長期施氮對馬鈴薯田土壤剖面硝態(tài)氮積累及細菌群落結構的影響.docxVIP

1、甘肅農業(yè)大學學報JOURNALOFGANSUAGRICULTURALUNIVERSITY長期施氮對馬鈴薯田土壤剖面硝態(tài)氮積累及細菌群落結構的影響張健，董星晨，張鶴，鄧德雷，羅超越，張春紅，邱慧珍甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，甘簫省干旱生境作物學更點實驗室，甘肅蘭州730070）摘要：【目的】揭示長期連續(xù)施氮對半干旱地區(qū)馬鈴薯田土壤剖面中硝態(tài)氮積累及細菌群落結構的影響.防法】通過大田試驗設置了6個不同的施氮水平：N。不施氮，對照）、Nm施氮里75kg/hm'）、Nm°確氮星150kg/hm2）、N2"施氮225kg/hm2>*N300施氧量300kg/hm2）和N

2、3?s施氯鼠375kg/hm2），研究連續(xù)4年施氮對旱地馬鈴茗田土壤剖面中硝態(tài)氮的積累以及細菌群落結構的影響.黯果】隨若施氮里增加，0100cm土壤剖面內NOS_-N含量顯著增加PV0.05），尤其020cm土燃表層各施氮處理的NO4_-N含里分別比對照N。增加了55.8%，】13.9%,162.8%，365.1%和988.4%.Miseq高通量測序結果顯示，連續(xù)施氮顯著改變了020cm表層土壤的細菌群落結構，在門水平上的土壤優(yōu)勢細菌類群中，隨若施氮里增加，各施氮處理土壤放線菌門和擬桿曲門的細菌的豐度分別比對照N0處理增加了6.1%17.4%和16.4%46.8%，酸桿菌門的豐度比對照降低了7

3、.8%26.4%:在綱水平上的土壤優(yōu)勢細菌類群中，與對照N“相比，各施氮處理擬桿菌綱細菌的豐度增加了33. 8吟173.3%AciTbbacterGp4和Anaerolineae的相對豐度分別降低16.3%33.8%、8.1%22.7%：在屬水平上的土壤優(yōu)勢細菌類群中，各施氮地理的Ohtaekwangia和Streptomyces細菌的豐度分別比對照增加了33.6%173.1溷3.4%66.4%，而Gaiella和Solirubrobacter細菌的豐度分別比對照No降低了6.9%30.8%和4. 5%27.6%.連續(xù)4a過量施氯也顯著降低了土壤細菌的群落多樣性.RDA冗余分析及相矣性分析結果

4、表明，土壤NO3-N含宣與放線菌門、擬桿菌門、擬桿菌綱'Ohtaekwangia'Streptomyces犧霉菌屆）和Lysobacter常桿健屬）的細菌的豐度顯著正相失，與酸桿菌門、Gaiella'SolirubrobacterCt壤紅桿蕙屬）、Gemmatimonas雋單胞菌屬）的細茵的豐度顯著負相關.陸論】連續(xù)4a施氮，隨著施氮量增加顯著地提高了土壤剖面中硝態(tài)氮的含量，與對照No相比，020cm表層土壤細菌豐度隨若施氮箜培加顯著培加，細菌群落結構發(fā)生改變，且過箜施氮降低了土壤細菌的多樣性.RDA分析及person相尖性分析表明，長期施氮引起土壤硝態(tài)氮含皇的變化是造

5、成土邃細笛群落結構發(fā)生改變的主效土壤環(huán)境因子.關鍵詞：NO-N含五：細菌Alpha多樣性：細菌群落結構：相關性分析中圖分類號：S154.3文獻標志碼：A文章編號：100A43152019）01-0030_12DOI：10.13432/ki.jgsau.2019.01.005Effectoflong-termnitrogenapplicationonbacterialcommunitystructureofpotatosoilinsemi-aridareaZHANGJian»DONGXing-chen，ZHANHe，DENGDe-lei»LUOChao-yue*ZHANGCh

