科研訓(xùn)練論文1

1、單位代碼：10226學(xué)號：2009172057分類號： 2009172033 2009172075哈爾濱醫(yī)科大學(xué)七年制學(xué)生基礎(chǔ)階段科研訓(xùn)練論文題 目 ： 聲動力治療巨噬細胞通過促進ATP釋放趨化單核細胞 學(xué)科、專業(yè) ： 病理生理學(xué)教研室 學(xué) 生 姓 名： 曹博然 張翰 趙雪竹 指 導(dǎo) 教 師： 田野 教授 指 導(dǎo) 研 究 生： 孫鑫 郭淑媛 陳海波 二一二年七月目 錄目 錄1中文摘要2Abstract3文獻綜述5前 言12材料與方法13技術(shù)路線15結(jié) 果16討 論19結(jié) 論21致 謝21參考文獻22中文摘要目 的：證明聲動力治療(sonodynamic therapy,SDT)巨噬細胞能夠趨化

2、單核細胞的聚集并探討其機制。方 法：將實驗對象分為對照組、SDT組、ATPase組及SDT-ATPase組。其中對照組為單純THP-1源性巨噬細胞，而SDT組是在對照組基礎(chǔ)上加入終濃度為15g/ml的5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid, ALA），孵育2小時后接受聲動力治療。ATPase組及SDT-ATPase組則是分別在對照組和SDT組基礎(chǔ)上加入ATPase。將實驗對象離心后取其細胞上清液并分別用transwell方法研究其對單核細胞的趨化作用；將實驗對象分為對照組、SDT組、zVAD-fmk組及SDT-zVAD組。其中對照組為單純THP-1源性巨噬細胞，SDT組是在

3、對照組基礎(chǔ)上加入 ALA，孵育2小時后接受聲動力治療。zVAD-fmk組及SDT-zVAD組則是分別在對照組和SDT組基礎(chǔ)上加入N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)。將實驗對象離心后，分別用熒光素酶方法檢測細胞上清及細胞內(nèi)ATP量的變化。結(jié) 果：用transwell方法研究聲動力治療后的細胞上清對單核細胞的趨化作用時，從募集的單核細胞數(shù)量來看，聲動力治療組明顯高于對照組（p<0.05），加入ATPase并進行聲動力治療組與聲動力治療組相比顯著降低，對照組與ATPase組無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；用熒光素酶方法，檢測聲動力治療巨噬細胞后及加入

4、凋亡抑制劑后細胞上清及細胞內(nèi)ATP量的變化得出：聲動力治療組明顯高于對照組，約為其3倍（p<0.05）；加入zVAD-fmk并進行聲動力治療組較聲動力組顯著降低；對照組與zVAD-fmk無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。 結(jié) 論：聲動力治療巨噬細胞通過促進凋亡相關(guān)的ATP釋放趨化單核細胞 關(guān)鍵詞：ATP 動脈粥樣硬化 聲動力療法 巨噬細胞AbstractPurpose: This paper is designed to investigate the effects of monocytes recruitment after sonodynamic therapy and delv

5、e into its mechanism.Methods: The subjects were divided into four groups: The control group,the SDT group, the ATPase group and the SDT-ATPase group.The control group merely contains THP-1 derived macrophages.The SDT one,containing macrophages and sonosensitizer ALA ,was incubated with fresh medium

6、for 6 h before being exposed to pulse ultrasound irradiation. The ATPase group was a mixture of the control group and ATPase. Similarly,the SDT-ATPase group , was comprised of the SDT group and ATPase. Cell-free supernatants from each group were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes

7、in a transwell migration assay.For a further study of ATP concentrations changes, we use another four groups of subjects: The control group(macrophages alone),the SDT group, the zVAD-fmk group(added caspase-inhibitor zAVD-fmk ) and the SDT-zAVD group（like the SDT group pretreated with zAVD-fmk）.Supe

8、rnatants and cell debris after high speed centrifugation from these four groups were investigated respectively.Results: Cell-free supernatants with SDT were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay. The SDT group induced an approximately sixfold greater re

