腸道病毒71型的診斷方法及疫苗研究述評(píng).docx

1、第27卷第5期2012年10月文章編號(hào)：2095-476X(2012)05-0013-05鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)JOURNALOFZHENGZHOUUNIVERSITYOFLIGHTINDUSTRYNaturalScienceEdition)腸道病毒71型的診斷方法及疫苗研究述評(píng)董彩文張勝楠I,王云龍2。李玉林3,孫新城二王國(guó)強(qiáng)李恒思3(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，河南鄭州450121；河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001)摘要：對(duì)腸道病毒71型的診斷方法及疫苗研究進(jìn)行了綜述.EV71的診斷有病毒分離培養(yǎng)、

2、中和抗體滴度檢測(cè)、核酸檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè);EV71的疫苗研究主要為國(guó)內(nèi)流行的C4型毒株，經(jīng)過(guò)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)研發(fā)減毒活疫苗、病毒樣顆粒疫苗和針對(duì)VP1位點(diǎn)的重組疫苗.采用兩種或兩種以上診斷方法聯(lián)合使用為EV71的快速診斷提供一種有效方法；而建立合適的動(dòng)物模型，篩選免疫原性和交叉保護(hù)水平高的毒種，以及不同類型疫苗免疫原性比較是疫苗研究的方向.關(guān)鍵詞：腸道病毒71型；免疫學(xué)檢測(cè)；疫苗中圖分類號(hào):Q819；R392文獻(xiàn)標(biāo)志碼：AD01：10.3969/j.issn.2095-476X.2012.05.003Reviewofdiagnosismethodsandvaccineresearchofentero

3、virus71DONGCai-wen1,ZHANGSheng-nan1,WANGYun-long23,LIYu-lin3,SUNXin-cheng1,WANGGuo-qiang3,LIHeng-si3(1.CollegeofFoodandBioeng.,ZhengzhouUniv,ofLightInd.yZhengzhou450002,China；Dept,ofBioeng.ZhengzhouTechnicalCollege,Zhengzhou4501219China；2. He"nanBiotech.ResearchCenter,Zhengzhou4500019China)Abst

4、ract:Thediagnosismethodandvaccineresearchweresummarized.Thereareseveraldiagnosismeth-.odsforenterovirus71(EV71),suchasseparationandcultureofvirus,titertestofneutralizingantibody,nucleicaciddetectionandimmunologicalassay.ThemainresearchcontentsofEV71vaccineareattenuatedlivevaccinebasedontheC4strainan

5、devaluatedthroughanimalmodel,viruslikeparticlevaccineandrecombinantvaccineaimedatVP1site.ItisprovidedoneeffectivemethodforrapiddiagnosisofEV71combineduseoftwoormorediagnosisassay.Thefoundationofsuitableanimalmodel,thescreeningofvirusstrainwithhighimmunogenicityandcrossprotection,andthecomparisonofim

6、munogenicityfordifferentvaccinearethedirectionofvirusresearch.Keywords:enterovirus71；immunologicaldetection；vaccine收稿日期：2011-12-15基金項(xiàng)目：河南省科技創(chuàng)新杰出青年項(xiàng)目(114100510024)作者簡(jiǎn)介：董彩文(1970),男，湖北省武穴市人，鄭州輕工業(yè)學(xué)院副教授，博士，主要研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)和食品安全檢測(cè).0引言腸道病毒71型EV71（enterovirus71）是一種嗜神經(jīng)腸道病毒，由EV71引起的手足口病在亞洲頻繁暴發(fā)，造成很高的發(fā)病率和死亡率.為了能對(duì)EV7

7、1引起的手足口病做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，尋找快速診斷方法、開發(fā)有效的抗病毒藥物及安全的預(yù)防疫苗已經(jīng)成為科技工作者研究的重點(diǎn).EV71VP1基因編碼蛋白分布有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，具有較多的生物功能位點(diǎn)和潛在的抗原表位區(qū)域，是免疫診斷、藥物作用研究及疫苗研制的靶抗原，可為EV71診斷、治療及預(yù)防方面的應(yīng)用提供重要的參考依據(jù).本文將就EV71引起的手足口病的免疫學(xué)診斷方法、疫苗的開發(fā)進(jìn)行綜述.I EV71診斷方法的研究進(jìn)展由于腸道病毒屬成員數(shù)量多，且具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，因此臨床診斷困難.柯薩奇病毒A16的爆發(fā)往往伴隨著EV71的流行，而兩者的主要癥狀均表現(xiàn)為手足口病，在臨床上非常難以區(qū)分;另外,EV