6、un-hong，QIUHui-zhenCollegeofResourcesandEnvironmentalSciences，GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience，GansuAgricultura1University.Lanzhou730070,China）Abstract：Objective】InordertoannounceNO3-Naccumulationinsoilprofileofpotatofieldindrylandandtheeffectofbacterialcommunitystructureundercontinuousnit

7、rogenN）fertilizeapplication第一作者：張健，碩士研究生.E-mail：1148126151通信作者：邱菽珍.教授，博士生導腳.主要從事桓物營養(yǎng)與營養(yǎng)生態(tài)的教學與科研工作.E-mail：hzqiu基金項目：國冢至點基礎研究發(fā)展計劃。73計劃&015CB150501）：國冢公益性行業(yè)&業(yè)）科研專項&01103004）.收稿日期：2018-03-28：修回日期：2018-04-21多樣性降低&.閉，使得土壤細菌群落結構發(fā)生變化，在本研究中，連續(xù)4a施氮，相比于其他地理，僅M”處理shannon指數顯著低于其他施氮處理，而simpson指數顯著

8、高于其他處理，同時最高施氮量處理N睥的土壤樣品OTU與Chaol值最低，說明長期過星施氮可以降低土壤細菌多樣性，該結果與前人的研究結果一致.有研究表明在美國的長期N投入試驗中觀察到，高N施入增加了豐富類群變形菌門和擬桿菌門）的相對豐度，降低了貧瘠類群酸桿菌門）的相對豐度血.在土攘營養(yǎng)物質增加時，豐富類群能利用有效碳源快速生長，因此可以在較高氮含星的環(huán)境下較好的生長繁殖，而貧瘠類群在環(huán)境中生長速度較低，吸收營養(yǎng)物質的能力較弱，因此在營養(yǎng)物質較高時，這些貧瘠類群與豐富類群相比競爭力較弱，不能良好的生長繁殖如），導致其數量下降.本研究結果表明，連續(xù)4a施氮，各處理優(yōu)勢菌門的絕對星發(fā)生了變化，與N。相

9、比，在020cm土層內.土壤放線菌門和擬桿菌門的豐度隨著施氮星增加顯著提高，酸桿茵門的豐度顯著降低，土壤變形菌門豐度隨著施氮量增加雖整體呈上升趨勢，但各處理之間并沒有顯著性差異.這與前人研究結果一致，由于長期施氮導致土壤硝態(tài)氮含星顯著增加，土壤營養(yǎng)物質增加，從而促進了豐富類群的生長，抑制了貧瘠類群的生長.有研究報道&汨變形菌門中許多細菌類群參與了土壤氮素循環(huán)，與硝化作用有關的細菌大多數屬于變形菌門中的變形菌綱和l變形菌綱，而許多不同種類的細菌都具有反硝化功能，如放線菌門，厚壁菌門，擬桿菌屬以及變形菌門中的一些細菌瑚，在本研究中，施氮明顯促進了廣變形菌綱細菌類群的生長，且檢測出來的兩種優(yōu)

10、勢屬水平的菌群Lysobacter溶桿菌屬）、SteroJDobacter曾桿菌屬）、均屬于r-變形菌綱,Nilrospira硝化螺菌屬）的豐度隨著施氮量增加而升高，值得注意的是，檢測出來的Azotobacter固氮菌屬）雖說豐度較低，但是相比施氮處理，不施氮處理中Azotobacter的豐度是施氮處理的1.2A2.15倍.說明不施氮處理顯著刺激了土壤Azctobacter的生長.氮素的添加能夠促進土壤放線菌門細菌的生長如），本研究發(fā)現排名前12的優(yōu)勢屬中，有6個優(yōu)勢屬分別是NocaiDioiDes斐諾卡氏菌屬）、Gaiella、Arthrobacter箔桿菌屬Strep-tomyces遂霉菌

