青天葵活性部位的體外抗腫瘤作用研究

1、青天葵活性部位的體外抗腫瘤作用研究                            作者：鐘振國 袁葉飛 周燕園 甄漢深 梁臣艷【摘要】  目的確定廣西特產(chǎn)藥材青天葵體外抗腫瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制備主要采用溶劑法, 青天葵全草先用95%的乙醇提取，得到的提取物進(jìn)一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、

2、甲醇依次提取，得到極性由小到大的4個提取部位。活性篩選采用MTT法實驗，觀察青天葵提取物對7種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的體外抗腫瘤作用。結(jié)論首次確定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是體外抗腫瘤作用的有效部位。 【關(guān)鍵詞】  青天葵 體外抗腫瘤作用 活性部位Abstract：ObjectiveTo determine the active fraction with anticancer effect in vitro from Nervilia foadii(Hance) Schltr.MethodsThe samples were prepare

3、d by solvent extraction. The whole Nervilia foadii(Hance) Schltr. was extracted with 95% ethanol at first,and then the ethanolic extract was separated with petroleum ether, ethyl acetate, n-Butyl alcohol and methanol in turn to get four fractions from small to large in polarity. The MTT experiment w

4、as made for active screening. The inhibiting influences of extracts from Nervilia foadii(Hance) Schltr. on growth of seven kinds of human tumor cells were observed. ResultsPetroleum ether extract and ethyl acetate extract both had some anticancer effects in vitro. ConclusionIt is the first time that

5、 the petroleum ether extract and ethyl acetate extract of Nervilia foadii(Hance) Schltr. are proved to be the effective anticancer fractions in vitro.Key words： Nervilia fordii(Hance) Schltr.,   Anticancer effect in vitro,   Active fraction青天葵為蘭科Orchidaceae植物毛唇芋蘭Nervilia foadii(H

6、ance) Schltr.的干燥全草，入藥始載于嶺南采藥錄，主要產(chǎn)于我國的廣西、廣東、海南，四川、云南，泰國也有分布，是廣西特產(chǎn)藥材13，具有清肺止咳、健脾消積、鎮(zhèn)痛止痛、散淤消腫、清熱解毒之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、中毒、跌打損傷、小兒疳積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等癥。近來還用含有青天葵的復(fù)方制劑鼻咽癌以緩解癥狀4，但未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外對其抗腫瘤有效成分及藥理作用的研究。為此，筆者對青天葵的干燥全草進(jìn)行了藥效學(xué)實驗研究，對青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、甲醇4個不同部位采用體外抗腫瘤實驗進(jìn)行初篩，為闡明青天葵的抗腫瘤作用并篩選出有效部位打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。1  材料與儀器1.1&#

7、160; 受試樣品 藥材青天葵來源于南寧藥材站，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)副教授鑒定為蘭科Orchidaceae植物毛唇芋蘭Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。對青天葵的干燥全草進(jìn)行提取分離得4個部位：石油醚提取物（A）、醋酸乙酯提取物（B）、正丁醇提取物（C）、乙醇提取物（D）。A，B，C和D均用含有DMSO的培養(yǎng)液溶解，均配成濃度為480 g/ml的溶液，置于-20冰箱密閉避光保存。臨用前用不含血清和抗生素的RPMI1640（NG108-15用DMEM）液稀釋至所需濃度，DMSO終濃度在0.01%水平。1.2  培養(yǎng)液1.3  細(xì)

8、胞株 白血病細(xì)胞株L1210和P388D1、宮頸癌細(xì)胞株Hela、人胃癌細(xì)胞株SGC7901、黑色素瘤細(xì)胞株B16、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15等均購自上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，人肝癌細(xì)胞株Hela7404由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。1.4  試劑 MTT（四甲基噻唑藍(lán)）為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號020609；FBS（胚胎牛血清）為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號0405；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，批號1120708和0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司提供，批號200503；DMSO（二甲基亞砜）由天津匯