8、71還可引起與脊髓灰質(zhì)炎病毒同樣的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，因此EV71是腸道病毒中最難鑒定的病毒之一.目前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道中，關(guān)于EV71的診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、中和抗體滴度檢測(cè)、核酸檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)等2-6】.II EV71的分離培養(yǎng)病毒分離培養(yǎng)是EV71病毒常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，也是EV71病毒鑒定的金標(biāo)準(zhǔn).主要用人上皮癌細(xì)胞（Hep-2）、綠猴腎細(xì)胞（Ver。）和人橫紋肌癌細(xì)胞（RD）等細(xì)胞系擴(kuò)增從患者皰液、咽拭子或糞便標(biāo)本中分離病毒.目前已成功從患者糞便、腦脊液、血液、咽拭子及皰疹液中分離到EV71病毒.12 EV71中和抗體滴度檢測(cè)比較患者恢復(fù)期血清與急性期血清中和抗體滴度，可用作腸

9、道病毒感染的血清學(xué)診斷方法.最常用的是微量板法測(cè)定抗體滴度，作為腸道病毒感染的診斷方法之一，此法是目前最常用的人腸道病毒抗體檢測(cè)方法，具有精確旦特異性好等特點(diǎn).當(dāng)急性期血清與恢復(fù)期血清中抗體滴度為4倍或4倍以上，則證明病毒感染.張軍等3在2009年建立了新型EV71中和實(shí)驗(yàn)方法，前期的實(shí)驗(yàn)操作與傳統(tǒng)方法一致，不同的是在病毒感染細(xì)胞后14h即可檢測(cè).與傳統(tǒng)TCID50方法相比,新畫的EV71中和實(shí)驗(yàn)方法的操作周期較短,只需要30h即可完成對(duì)EV71和抗體的檢測(cè),同時(shí)采用Elispot自動(dòng)掃描檢測(cè)，可避免人工操作帶來(lái)的視覺差，更能夠滿足快速高通量篩選的要求.13 EV71的核酸檢測(cè)1.3.1逆轉(zhuǎn)錄

10、RT-PCR技術(shù)目前，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)已經(jīng)成為腸道病毒感染快速診斷的重要手段，李國(guó)蘭等用RT巢式PCR快速檢測(cè)EV71病毒核酸:腸道病毒通用引物檢測(cè)陽(yáng)性率為72.6%,EV71特異性引物檢測(cè)陽(yáng)性率為58.9%.腸道通用引物在45例重癥患兒和50例輕癥患兒的病毒陽(yáng)性檢出率分別為68.9%和76.0%,P>0.05,并無(wú)顯著性差異.EV71特異性引物在45例重癥患兒和50例輕癥患兒的病毒陽(yáng)性檢出率分別為57.8%和60.0%,F>0.05,并無(wú)顯著性差異.95例患兒CA16引物檢測(cè)結(jié)果均為陰性.1.3.2實(shí)時(shí)熒光定*PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中引入

11、特定的熒光標(biāo)記基團(tuán)，通過(guò)對(duì)積累的熒光信號(hào)的收集來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最后通過(guò)繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中待檢模板含量進(jìn)行定量分析.陳應(yīng)堅(jiān)等在對(duì)16例已收集到的患者的糞便、皰疹液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)到8份陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為50.0%,而用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)到5份陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為31.3%.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng),靈敏度高的特點(diǎn)，且能在采樣后數(shù)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到病毒的RNA,從而達(dá)到快速診斷的目的.1.3.3基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是借助一定的方法（壓電打印法、原位合成法、分子印章法等）,將設(shè)計(jì)的DNA片段固化到一定載體（硅片、醛基化的玻片、表面氨基化等