11、屬）、Solirubrobacter吐壤紅桿菌屬）、Blastococcus等屬于放線菌綱，其豐度占整個優(yōu)勢屬豐度的41.88%其中NocaOoiDes>Ar-throbacter都能將土壤中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽商，且隨著施氮星增加，其豐度顯著升高.而擬桿菌門的豐度整體來說是隨著施氮星下降的，但檢測出來的優(yōu)勢綱BacteroiDetesincrete擬桿菌綱）以及Ohtaekwangia的豐度均隨著施氮量升高顯著升高，Ohtaekvangia是新發(fā)現的屬于擬桿菌門噬纖維菌科中的新屬心，其具體的生活習性鮮見報道，因此，推測擬桿菌門中的BacteroiDetesincrete以及Ohtae

12、kwangia的細菌與反硝化作用密切相關.Gemmatimonals芽泡單菌門）中細菌類群具有很強的反硝化功能，GemmatimonaDates芽單胞菌屬）具有脫氮的功能'但本研究結果中與前人研究結果相悖隊2盤的是隨著施氮星增加，Gemmati-monaDales的豐度顯著降低，前人研究結果表明，水氮一體的環(huán)境條件下GemmatimonaDates的豐度隨著施氮量增加而顯著增加，因此推測，Gemmatimo-naDates對土壤水分的敏感程度較高，而在旱地土壤中，由于水分不足導致GemmatimonaDates隨著施氮星升高反而呈降低趨勢.值得注意的是，隨著施氮呈增加而增加的細菌優(yōu)勢屬

13、還有Lysobacter溶桿菌屬）和Streptomy-ces）鏈霉菌屬，而溶桿菌屬細菌可以抑制一些土傳真菌病害，如水稻白葉枯病、辣椒疫病，對立枯絲核菌具有明顯的抑制作用溢：而鏈霉菌屬細菌可以產生抗真菌活性，抗細菌活性以及抗病毒的毒素s，在本研究中，可能是由于連作和長期施氮，導致一些對馬鈴薯生長有害的細菌或真菌大量繁殖，刺激了落桿菌屬和鏈霍菌屬的生長.3.3細菌群落結構與部分土壤理化性質的相關性分析長期施氮顯著影響了土壤細菌群落組成結構，RDA分析表明，長期施氮引起的土壤硝態(tài)氮含雖和土壤pH變化是影響土壤細菌群結構變化的主要環(huán)境因子，這與相關性分析結果一致，然而，大多數細菌都生活在pH為49的

14、環(huán)境中，且大多都能承受pH在01個單位之間的變化量而本研究發(fā)現隨著施氮量升高，土壤pH相比于其他處理僅在最高施氮星處理條件下降低了0.3個單位，因此確定了引起土壤細菌群落結構變化的最主效土壤環(huán)境因子是NO3-N含呈，而并非土壤pH值.隨著施氮呈升高，土壤no3-n含星顯著升高，與NO.廣-N含量顯著負相關的菌群有Ac-iDobacteria酸桿菌門）'GemmatimonaDctcs芽單胞菌門）,AciIRbacteriaGP6、AciI3obacteriaGP4»Gemmatimonas芽單胞菌屬）>Solirubrobacter（土壤紅桿菌屬）：這是由于酸桿菌門屬于

15、貧瘠類群的，在較高的營養(yǎng)環(huán)境中生存競爭力不如像放線菌門，擬桿菌門這種富營養(yǎng)類群，所以在較高營養(yǎng)環(huán)境下反而不利于其生長繁殖.但是與前人研究結果不一致x25的是GemmatimonaI3etes及Gemmatimonas的豐度與土壤硝態(tài)氮含呈顯著負相關.與硝態(tài)氮含宣顯著正相關的細菌類群有BacteroiDetes擬桿菌門）、BacteroiDetesincertaesdl>s（擬桿菌綱）、Arthobacter節(jié)桿菌屬Nocaii>oil>s僂諾卡氏屬）、Ohtaekwangia'Streptomyces魅零菌屬），Ly-sobacter箔桿菌屬），其中BacteroiD

