血管性癡呆大鼠海馬中葛根素低氧誘導因子

1、血管性癡呆大鼠海馬中葛根素低氧誘導因子            免疫組化染色(SP法)及結(jié)果判定  將所取之腦塊自前向后行冠狀切片，片厚3m，梯度乙醇脫蠟至水，3%(體積分數(shù))H2O2室溫孵育40min，微波抗原修復10min，室溫冷卻2h，正常血清封閉40min，分別滴加第一抗體(兔抗大鼠HIF1親合純化抗體，工作濃度為1200；兔抗大鼠EPO單克隆抗體，工作濃度為1200)，4過夜，生物素化二抗室溫孵育40min，加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育30

2、min，DAB顯色5min，蘇木素復染核，脫水、透明、封片。TBS緩沖液分別代替一抗經(jīng)上述步驟染色作空白對照。取假手術(shù)組、2VO組和葛根素組各時間點兩指標(HIF1和EPO)分別經(jīng)SP染色所得的切片各6張，光學顯微鏡下觀察大鼠海馬和大腦皮層的神經(jīng)細胞，以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒的有核細胞為陽性細胞，每張切片高倍鏡(10×40倍)下隨機選擇5個不同的視野(均取自海馬CA1區(qū))，計數(shù)每個視野中1mm×1mm面積中陽性細胞數(shù)，取其平均值。關(guān)鍵詞：葛根素；血管性癡呆；低氧誘導因子1；促紅細胞生成素ABSTRACT: Objective  To observe th

3、e effects of puerarin on the expression of hypoxia inducible factor1and erythropoietin in the hippocampus of vascular dementia rats and to investigate its possible mechanisms. Methods  Rats of experimental group were treated with a permanent bilateral common carotid arteries (CCA) occlusion (2V

4、O) to establish vascular dementia model. Male SD rats were randomly divided into three groups: shamoperated group, 2VO group and puerarin group(twentyfour rats in each group). Rats were evaluated on learningmemory ability by Ytype water maze test. At corresponding time points at 1w, 3w, 6w and 2mon,

5、 the dynamic expression of HIF1 and EPO in CA1 region of hippocampus was determined by immunohistochemical method. Results  The swimming time and error times of rats in 2VO group and puerarin group were significantly increased; but at all time points the rats in puerarin group showed better per

6、formance than those in 2VO group. Both in 2VO group and puerarin group, the number of HIF1 and EPO positive cells in hippocampal CA1 region were much more than that in shamoperated group; but the expression of HIF1 and EPO at each point in puerarin group was distinctly less than that in 2VO group. C

7、onclusion  Puerarin can increase the intracellular oxygen concentration and improve learningmemory ability during cerebral ischemia, and it has definitely protective effects on VD.KEY WORDS: puerarin; vascular dementia; hypoxiainducible factor1; erythropoietin葛根素是從中藥葛根中提取的主要有效成分之一，是一種異黃酮類化合物，具有

8、明確的擴張血管、改善微循環(huán)的作用，已被廣泛應用于心腦血管疾病的治療。低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor1, HIF1)是低氧應答時誘導基因表達和恢復細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個核心調(diào)節(jié)因子。紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)編碼基因是HIF1下游40余種靶基因之一。葛根素對HIF1和EPO在血管性癡呆(vascular dementia, VD)發(fā)生發(fā)展過程中表達的影響及其是否通過HIF1/EPO信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮對VD的保護作用尚未見報道。1  材料與方法1.1  動物分組  健康、雄性SD(SpragueDawley)大

9、鼠72只，體重(280±20)g，鼠齡2-3月(由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)。經(jīng)Y型水迷宮實驗篩選后，隨機平均分為三大組：假手術(shù)組、2VO組和葛根素組，每組再根據(jù)缺血時間血管分離暴露(阻斷)至開胸灌注的時間隨機分為4個小組(每小組6只)：1周組；3周組；6周組；2月組。1.2  主要試劑  葛根素注射液為陜西安康制藥廠生產(chǎn)；HIF1兔抗大鼠親合純化抗體來自武漢博士德生物工程有限公司；EPO兔抗大鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒來自北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3  模型的建立  VD動物模型的