9、英化學(xué)試劑有限公司提供，批號20040526。1.5  細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞用含10%滅活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15腫瘤細(xì)胞用DMEM）培養(yǎng)基在37，15%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。1. 6  儀器  Thermo Forma型CO2培養(yǎng)箱，美國產(chǎn)；Olympus型倒置顯微鏡，日本產(chǎn)；Biocell型酶標(biāo)儀，奧地利產(chǎn)；AG135型天平，瑞士產(chǎn)；培養(yǎng)瓶，美國產(chǎn)；3072型96孔板，丹麥產(chǎn)；3001型培養(yǎng)皿，美國產(chǎn)；DLF560型超凈工作臺，荷蘭產(chǎn)；HV-50自動高壓滅菌器，日本產(chǎn)。2  方法2.1 

10、樣品的提取分離 將青天葵藥材陰干，去除雜質(zhì)，粉碎為粗粉，稱取9.0 kg藥材粗粉，用95%乙醇（食用）浸泡48 h后滲濾提取，用10倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率10.2%）。將所得的粗提物用硅膠拌勻后，依次用石油醚（6090）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位180 g，醋酸乙酯部位87.5 g，正丁醇部位86 g，甲醇部位50 g。2.2  MTT法 取對數(shù)生長期細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后，用培養(yǎng)液稀釋。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 l（含有5 000個/ml

11、腫瘤細(xì)胞）含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，NG108-15細(xì)胞則用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞置37，10%CO2培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入最終濃度為15，30，60，120，240 g/ml提取物的培養(yǎng)液，對照組則加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組4孔，重復(fù)4次。置37，10%CO2培養(yǎng)5 d后，棄去上清液，加入200 l/孔新鮮配置的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入200 l DMSO，振蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為550 nm，參比波長為450 nm測定OD值。2.3  藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率的方法5腫瘤細(xì)胞生長抑

12、制率（%）=（1-實驗組平均OD值）/對照組平均OD值×100%1         2.4  半數(shù)抑制濃度C50的當(dāng)細(xì)胞生長抑制率與藥物濃度有對數(shù)關(guān)系時，以各個不同藥物的對數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)，求出直線回歸方程，根據(jù)該方程計算出IC50。當(dāng)細(xì)胞生長抑制率與藥物濃度不存在對數(shù)關(guān)系時，采用寇氏法計算IC50。藥物IC50值的公式為：IC50=lg-1Xm-i (p-0.5)。式中Xm：設(shè)計的最大濃度的對數(shù)值；i：相鄰兩組濃度對數(shù)值之差；p：各組生長抑制率之和；0.5：經(jīng)驗常數(shù)

13、。3  結(jié)果3.1  不同濃度提取物對白血病細(xì)胞株L1210的抑制結(jié)果見表1。石油醚部位和醋酸乙酯部位對白血病細(xì)胞株L1210都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度無對數(shù)關(guān)系，故采用寇氏法計算IC50，IC50分別為83.5 g/ml和76.2 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位對白血病細(xì)胞株L1210基本無活性。表1  受試樣品對白血病細(xì)胞株L1210抑制的影響(略)3.2  不同濃度提取物對白血病細(xì)胞株P(guān)388D1的抑制結(jié)果見表2。石油醚部位和醋酸乙酯部位對白血病細(xì)胞株P(guān)388D1都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。

14、細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度無對數(shù)關(guān)系，故采用寇氏法計算IC50。IC50分別為60.8 g/ml和90.1 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位對白血病細(xì)胞株L1210無活性。表2   受試樣品對白血病細(xì)胞株P(guān)388D1抑制的影響（略）3.3  不同濃度提取物對宮頸癌細(xì)胞株Hela的抑制結(jié)果見表3。石油醚部位和醋酸乙酯部位對宮頸癌細(xì)胞株Hela都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度存在對數(shù)關(guān)系，故以曲線回歸法求IC50。IC50分別為39.5g/ml和74.6 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位對宮頸癌細(xì)胞株Hela無活性。表3  受試

15、樣品對宮頸癌細(xì)胞株Hela抑制的影響（略）3.4   不同濃度提取物對人胃癌細(xì)胞株SGC7901的抑制結(jié)果見表4。石油醚部位對人胃癌細(xì)胞株SGC7901有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度存在對數(shù)關(guān)系，故以曲線回歸法求IC50，IC50為78.7 g/ml。醋酸乙酯部位、正丁醇部位和甲醇部位對人胃癌細(xì)胞株SGC7901無活性。表4  受試樣品對人胃癌細(xì)胞株SGC7901的抑制的影響（略）3.5  不同濃度提取物對黑色素瘤細(xì)胞株B16的抑制結(jié)果如表5顯示，醋酸乙酯部位對黑色素瘤細(xì)胞株B16有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正