16、etes、Bacte-roiDetesineertaesd>s、Arthobacter、NocarDioiDBs被證實均與反硝化作用有矣，可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此長期施氮導致土壤硝態(tài)氮含量升高，進而影響了土壤細菌群落結構的變化，而Streptomy-ces,Lysobacter也隨著施氮雖的升高而升高，可能是因為長期施氮和連作引起的.4結論連續(xù)4a施氮顯著提高了土壤剖面中硝態(tài)氮的含雖，隨著施氮量升高，土壤剖面中硝態(tài)氮含量顯著增加,尤其在020cm土壤中各施氮處理各處理土壤NO3_-N含雖分別為4.3,6.7,9.2,11.320.0,46.8mg/kg.分別比對照增加了55.8%

17、113.9%162.8%365.1蜓988.4%連續(xù)施氮顯著改變了表層土壤的細菌群落結構,降低了土壤細菌的群落多樣性.連續(xù)四年施氮，隨著施氮雖的增加各陞理的門的絕對雖發(fā)生了變化，隨著施氮量增加，各施氮地理土壤放線菌門和擬桿菌門的細菌的豐度分別比對照N地理增加了1%-17.4%和16.4%46.8%酸桿菌門的豐度比對照降低了7.8%26.4%在綱水平上的土壤優(yōu)勢細菌類群中，與對照No相比，隨著施氮量增加，各處理擬桿菌綱細菌的豐度分別增加了33.8%44.8%83.3%109.2%173.3%而AcilJobacte-rGp4和Anaerolineae隨著施氮呈增加顯著降低PV0.05）,較No相

18、比，隨著施氮量增加，各處理AciD:）bactcrGp4和Anaerolineae相對豐度分別降低16.3%33.8%8.1%22.7%：在屬水平上的土壤優(yōu)勢細菌類群中，各施氮處理的Ohtaekwangia和Streptomyces細菌的豐度分別比對照增加了33.6%-173.1%和3.4%66.4%而Gaiella和Solirubrobacter細菌的豐度分別比對照No降低了6.9%30.8涵4.5%27.6%連續(xù)過量施氮也顯著降低了土壤細菌的群落多樣性.RDA及相矣性分析表明土壤硝態(tài)氮含量的變化是導致細菌群落結構發(fā)生改變的主要土壤環(huán)境因子.參考文獻fi盧建武，邱慧珍，張文明，等.半干旱雨養(yǎng)

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30、lizer，225kg/hm')»N3o0'N-fertilizer*300kg/hm?)»N375,Sl-fertilizer>375kg/hm?)，inordertostudyN03_-Nac-cumulationinsoilprofileofpotatofieldindrylandandtheeffectofbacterialcommunitystructurebyN)fertilizeapplicationforfourconsecutiveyears.(Result1Withtheamountofnitrogenapplied*thenitr

31、ateNO3-N)contentinsoilprofileof0100cmwassignificantlyincreased.Inparticular,thecontentofNO3-Nincreasedby55.8%，113.9%，162.8%，365.1%and988.4%insurfacelayerof020cmcom-paredwithNOtreatment.Miseqhighthroughputsequencingresultsshowedthatthestructureofbacterialcommunityinthesurfacesoilof020cmchangedunderth

32、econditionofcontinuousnitrogenapplication.Withtheamountofnitrogenapplied»theabundanceofsoilActinomycetesandBacteroiDesincreasedby6.1%17.4%and16.4%46.8%comparedwithNotreatment.TheabundanceofAcilDubacterphylumwas7.8%26.4%lowerthanthatofcontrol.Inthedominantclassofbacteria»withtheincreaseofni

33、tro-genapplication，theabundanceofBacteroiDetesincretincreasedby33.8%173.3%，andtherelativeabun-danceofAclJobacterGp4andAnaerolineaedecreasedby16.3%33.8%and8.1%22.7%.Insoilbac-teriaatdominantgenuslevebtheabundanceofOhtaekwangiaandStreptomycesbacteriaincreased33.6%73.1%and3.4%66.4%，respectively，andthea