12、）表面,在特定條件下與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備收集信號(hào)，并用生物信息學(xué)軟件對(duì)其分析,從而獲得樣品的遺傳信息.目前國(guó)外已有公司研發(fā)出腸道病毒鑒定芯片（EVtypingchip），可快速檢測(cè)出腸道病毒的型別.國(guó)內(nèi)目前未見使用基因芯片對(duì)腸道病毒進(jìn)行檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道.14 EV71的免疫學(xué)檢測(cè)EV71的確診是在臨床診斷的基礎(chǔ)上,EV71核酸陽(yáng)性、分離出EV71病毒或EV71IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性,EV71IgG抗體4倍以上增高或陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性來(lái)判斷的.然而，常規(guī)病毒分離培養(yǎng)法雖可用作EV71診斷的直接證據(jù),但其操作繁瑣、周期也太長(zhǎng);中和抗體滴度檢測(cè)具有精確且高度特異性等特點(diǎn)，但存

13、在不明顯的隱性感染，且對(duì)毒株的穩(wěn)定性要求較高；由于EV71和柯薩奇病毒A16等其他腸道病毒基因組的核昔酸序列具有一定的同源性，因而核酸檢測(cè)試劑盒在實(shí)際操作過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，并可利用同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，常被用于蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)的檢測(cè).常見的EV71免疫學(xué)診斷方法正是運(yùn)用了酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè).楊國(guó)威等利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)重組蛋白VP1，檢測(cè)58份非病人血清和98份病人血清(其中IgM陽(yáng)性血清51份,IgG陽(yáng)性血清47份).結(jié)果顯示，對(duì)IgM陽(yáng)性血清，其特異度為93.1%,靈敏度可達(dá)90

14、.2%；而對(duì)IgG陽(yáng)性血清，其特異度為93.1%,靈敏度高達(dá)93.6%,證實(shí)重組蛋白VP1可用來(lái)制備ELISA診斷試劑盒.SR.Shih等曾用EV71VP1基因的原核表達(dá)產(chǎn)物作為抗原診斷EV71感染，結(jié)果表明VP1既可用于檢測(cè)曾感染EV71患者血清中的IgG抗體，也可用于檢測(cè)急性感染期患兒血清中的IgM抗體，而且與柯薩奇病毒A16抗血清無(wú)交叉免疫反應(yīng).S.Y.Wang等"°】將商業(yè)化的抗人EV71-IgM抗體作為包被抗原建立了早期、快速診斷EV71感染的IgM診斷試劑盒.眾多研究者表達(dá)純化出具有免疫活性的EV71VP1蛋白，建立了手足口病患者抗EV7MgM和IgG的血清學(xué)診

15、斷方法.鑒于ELISA檢測(cè)方法的深入研究，目前已有國(guó)家批準(zhǔn)的EV71IgM和IgG抗體診斷試劑盒用于臨床診斷，成為對(duì)EV71感染者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的一種有效手段.2EV71的疫苗研究目前關(guān)于EV71抗病毒藥物的研究大多為體外研究或動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研發(fā)預(yù)防手足口病的EV71疫苗是首要的控制措施.近年來(lái)國(guó)內(nèi)已有多家企業(yè)采用不同來(lái)源的毒株及不同工藝進(jìn)行EV71疫苗研發(fā),在疫苗毒株的篩選和確定、細(xì)胞基質(zhì)的選擇、滅活工藝的優(yōu)化和驗(yàn)證、質(zhì)量控制、疫苗的免疫原性、動(dòng)物模型評(píng)價(jià)等方面都取得了較大進(jìn)展.目前開發(fā)EV71疫苗的毒株主要為國(guó)內(nèi)流行的C4型毒株，采用的細(xì)胞基質(zhì)主要為Vero細(xì)胞或人二倍細(xì)胞，多選擇全

16、病毒滅活工藝，采用發(fā)酵罐、細(xì)胞工廠或轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn).2.1動(dòng)物模型在疫苗研發(fā)進(jìn)入臨床研究之前,動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的關(guān)鍵指標(biāo).目前用于開發(fā)EV71疫苗的動(dòng)物模型主要是乳鼠模型和猴體模型，但均存在一定問(wèn)題.乳鼠模型感染的日齡偏小，最多為2周方，而且并非所有的EV71病毒均能建立乳鼠模型.由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類的親緣關(guān)系最為接近，撈猴或恒河猴可用于EV71病毒感染的研究模型l4-15.但多數(shù)實(shí)驗(yàn)室猴體模型存在動(dòng)物來(lái)源困難、飼養(yǎng)環(huán)境要求高、運(yùn)輸條件苛刻、試驗(yàn)費(fèi)用高等問(wèn)題,給大規(guī)模的疫苗研究帶來(lái)一定困難.2011年竇建林等3】通過(guò)病毒馴化，獲得的EV71神經(jīng)細(xì)胞適應(yīng)毒株，可用于構(gòu)建手足口病動(dòng)物模型，