16、比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度不成對數(shù)關(guān)系，故以寇式法求IC50，IC50為62.0 g/ml。石油醚部位、正丁醇部位和甲醇部位對黑色素瘤細(xì)胞株B16無活性。3.6  不同濃度提取物對神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15的抑制結(jié)果如表6顯示，石油醚部位和醋酸乙酯部位對神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度成對數(shù)關(guān)系，故以曲線回歸法求IC50，它們的的IC50分別為49.4 g/ml和54.9 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位對神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15基本無活性。表5  受試樣品對黑色素瘤細(xì)胞株B16抑制的影響（略）3.

17、7  不同濃度提取物對人肝癌細(xì)胞株Hela7404的抑制結(jié)果見表7。石油醚部位和醋酸乙酯部位對人肝癌細(xì)胞株Hela7404都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度均成對數(shù)關(guān)系，故以曲線回歸法求IC50，IC50分別為78.9 g/ml和41.5 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位對人肝癌細(xì)胞株Hela7404基本無活性。表6  受試樣品對神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15抑制的影響（略）表7  受試樣品對人肝癌細(xì)胞株Hela7404抑制的影響（略）4  討論體外實驗抗腫瘤藥物的篩選方法中，實驗選擇了四氮唑藍(lán)法MTT法。1983年由Mo

18、smann在免疫學(xué)研究中應(yīng)用于鼠淋巴細(xì)胞系研究IL-2等細(xì)胞應(yīng)用于對細(xì)胞存活和增效的影響，而建立MTT方法8，隨后，Denizot和carmichael等進(jìn)一步改進(jìn)并獲得更好的效果，使之運用于人類腫瘤細(xì)胞體外藥敏試驗9,10。表17顯示，青天葵石油醚部位在受試5個劑量（15，30，60，120，240 g/ml）下對白血病細(xì)胞株L1210和P388D1、宮頸癌細(xì)胞株Hela、人胃癌細(xì)胞株SGC7901、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15、人肝癌細(xì)胞株Hela7404等6種瘤株都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比，IC50分別83.5，60.8，39.5，78.7，49.4，78.9 g/ml

19、。青天葵醋酸乙酯部位在受試5個劑量（15，30，60，120，240 g/ml）下對白血病細(xì)胞株L1210和P388D1、宮頸癌細(xì)胞株Hela、黑色素瘤細(xì)胞株B16、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15、人肝癌細(xì)胞株Hela7404等6種瘤株都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比，IC50分別76.2，90.1，74.6，62.0，54.9，41.5 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位對7種腫瘤細(xì)胞都無明顯直接抑制作用。隨著分子腫瘤學(xué)研究的不斷深入，體外抗腫瘤實驗已成為抗腫瘤藥物研發(fā)過程中必不可少的一種方法。該方法具有、快速、高效的優(yōu)點。目前最常用的體外抗腫瘤篩選方法為MTT法。實驗中對青天葵石油醚

20、、醋酸乙酯、正丁醇和甲醇部位，采用MTT法，選用7種腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行抑瘤實驗，以期得到具有較高可信度的體外抗腫瘤活性的有效部位，同時為青天葵的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。青天葵的體外實驗結(jié)果表明，經(jīng)過系統(tǒng)提取分離后，青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有明顯的抑瘤作用。本實驗為青天葵抗腫瘤有效成分的篩選及抗腫瘤作用機理研究，提供了一定的理論依據(jù)。但在體外實驗中對癌細(xì)胞有抑制作用和殺傷作用的藥物，在活體中由于各種綜合因素的作用而不一定具有抗腫瘤作用。因此，還必須對青天葵石油醚和醋酸乙酯部位進(jìn)行體內(nèi)實驗以驗證其有抗腫瘤作用?！尽?#160; 1江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典M.上海:上海技術(shù)出版社,1975:1231.2南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1167.3廣西壯族自治