34、bundanceofGaiellaandSolirubrobacterbacteriadecreased6.9%30.8%and4.5%27.6%respectively»comparedwiththecontrolN(l.Thecommunitydi-versityofsoilbacteriawasalsosignificantlyreducedbyexcessiveapplicationofnitrogenfor4years.RDAredundancyanalysisandpersoncorrelationanalysisshowedthatthecontentofNO3_-Ni

35、nsoilwasposi-tivelycorrelatedwiththeabundanceofbacteriaofActinomyces，BacteroiDetes，BacteroiDetesincertaesd)s，OhtaekwangiaStreptomycesandLysobacter.Therewasasignificantnegativecorrelationbetweenthea-bundanceofGaiella-SolirubrobacterandGemmatimonas.fconclusionlTheNO3-Ncontentinsoilprofileissignificant

36、lyincreasedwiththeincreaseofnitrogenapplicationforfourconsecutiveyears.ComparedwiththecontrolNOtrealment*thebacterialabundanceof020cmsurfacesoilisincreasedsignificantlywiththeincreaseofnitrogenapplicationrale.Thestructureofthebacterialcommunityischanged*andexcessiveapplicationofnitrogenreducedthediv

37、ersityofsoilbacteria.RDAredundancyanalysisandpersoncorrela-tionanalysisshowedthatthechangeofnitratecontentinsoilcausedbynitrogenapplicationforalongtimeisthemainenvironmenta1factorofsoilbacterialcommunitystructurechange.Keywords：NO3-Ncontent：bacterialalphadiversity；bacterialcommunitystructure；correla

38、tionanalysis地處甘肅省中部的定西市是我國重要的馬鈴茗種蓍和商品薯生產及淀粉加工基地有'中國馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱是甘肅省最大的馬鈴薯主產區(qū)，馬拎著產業(yè)已成為帶動農業(yè)和農村經濟發(fā)展，促進農業(yè)增效、農民增收的戰(zhàn)略性主導產業(yè)3.然而農民為追求高產和高收益，在馬鈴薯種植過程中肥料投入、尤其是氮肥的投入呈持續(xù)增加，盲目施肥現象十分嚴重七氮肥的過量投入，不僅沒有達到預期的產量，反而降低了馬鈴薯塊莖的品質、尤其是窖藏品質&45,更為重要的是，長期大呈施氮在降低氮肥利用率的同時，導致土壤剖面中硝酸鹽富集，造成嚴重的資源浪賈以及環(huán)境污染并且顯著影響了土壤細菌的群落結構和多樣性&-0

39、.±壤細菌作為主導農田土壤微生物的主要類群，可以敏感響應土壤養(yǎng)分含量及土壤肥力的變化.本研究設置長期定位試驗研究，運用傳統(tǒng)的土壤農化分析方法結合克隆測序以及實時熒光定量PCR等分子生態(tài)學研究手段，探討連續(xù)4a施氮對旱地馬鈴薯田土壤剖面中硝態(tài)氮的積累以及細菌群落結構的影響，旨在探明長期連續(xù)施氮對土壤剖面硝態(tài)氮含雖的影響以及細菌群落結構和多樣性對不同施氮量的響應機制.1材料與方法1.1試驗區(qū)概況田間定位試驗始于2013年4月，試驗地位于甘肅省定西市安定區(qū)香泉鎮(zhèn)N3字277'，E104°30'34"），海拔20532556m，年均溫度6.9C，年降水呈4

40、00mm左右，多集中在79月.無霜期140d，80%保證率0°C的積溫為2075.1°C，蒸發(fā)雖1400mm以上，屬中溫帶半干旱氣候.1.2試驗設計田間試驗設置6個不同施氮處理：N”對照：N75施氮雖75kg/hm2N（5o施氮呈150kg/hm?，:N225（施氮量225kg/hn?）：N3oo（施氮星300kg/hm2）；N375施氮量375kg/hm'）.每個堡理4次重復，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積7.2X9=64.8m。采用寬壟雙行覆膜種植模式，壟寬1.2m，壟間距0.4m，行距0.6m，株距0.2m，種植密度為8.34X10'株/hm>.每個處理