10、制作參照de la Torre等采用的雙側(cè)頸總動脈永久性阻斷法(2VO)進行。0.67mol/L水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠取頸前部正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈(common carotid arteries, CCA)，套以1號手術(shù)線雙重結(jié)扎，逐層縫合。手術(shù)期間嚴密觀察呼吸變化，保證有自主呼吸。假手術(shù)組動物僅分離暴露雙側(cè)CCA而不結(jié)扎；葛根素組于術(shù)前3d至術(shù)后1周，每天給予葛根素注射液100mg/kg腹腔注射，手術(shù)當天于結(jié)扎前1h給藥；癡呆組于相同的時間分別給予等量0.16mol/L氯化鈉溶液腹腔注射。1.4  學習記憶的測定  應用Y型水迷宮實驗進行大鼠

11、學習記憶能力的評估。Y型水迷宮裝置分為一個長臂(長50cm)和兩個短臂(長40cm)，各臂高45cm，寬30cm，長臂為起始區(qū)，其中一個短臂為迷路區(qū)(盲端)，上覆有不透明塑料板，形成暗道，另一短臂為安全區(qū)，裝有平臺(30cm×10cm)，上方有燈光照明。以大鼠自迷宮起始區(qū)游至終點安全臺所需時間和途中進入盲端的錯誤次數(shù)，作為衡量學習、獲得鞏固記憶能力的指標。每只大鼠于測試當天共游迷宮10次，測定學習成績；24h后重復上述過程測定記憶成績。實驗前先行水迷宮實驗，淘汰游泳能力差或智力低下(以游全程時間大于平均成績的3倍以上即t25s作為界點)的大鼠；術(shù)后1周、3周、6周、2月的各時間點的大

12、鼠均于處死前再次行Y型水迷宮實驗測定學習記憶成績。1.5  標本的采集  雙側(cè)CCA分離暴露(結(jié)扎)后1周、3周、6周、2月的各時間點，再次麻醉大鼠，開胸灌注，斷頭取腦，取前囟后3mm至上丘平面間包含海馬的腦組織塊，1.39mol/L多聚甲醛固定、石蠟包埋。1.6  免疫組化染色(SP法)及結(jié)果判定  將所取之腦塊自前向后行冠狀切片，片厚3m，梯度乙醇脫蠟至水，3%(體積分數(shù))H2O2室溫孵育40min，微波抗原修復10min，室溫冷卻2h，正常血清封閉40min，分別滴加第一抗體(兔抗大鼠HIF1親合純化抗體，工作濃度為1200；兔抗大鼠EPO單克隆抗

13、體，工作濃度為1200)，4過夜，生物素化二抗室溫孵育40min，加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育30min，DAB顯色5min，蘇木素復染核，脫水、透明、封片。TBS緩沖液分別代替一抗經(jīng)上述步驟染色作空白對照。取假手術(shù)組、2VO組和葛根素組各時間點兩指標(HIF1和EPO)分別經(jīng)SP染色所得的切片各6張，光學顯微鏡下觀察大鼠海馬和大腦皮層的神經(jīng)細胞，以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒的有核細胞為陽性細胞，每張切片高倍鏡(10×40倍)下隨機選擇5個不同的視野(均取自海馬CA1區(qū))，計數(shù)每個視野中1mm×1mm面積中陽性細胞數(shù)，取其平均值。1.7 

14、統(tǒng)計學處理  實驗數(shù)據(jù)用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，組間比較采用方差分析和t檢驗法，并應用Correlate進行相關(guān)性分析，取P<0.05為顯著性標準。2  結(jié)    果2.1  VD模型制備情況  2VO組死亡4只，葛根素組死亡2只(1只大鼠因術(shù)中損傷迷走神經(jīng)迅速死于呼吸衰竭)，術(shù)后24h內(nèi)，大鼠出現(xiàn)四肢抽搐、翻滾、扭轉(zhuǎn)痙攣后呼吸停止死亡，以上大鼠不列入統(tǒng)計，另隨機選取大鼠補齊；假手術(shù)組大鼠無死亡。結(jié)扎后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)大鼠眼瞼下垂，起初興奮不安，可有共濟失調(diào)，隨后肢體功能活