17、也有助于研究EV71免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制.就目前研究進(jìn)展來(lái)看,建立一種合適的動(dòng)物感染模型對(duì)于EV71疫苗仍具有重大的研究意義.2.2減毒活疫苗早期的研究證明福爾馬林滅活疫苗的免疫保護(hù)效果優(yōu)于VP1DNA疫苗和VP1原核表達(dá)亞單位疫苗.Y.C.Lin等的研究提出一種適宜實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的減毒株K/V3-4a,其優(yōu)越的特性都符合制備滅活疫苗的要求.M.Arita等3】構(gòu)建出EV71減毒株EV71(Sl.3'),其研究結(jié)果表明EV71(S1-3')其有良好的抗原性，是一種有前景的候選疫苗.張雪梅等】研究認(rèn)為EV71滅活疫苗可以在恒河猴嬰猴體內(nèi)誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)，而且具有良好的安全性.S.C.Wu

18、等認(rèn)為改良微載體技術(shù)能使EV71滅活疫苗的生產(chǎn)達(dá)到工業(yè)化規(guī)模.C.C.Liu等】發(fā)現(xiàn)無(wú)血清微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也可以有效生產(chǎn)EV71滅活疫苗.高孟等建立了一種特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好、簡(jiǎn)單方便的測(cè)定EV71病毒滅活疫苗抗原滴度的檢測(cè)方法.2010年，由北京微谷生物醫(yī)藥有限公司、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心和中國(guó)食品藥品檢定研究院聯(lián)合開發(fā)的EV71滅活疫苗首獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局簽發(fā)的臨床研究批件，這將為我國(guó)提供安全有效的手足口病預(yù)防用疫苗，對(duì)有效控制手足口病疫情具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.2.3病毒樣顆粒疫苗EV71病毒樣顆粒(VLP)能引起較強(qiáng)的抗EV71免疫應(yīng)答,不含病毒核酸，具有很好的安全性，有望成

19、為預(yù)防EV71感染的疫苗.C.Y.Cheng等咨構(gòu)建了重組桿狀病毒(BAC-P1-3CD)和BacPlI3CD,在較弱的巨細(xì)胞病毒和IE-1啟動(dòng)子下分別表達(dá)3CD蛋白.免疫印跡和ELISA分析表明,Bac-Pl-C3CD和Bac-PM3CD會(huì)導(dǎo)致VLPs釋放到Sf-9細(xì)胞的上清,并且增強(qiáng)其在Sf-9細(xì)胞中的產(chǎn)量，但卻在HighFiveTM(Hi-5)細(xì)胞中VLPs產(chǎn)量極低.通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)后,產(chǎn)生的VLPs與從Bac.Pl.3CD感染產(chǎn)生的VLPs,不僅在密度、大小和形狀方面相似，而且還會(huì)在小鼠模型中誘發(fā)強(qiáng)有力的抗體反應(yīng),產(chǎn)生的抗體可以中和同源和異源基因組的EV71株，同時(shí)指出VLPs對(duì)手足口

20、病流行具有交叉保護(hù)潛力.該研究表明,Bac-Pl-C3CD和優(yōu)化的工藝使VLPs大規(guī)模生產(chǎn)更為經(jīng)濟(jì)，解決了需要細(xì)胞裂解液的困難，并有希望用于將來(lái)的工業(yè)疫苗生產(chǎn).2.4針對(duì)VP1位點(diǎn)的重組疫苗曾有研究者表達(dá)VP1基因構(gòu)建了EV71重組疫苗,也有將VP1基因轉(zhuǎn)入小鼠或西紅柿制備口服轉(zhuǎn)基因疫苗，均取得一定保護(hù)效果26-28.D.G.Foo等網(wǎng)針對(duì)EV71B4亞型的外膜蛋白VP1設(shè)計(jì)多肽疫苗,設(shè)計(jì)出2個(gè)肽段SP55和SP70,分別包含VP1的氨基酸163177和208222,實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者具有作為合成肽疫苗預(yù)防EV71感染的潛力，而且SP70可成為一種制備EV71疫苗的備選合成肽.S.Y.Ho等區(qū)將3拷