41、肥底一致，施磷量：R05225kg/hm2,施鉀K20292.5kg/hm2.N肥為尿素N，46%）,P肥為過磷酸鈣ROs，16%）,鉀肥為硫酸鉀鎂虬0,24%）.供試品種為馬鈴茗青茗九號'.田間試驗于2016年5月1日播種，10月9日收獲.按照當地常規(guī)方法進行田間管理.1.3土壤樣品采集在馬鈴著收獲期采集020、2040、4060、6080、80100cm土壤樣品，測定不同土層土壤硝態(tài)氮含呈.同時，對020cm表層土壤采用克隆測序以及實時定量PCR方法測定細菌的群落組成和結構.1.4測定指標及方法土壤NO3-N和NH./-N含量的測定：0.Olmol/LCaCh溶液浸提，震蕩lh，用

42、流動分析儀測定.土壤pH測定：水土比為5：1，用pH計測定.土壤有機質的測定：重銘酸鉀外加熱法.DNA提?。豪肍astDNASpinKitforSoil試劑盒MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA），按照其說明書中的步驟提取土壤總DNA.DNA提取后,分別采用微量紫外分光光度計WanodropND-1000UV-Vis）測定土壤DNA的濃度和純度t>?60/D28o和D/D"。）.之后將其稀釋10倍用于PCR模板.PCR：每個處理的4個重復DNA，采用515F/907R對細菌16SrDNA基因進行擴增，其中，正向引物515F含有12個堿基的特異Tag標簽，

43、用以區(qū)分不同的土壤樣品.PCR擴增體系為：25uL的TaKaRaTaqVersion2.0plusdye（TaKaRa，Dalian，China），1pL的10Pmol/L引物，2pLDNA模板，補足21pL的ddH?O至50pL反應體系，每次PCR反應均設置無菌水的陰性對照.PCR擴增條件為：94笆5min，94°C30s，25530s，272°C45s，272'C8min.獲得擴增產物后，利用E.Z.N.A©.Cycle-PureKit（OMEGA»Norcross，GA，USA），利用說明書的方法對其進行純化，溶于1OOpLElutionB

44、uffer-利用微量紫外分光光度計NanodroND1000UVVis）測定純化后PCR產P-物的濃度.最后將所有樣品等摩爾數混合，使用VAHTSNanoDNALibraryPrepKitforIlluminaNazyme，Nanjing»China）構建高通星測J序文庫,質檢后通過IlluminaMiseqPE250測序儀上機分析.實時熒光定量PCR：采用Bio-RadCFX96OpticalReal-TimePCRSystem姑io-Rad，Hercules*CA.USA）擴增儀進行實時熒光定雖PCR分析.標線取自基因代表性克隆重組質粒的10倍稀釋樣，稀釋梯度6到8個，空白樣品的

45、模板為水.然后根據標準曲線的濃度計算出樣品中的基因拷貝數，最后以每克干土中的基因拷貝數為單位進行分析，每個樣品3次重復.定墾PCR的反應體系為20業(yè)，包括1|jLDNA模板、10|jLSYBRPremixExTaqSaKa-Ra，Dalian，China），正向和反向引物分別為0.25yL<10umol/D和8.5業(yè)的滅菌雙蒸水.優(yōu)化后的PCR程序如表1.表1本研究所用的引物和條件Table1Primersandconditionusedinthisstudy引物名稱Primername引物序列任一3')目標基因PCR程序PrimersepuenceTargetgenePCRPr

46、ocedure515FGTGCCAGCMGCCGCGG90.95C，3min:39XQ5'C，30s;55P，30s：?：cterial1672,30swithplateread)：Meltcurve65.07RCCGTCAATTCMTTTRAGTTTto95.0'C，increment0.5°C，5s+platereadFF390CGATAACGAACGAGACCTFR1AICCATTCAATCGGTAIT2結果與分析2.1長期施氮對土壤剖面中硝態(tài)氮SL03-SI含量的影響馬鈴薯收獲期土壤剖面各土層中NO廣-N含屋的測定結果如表2所示：連續(xù)4a施氮，導致0100cm