15、動逐漸恢復，無明顯運動障礙，但自發(fā)活動減少，行動遲緩，性格執(zhí)拗。葛根素組大鼠上述變化較癡呆組明顯改善。假手術(shù)組大鼠較術(shù)前無明顯變化。             2VO組和葛根素每只大鼠斷頭取腦時均再次檢查雙側(cè)CCA結(jié)扎情況，若無絲線滑脫、松解(實驗中發(fā)現(xiàn)所有大鼠雙側(cè)CCA均結(jié)扎完好，造成了有效的腦缺血)，而且其學習記憶成績相對于同時間點假手術(shù)組大鼠明顯降低(P<0.05)，則認為造模成功。2.2  學習記憶能力檢測  游全程所用時間越長，誤入暗道的錯誤

16、次數(shù)越多，說明其學習記憶保持能力越差，提示學習記憶受損越重。缺血1周時，假手術(shù)組、2VO組和葛根素組三組大鼠的學習記憶成績均無明顯差異(P>0.05)；缺血3周、6周、2月時，與假手術(shù)組相比，2VO組和葛根素組的大鼠學習記憶成績均明顯下降(P<0.05)，但葛根素組各時間點學習記憶成績均較2VO組有明顯提高(P<0.05，表1、表2)。表1  不同實驗組大鼠的學習成績（略）表2  不同實驗組大鼠的記憶成績（略）2.3  HIF1和EPO的表達  2VO組和葛根素組各時間點、各大鼠海馬和大腦皮層均可見不同數(shù)量的HIF1表達，以缺血1周時最

17、明顯，此后緩慢下降，但仍處于較高水平，主要是海馬和皮層的錐體細胞，血管內(nèi)皮亦有明顯HIF1陽性細胞分布，胞漿、胞核均有明顯著色(圖1、圖2)。EPO亦于相應時間點明顯表達于2VO組和葛根素組大鼠的海馬各區(qū)和大腦皮層，其蛋白表達隨時間變化的規(guī)律與HIF1大致相同(圖3)，而且在2VO組和葛根素組，HIF1和EPO兩蛋白的表達在P0.01水平上呈顯著正相關(guān)(r2VO=0.953，rPu=0.931)。除神經(jīng)元外，EPO還大量表達于星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和室管膜細胞，主要是胞漿表達(圖4)。假手術(shù)組HIF1和EPO陽性細胞偶見(圖5、圖6)；葛根素組各時間點兩蛋白的表達與2VO組相比明顯減少(表3

18、、表4)。圖1  2VO組1周時海馬CA1區(qū)HIF1的表達（略）圖2  2VO組HIF1在血管內(nèi)皮細胞的表達（略）圖3  2VO組1周時海馬CA1區(qū)EPO的表達（略）圖4  2VO組EPO在室管膜細胞的表達（略）圖5  假手術(shù)組1周時海馬CA1區(qū)HIF1的表達（略）圖6  假手術(shù)組1周時海馬CA1區(qū)EPO的表達（略）表3  不同實驗組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1的陽性細胞數(shù)（略）表4  不同實驗組大鼠海馬CA1區(qū)EPO的陽性細胞數(shù)（略）2.4  大鼠學習記憶能力與HIF1、EPO陽性細胞數(shù)的關(guān)系 

19、2VO組和葛根素組大鼠兩蛋白表達與學習記憶能力在P0.01水平上呈顯著相關(guān)(表5)。假手術(shù)組兩蛋白表達與大鼠學習記憶能力均無相關(guān)性。表5  HIF1和EPO的表達與大鼠學習記憶成績的關(guān)系（略）3  討    論HIF1作為具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的DNA結(jié)合性蛋白質(zhì)因子，對缺氧具有特異感受性。在缺氧條件下，HIF1廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)，通過作用于靶基因的缺氧反應元件調(diào)控相關(guān)基因的表達，引起細胞一系列對缺氧的反應，以保持機體的氧穩(wěn)態(tài)，具有重要的病理生理學意義。HIF1是由和亞基組成的異二聚體，其中亞基受低氧誘導表達，是調(diào)節(jié)HIF1活性的功能亞單位。