21、貝的SP70(208222aa)基因插入減毒百日咳桿菌構(gòu)建嵌合菌體，試驗(yàn)證實(shí)其具有中和病毒的作用.x.LLi等加用SP55和SP702種合成肽，免疫小鼠產(chǎn)生單克隆抗體，并經(jīng)免疫印跡分析及免疫組化驗(yàn)證其特異性，認(rèn)為克隆22A12在體外中和實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)強(qiáng)中和活性，有望用于治療EV71感染.最近，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心制成EV71病毒基因工程疫苗，已獲得專利g.W.C.Chng等:用一種具有ev71VP1片段(NPt.VPll.100)的重組新城疫病毒外殼蛋白感染新生小鼠模型，結(jié)果表明NPt-VPll-100能對(duì)EV71感染具有部分保護(hù)作用，可以作為抗EV71感染的潛在疫苗.另外，研究發(fā)現(xiàn)EV71在不同

22、人腦組織有交叉反應(yīng),而且這種交叉反應(yīng)與病毒的2種結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān),2010年J.N.Liu等可選擇了沒(méi)有交叉反應(yīng)的六肽，并組合成3種備選疫苗，免疫幼鼠以評(píng)價(jià)其免疫效果.研究指出由結(jié)構(gòu)蛋白上的肽段P70-159,P140249,P324443,P746876組成的Vac6,對(duì)主要由EV71C4亞型引起的手足口病具有潛在預(yù)防價(jià)值.目前雖未發(fā)現(xiàn)針對(duì)EV71重癥患者的有效治療藥物,但預(yù)防疫苗的研究已有突破性進(jìn)展.T.C.Wu等可研究認(rèn)為EV71與柯薩奇病毒A16型有許多共同的多肽表位，針對(duì)柯薩奇病毒A16型的體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)EV71感染有交叉預(yù)防作用，目前已有針對(duì)這2種病毒引起的手足口病疫苗獲得專利.

23、另外，鑒于國(guó)內(nèi)外將免疫乳用于預(yù)防疾病的研究頃1,將純化的基因工程抗原EV71VP1免疫奶牛制備的免疫乳用于EV71引起的手足口病預(yù)防也是一個(gè)新的思路.3展望目前，人類已經(jīng)建立了很多種EV71的檢測(cè)方法,但在臨床應(yīng)用上都有一定的局限性，很難同時(shí)滿足準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、易于普及等要求.雖然ELISA法具有敏感、特異、廉價(jià)和快速等優(yōu)點(diǎn)，也可滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及大規(guī)模普及等需求，但仍受兩方面的限制:一方面，高病毒含量的樣本采集較困難,另一方面,EV71在人群中存在很大比例的隱性感染.隨著體外診斷試劑的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外關(guān)于疾病的檢測(cè)診斷涌現(xiàn)了許多新思路，主要表現(xiàn)在兩種及兩種以上診斷方法的聯(lián)合使用，這樣可以最大限

24、度地利用各種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)，這也為EV71的診斷提供了一條新思路.建立合適的動(dòng)物模型,篩選免疫原性和交叉保護(hù)水平高的毒種，以及不同類型疫苗免疫原性比較是疫苗研究的重點(diǎn).參考文獻(xiàn)：1 徐溥緒，周惠玲，崔穎鵬，等.腸道病毒71型VP1基因及蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析J中華傳染病雜志,2010,28(7)：408.2 ShihSR,LiYS,ChiouCC.ExpressionofcapsidproteinVP1foruseasanantigenforthediagnosisofenterovirus71infectionJ.MedicalVirology,2000,61(2)：228.3 張軍

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33、erovirus71elicitimmuneresponseinmiceJ.GenetVaccinesTherapy,2007(5)：6.27 ChenHL,HuangJY,ChuTW,etal.ExpressionofVP1proteininthemilkoftransgenicmiceapotentialoralvaccineprotectsagainstenterovirus71infectionJ.Vac-cine,2008,26(23):2882.28 ChenHF,ChangMH,ChiangBL,etal.OralimmunizationofmiceusingtransgenictomatofruitexpessingVP1proteinfromenterovirus71J.Vaccine,2006,24：2944.29 FooDG,MacaryPA,AlonsoS,ela