47、內土壤剖面中NO3-N含量隨著施氮雖增加顯著增加PV0.05),尤其在020cm土壤樣品中，各處理土壤NO3-N含雖分別為4.3、6.7、9.2、IL3、20.0、46.8mg/kg，各施氮地理的NO3_-N含呈分別比對照No增加了55.8%、113.9%、62.8%.365.1%和988.4%:在各土壤剖面內No3-n含量也不相同，隨著土壤剖面深度增加，其Fungal18SrRNAgene95*C，3min:39X05C，30s：55C，30s;72*CIminwithplateread)：Meltcurve65.0to95.0,C»increment0.5*C，5s+plater

48、ead含雖逐漸降低.2.2長期施氮對表層土壤理化性質的影響表2不同施氮量土壤含量地理Treatment土壤剖面/cmSoilprofile02020404060608080100No4.3±l.51c2.8±0.21d1.4+0.23d1.3±0.431.4+0.39cn756.7±0.97dv3.3±0.2T2.5+0.19d2.9+0.23"2.7+0.18cN|5o9.2±0.8。"4.0土0.263.5±0.70"4.1±0.68"4.9±1.18N2251

49、1.3±1.36°7.1±0.49*7.9+2.or5.3+0.15C6.6+1.16cN3OO20.0±4.52h15.2±1.66b12.7±0.77"11.5±2.21b10.8±1.3511n3T546.8±5.04*32.8+0.8T21.5±5.47"18.4+0.81"M.9土1.43Table2SoilNOj-Ncontentwithdifferentnitrogenratesng*kg-')表3不同施氮處理的部分表層土壤理化性質處理Trea

50、tment土邃理化性質PhysicalandchemicalpropertiesofsoilpHNO-NNH/+-NOMNn8.29土0.04訃4.3±1.51*0.87±0.04°16.74±0.45N8.36+0.05*6.7±0.97de0.84±0.03“16.02+0.18*N|S08.29±0.02ab9.2±0.80"1.17±0.05°18.15±1.014N22S8.23土0.03b11.3±1.36°1.0410.04"16.

51、63±0.79'N30Q8.23+0.0T20.0±4.52b1.05+0.07"16.60+1.24,N37S8.02±0.04e46.8±5.04°1.05±0.02°17.49±0.94Table3Physicalandchemicalpropertiesofsoilstreatedwithdifferentnitrogenrates連續(xù)5a不同施氮呈，隨著施氮量增加，土壤pH表現為先增加后降低的趨勢，在N伯處理中達到最大值為8.36,在Na”處理達到最低&02,與Nu相比降低了0.

52、26,說明長期過量施氮會造成土壤pH降低.NH,-N的含雖并未隨著施氮量增加而出現有規(guī)律的變化.通過對土壤OM含量的測定結果分析發(fā)現，各魁理土壤OM含量均未達到統(tǒng)計學差異水平,但是N,恥處理的土壤OM含呈為18.15g/kg，明顯要高于其他處理.因此，在合理的施氮范圍內，長期施氮可以增加土壤OM的含量.2.3長期施氮對細菌Alpha多樣性的影響根據高通量測序結果，表3中列出了各處理土壤樣品中在相似性0.97條件下得到的Alpha多樣性指數，其中OTU和Chaol指數是表征群落豐富度的指數，OTU越高，代表物種種類越多»Chaol11越大，物種豐度越高:Shannon和simpson指

53、數是表征微生物多樣性指數.shanon指數越大，物種多樣堡理Treatment覆蓋度Coverage豐富度Richness多樣性DiversityOTUChaoSimpsonShannonNo0.9513±0.017,2460±434a3521+363'*0.0037+0.0006h6.65+0.13uN750.9575±0.008"2615+136"3589±880.0038土0.0006h6.61土0.04樸N|5(j0.9633+0.004"2669±74"3592±120&quo

