組化觀察caspase3表達(dá)量下降，提示，鹿茸多肽具有抑制A25-35誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，其作用是通過調(diào)控凋亡基因的表達(dá)，即caspase3表達(dá)下調(diào)而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)說明，鹿茸多肽主要是通過有效地降低死亡蛋

9、白酶caspase3的表達(dá)量，進(jìn)而抑制脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡起到保護(hù)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的作用?！尽?1 Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injuryJ.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911920.2 Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injuryJ. Nature Medicine,1999, 5（8): 943946.3 王本祥,周秋麗.鹿茸的化學(xué)、藥理及臨床研究進(jìn)展J. 藥學(xué)學(xué)報(bào),1991, 26(9) : 714720.4 冷向陽.鹿茸多肽對(duì)輻射誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用J.實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(3):319321.5 Daigle I, Simon HU.Critical role for caspases3 and8 in neutrophil but not eosino