20、EPO是一種水溶性、含唾液酸的酸性糖蛋白，除作為造血因子調(diào)節(jié)和維持血液中紅細胞水平外，腦源性EPO還可以通過拮抗興奮性氨基酸毒性、清除自由基、抗炎癥、抗凋亡、提高神經(jīng)突觸傳遞以及類似神經(jīng)營養(yǎng)因子樣作用發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護作用，有助于新生神經(jīng)元的產(chǎn)生和缺損功能的修復。實驗中發(fā)現(xiàn)2VO組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1和EPO陽性細胞數(shù)顯著高于假手術(shù)組，兩種蛋白表達的時間規(guī)律和組織分布呈顯著一致性，并且2VO組兩種蛋白的表達在缺血各時間點與其相應的學習記憶能力在P=0.01水平上呈顯著相關(guān)，從而表明HIF1和EPO參與了VD的發(fā)生發(fā)展過程，并可能通過HIF1/EPO缺氧信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮了保護作用。VD存

21、在的組織、細胞缺氧使HIF1表達大量增加，激活了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HIF1，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄其下游靶基因，主要包括：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth fractor, VEGF)及其受體VEGFR；葡萄糖載體蛋白(glucose trnsporter, GLUT)、腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)和醛縮酶(aldolaseA, ALDA)、丙酮酸激酶M(pyruvate kinase M, PKM)、乳酸脫氫酶A(lactatedehedrogenaseA, LDHA)等糖酵解酶；血紅素加氧酶(hemeoxygenase1, HO1)、誘導型NO

22、合酶(iducible nitricoxide synthase, iNOS)、內(nèi)皮素1(endothelin 1, ET1)；P21、P53、Bcl2、Bax9；胰島素樣生長因子1(insulinlike growing factor 1, IGF1)；腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin,AM)；EPO等40余種蛋白和酶的編碼基因，從而參與調(diào)控血管生成、能量代謝、血管舒縮反應、細胞凋亡與增殖、紅細胞生成、自由基清除、抗興奮性氨基酸毒性等諸多病理過程，此過程也是VD發(fā)生的可能的神經(jīng)生化、血管改變、能量轉(zhuǎn)換機制。葛根素，化學名4,7二羥基8D葡萄糖基異黃酮，是中藥葛根的主要有效成分。本研

23、究從造模后動物的自發(fā)活動、反應速度等一般行為學情況以及大鼠的學習記憶成績等方面直接證實了葛根素對VD具有確切的保護作用。實驗中還發(fā)現(xiàn)葛根素組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1陽性細胞數(shù)顯著低于2VO組，由于細胞內(nèi)氧濃度對HIF1的表達進行著精細的調(diào)節(jié)，隨著細胞內(nèi)氧分壓的下降，HIF1的表達呈指數(shù)增加，所以葛根素組各時間點HIF1表達顯著低于2VO組。這一結(jié)果間接證明了葛根素可以促進缺血腦組織的血流灌注、提高缺血區(qū)氧濃度。我們推測其機制可能與葛根素的以下作用有關(guān)：擴張腦血管，增加血流量，改善腦微循環(huán)；抑制血小板聚集；主要成分為異黃酮，具有雌激素替代效應，抗凋亡，保護神經(jīng)元；鈣拮抗；清除自由基；拮抗谷氨酸等

24、興奮性氨基酸對神經(jīng)細胞的毒性作用；降低血糖；降低血漿血栓素A2/前列環(huán)素水平。雖然葛根素組大鼠海馬CA1區(qū)HIF1和EPO陽性細胞數(shù)介于假手術(shù)組和2VO組之間，但也不能排除葛根素可能是通過上調(diào)保護性因子HIF1發(fā)揮對VD的保護作用，要進一步明確上述保護作用是否與HIFl/EPO低氧信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)還需要進一步研究。本研究從動物行為學和免疫組化陽性物質(zhì)表達方面證實了葛根素在VD發(fā)生發(fā)展過程中對缺血神經(jīng)細胞的保護作用，為臨床上葛根素治療VD提供了有力的依據(jù)。葛根素的這一積極作用，也為應用祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥治療缺血(缺氧性)腦血管病展示了美好的前景。參考文獻：1De la Torre JC, Fortin T, Park GA, et al. Chronic cerebrov