54、t;0.0047+0.0008"6.55±0.09“N/250.9511+0.010"2434±136"3398土145"0.0045土0.0007h6.63±0.08"bN.oo0.962()±0.004"2655±236"3588±232"0.0047+0.0004*h6.59±0.05*bNg0.9568+0.009"2437+143"3402土1290.0059±0.0010"6.48+0.llb堡

55、理Treatment覆蓋度Coverage豐富度Richness多樣性DiversityOTUChaoSimpsonShannonNo0.9513±0.017,2460±434a3521+363'*0.0037+0.0006h6.65+0.13uN750.9575±0.008"2615+136"3589±880.0038土0.0006h6.61土0.04樸N|5(j0.9633+0.004"2669±74"3592±120"0.0047+0.0008"6.55

56、7;0.09“N/250.9511+0.010"2434±136"3398土145"0.0045土0.0007h6.63±0.08"bN.oo0.962()±0.004"2655±236"3588±232"0.0047+0.0004*h6.59±0.05*bNg0.9568+0.009"2437+143"3402土1290.0059±0.0010"6.48+0.llb表4不同施艇雖處理的土壤細菌Alpha多樣性指數Table4

57、Alphadiversityindexofsoilbacteriatreatedwithdifferentnitrogenrales呈增加了16.4%-46.8%AciDobacteria中細菌數量減少7.8%-26.4%.2.4長期施氮對細菌群落組成的影響2.4.1長期施氮對土壤門水平細菌優(yōu)勢類群的影響為分析長期連續(xù)施氮對土壤細菌群落結構的影響，利用meseq高通星測序及實時熒光定量PCR等微生物學研究方法對02。cm表層土壤細菌群落結構進行分析.結果如圖1所示，在門水平上不同施氮處理土壤中排名前9的細菌優(yōu)勢類群中，Pro-teobacteria變形菌門），AciDobacteria酸桿菌門

58、），Actinobacteria放線菌門）有絕對的優(yōu)勢，在各堡理中占60%左右.隨著施氮呈的增加各處理的門的絕對量發(fā)生了變化，在020cm土樣內Actinobacte-ria放線菌門）和BacteroiDetes。認桿菌門）的豐度顯著提高，SciDobacteria）酸桿菌門的豐度顯著降低，相比于Nn處理，各堡理中Actinobactcria細菌數量增加6.1%I100908070.60¥5040302010111111*6. 4%.BacteroiDetes中細菌數性越高，simpson指數越大，物種多樣性越低.隨著施氮雖增加，各地理僅在N375魁理土壤樣品中，shannon指數顯

59、著低于其他施氮處理，而simpson指數顯著高于其他處理，雖然各堡理OTU與Cha01指數雖沒有顯著性差異，但相比其他處理，N375堡理的土壤樣品OTU與Chaol值最低，這說明過雖施氮可以降低細菌的多樣性.2.4.2長期施氮對土壤優(yōu)勢綱細菌類群的影響為了進一步分析長期施氮對土壤細菌群落結構的影響，對不同處理在綱水平上優(yōu)勢細菌類群進行統(tǒng)計分析，結果如圖2所示，在綱水平上不同施氮魁理土壤中前12個優(yōu)勢菌群中，放線菌門中的Acti-nobacter，酸桿菌門中的AciTJobacterGp6以及變形菌綱中的Betaproteobacteria&變形菌綱）、Gam-maproteobacte

60、ria&變形菌綱）和Alphaproteobac-teria&變形菌綱）占絕對優(yōu)勢，在各魁理中占總優(yōu)勢菌綱的40%左右.隨著施氮量增加，擬桿菌門中的BactcroiEtetesinceratesd>s似桿菌綱）和Acti-nobacter仿攵線菌綱）細菌的豐度顯著增加（P<0.05），與對照N。相比，隨著施氮量增加，各處理擬桿菌綱細菌的豐度分別增加了33.8%、44.8%、83.3%109.2%173.3%而AciDobacterGp4和Anaerolineae隨著施氮量增加顯著降低0V0.05）,較No相比，隨著施氮量增加，各處理Ac-iDobacterGp4和A