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1、胸腺肽類(lèi)藥物對(duì)體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為T(mén)細(xì)胞的作用 08-11-04 13:38:00 編輯:studa20 作者:彭延文, 徐霖, 張秀明, 張嘉晴, 李樹(shù)濃, 項(xiàng)鵬【摘要】 【目的】 研究目前臨床常用的增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的胸腺肽,胸腺5肽和胸腺素-1在小鼠胚胎干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞分化過(guò)程中的作用?!痉椒ā?借助小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)體外自然分化形成的類(lèi)胚體(EB)中含有三胚層細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞環(huán)境,加入多種細(xì)胞因子和胸腺多肽,體外誘導(dǎo)小鼠ESC向T淋巴細(xì)胞分化。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)在三種不同胸腺多肽的誘導(dǎo)下,不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠ESC來(lái)源的細(xì)胞表面CD3分子的表達(dá)水平。并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)
2、與T淋巴細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)的Notch信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄水平。【結(jié)果】 在加入胸腺肽和胸腺素1誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組,均有細(xì)胞表達(dá)CD3分子,CD3+細(xì)胞的百分比隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增多;而加入胸腺五肽的實(shí)驗(yàn)組無(wú)CD3+細(xì)胞出現(xiàn)。 加入胸腺素1和胸腺肽的實(shí)驗(yàn)組,有Notch1及其配體delta-like-1和delta-like-4的轉(zhuǎn)錄;而加入胸腺五肽的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞無(wú)Notch1及其配體轉(zhuǎn)錄?!窘Y(jié)論】 胸腺素1或胸腺肽可能通過(guò)影響Notch1信號(hào)途徑支持ES細(xì)胞向T細(xì)胞分化,而胸腺五肽無(wú)此作用。 【關(guān)鍵詞】 胚胎干細(xì)胞; T淋巴細(xì)胞; 胸腺5肽; 胸腺素1; 胸腺肽 Abstract:【Objective】
3、To compare the effects of three thymic polypeptides including thymopentin-5 (TP5), thymosin-alpha1 (T-1) and thymopeptides on the thymopoiesis of mouse embryonic stem (ES) cells in vitro. 【Method】 EBs were obtained from spontaneously differentiated ES cells and were induced into T lymphocytes in vit
4、ro by utilizing three different inducing media, which contain TP5, T-1, and thymopeptides, respectively. Then the expression of CD3 on these differentiated cells were analyzed by flow cytometry at different time points. At the corresponding time-point, the transcription levels of Notch signal molecu
5、les were also detected by RT-PCR. 【Results】 The results showed that inducing systems containing either T-1 or thymopeptides promoted the emergence of CD3+ cells during the observation period, and the percentage of CD3+ cells increased with a longer induction period. However, we never found CD3+ cell
6、s in the inducing system containing TP5 throughout the inducing period. And Notch 1 receptor and its ligands, involving Delta-like-1 and Delta-like-4, expressed in inducing systems containing either T-1 or thymopeptides. However, neither Notch1 nor its ligands were detected in the inducing system co
7、ntaining TP-5 during the observation period. 【Conclusion】 T-1 and thymopeptides may play a role in promoting T cells differentiation from ES cells by Notch1 signal pathway, while TP-5 may not. Key words: embryonic stem (ES) cells; T cells; thymopentin-5 (TP5); thymosin -1 (T1); thymopeptides 參與特異性免疫
8、應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓多能造血干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)一系列高度重組和復(fù)雜的過(guò)程分化成為成熟細(xì)胞。這一過(guò)程除了需要胸腺基質(zhì)細(xì)胞的輔助外,包括多種胸腺多肽分子和細(xì)胞因子在內(nèi)的胸腺體液微環(huán)境也發(fā)揮至關(guān)重要的作用1。胸腺基質(zhì)細(xì)胞和胸腺多肽都通過(guò)影響多種信號(hào)途發(fā)揮作用,近年來(lái)的研究結(jié)果顯示,其中最重要的是Notch信號(hào)途徑。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)又稱(chēng)多能干細(xì)胞,是由受孕35 d的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)所得的一種高度未分化細(xì)胞,在適宜的條件下,可誘導(dǎo)分化為多種成體細(xì)胞。因此,可以通過(guò)ES細(xì)胞建立體外分化模型,研究不同基因或細(xì)胞因子對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞或組織分化的作用2,
9、3。本課題借助ES細(xì)胞自然分化形成的EB中含有三胚層細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞環(huán)境,研究胸腺肽(thymopeptides)、胸腺素1 (thymosin-1, T-1)和胸腺五肽(thymopentin-5, TP5)三種胸腺多肽對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的作用。同時(shí)通過(guò)提取不同誘導(dǎo)時(shí)期的RNA,利用特異性引物及RT-PCR技術(shù),結(jié)合細(xì)胞的表型特點(diǎn),分析這三種胸腺多肽是否通過(guò)Notch信號(hào)途徑影響ES細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞分化。 1 材料與方法 1.1 材 料 1.2 培養(yǎng)液的配制 ES培養(yǎng)液:在10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)液著中加入LIF,使其終濃度為1 U/L LIF。EB培養(yǎng)液:為含15%胎牛血清的高糖DME
10、M培養(yǎng)液。 1.3 制備合適的類(lèi)胚體 取生長(zhǎng)狀態(tài)好的ES細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞,用EB培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)入60 mm Petri dish中培養(yǎng)。 1.4 誘導(dǎo)細(xì)胞分化 待EB生長(zhǎng)57 d后,轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)分化液中繼續(xù)培養(yǎng),體外誘導(dǎo)EB內(nèi)細(xì)胞向T細(xì)胞分化。首先參照常規(guī)ES誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞的方法設(shè)立對(duì)照組,將篩選后的EB轉(zhuǎn)入含SCF,IL-3,IL-7和Flt-3L的EB培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組:第1組在常規(guī)加入SCF,IL-3,IL-7和Flt-3L的基礎(chǔ)上,添加了胸腺5肽 50 g;第2組在加入常規(guī)細(xì)胞因子的基礎(chǔ)上添加胸腺素1 10 g;第3組在加入常規(guī)細(xì)胞因子的基礎(chǔ)上添加胸腺肽 50 g。在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的過(guò)程中,常規(guī)換液,去除死細(xì)胞等影響EB生長(zhǎng)的不利因素,定期在顯微鏡下觀察EB的狀態(tài)。 1.5 誘導(dǎo)細(xì)胞的表型檢測(cè) 分別在誘導(dǎo)分化后第8、15、22天收集誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中的EB,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,加入適量胰酶消化成單細(xì)胞,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞,并用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞。加入大鼠抗小鼠CD32/16單克隆抗體,以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再分別加入1 g大鼠抗小鼠CD3e-Cy5熒光標(biāo)記抗體,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EB中表達(dá)T細(xì)胞表型的細(xì)胞。 1.6 RNA抽提 分別收集誘導(dǎo)分化后第8、15、22天的胚體,常規(guī)抽提RNA。將抽提RNA,并用DNA酶
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