9、cruitment of monocytes than the control group did(p<0.05), while the monocytes migration of the SDT-ATPase group decreased significantly compared to the SDT group.Besides, there was no statistic difference between the control group and the ATPase group(p>0.05). Luminometer was used to measure

10、the change of ATP content.The ATP concentration of the SDT group was increased about therefold in comparison with the control group (p<0.05),and the SDT-zAVD group had a distinct decrease compared with the SDT group. The control group and the zVAD-fmk group showed no statistic difference(p>0.0

11、5).Conclusions: This study demonstrates that SDT could induce the recruitment of monocytes by promoting the release of ATP in THP-1 macrophages via caspase-dependent pathway .Key words: ATP, atherosclerosis, sonodynamic therapy, macrophages文獻綜述 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種多因性疾病，近年來，盡管AS的診斷與治療有了長足的進

12、步，但人們對其病因?qū)W的認識仍然不足。既往和晚近提出的AS發(fā)病學(xué)說，如血栓形成學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、單克隆學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說、剪切應(yīng)力學(xué)說、同型半胱氨酸學(xué)說、精氨酸學(xué)說、內(nèi)皮功能紊亂學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等都不足以完全解釋AS的發(fā)病基礎(chǔ)1。近年來的基礎(chǔ)研究與臨床研究結(jié)果提示，AS炎癥學(xué)說應(yīng)重新受到重視。有充分的證據(jù)顯示，在AS性疾病的不同臨床表現(xiàn)形式中，炎癥參與其發(fā)生和發(fā)展的所有環(huán)節(jié)2。這一發(fā)現(xiàn)，為臨床治療AS提供了理論依據(jù)及研發(fā)新藥提供了新思路。1. 巨噬細胞凋亡與動脈粥樣硬化近年的研究表明，動脈粥樣硬化病灶內(nèi)脂質(zhì)中心的大小、炎細胞尤其是巨噬細胞的數(shù)量、纖維帽的厚薄及新生血管的多少是決定斑塊穩(wěn)定與否

13、的最主要的因素，而巨噬細胞則通過對斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量、炎癥反應(yīng)、纖維成分的降解及新血管形成等方面來影響動脈粥樣硬化病變的進展，從脂質(zhì)條紋的發(fā)生到最終斑塊破裂和血栓形成，巨噬細胞在動脈粥樣硬化的所有階段都起著極其重要的作用。1.1巨噬細胞凋亡在動脈粥樣硬化不同病變階段的機制及作用近年來，細胞凋亡在動脈粥樣硬化的形成和進展中的作用日漸成為研究熱點，斑塊破裂伴血栓形成是造成動脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因，而大量的細胞凋亡直接造成斑塊不穩(wěn)定3，凋亡過度是不穩(wěn)定斑塊的明顯特征。據(jù)相關(guān)報道，在斑塊的不同區(qū)域凋亡率具有一定的差別，富含巨噬細胞區(qū)細胞凋亡通常要高于其他區(qū)域4。斑塊的“肩部”最容易發(fā)生破裂，纖維

14、帽薄，含有大量激活的巨噬細胞，并存在凋亡殘體及許多內(nèi)含凋亡細胞的巨噬細胞和淋巴細胞，凋亡細胞和凋亡殘體對巨噬細胞具有強烈的化學(xué)趨化活性，而巨噬細胞本身也遭受細胞凋亡所釋放的細胞因子的影響而發(fā)生凋亡。巨噬細胞的吞噬作用在動脈粥樣硬化不同的病變階段有著很大的差異，所以在病變早期和晚期其凋亡對動脈粥樣硬化的影響是不同的。在病變早期，巨噬細胞吞噬功能很強，主要針對脂蛋白，也可有效清除凋亡細胞，其表達的TG2不但能促進凋亡細胞的清除，而且能限制活體內(nèi)動脈粥樣硬化病變的大小5，因此，動脈粥樣硬化早期巨噬細胞凋亡可減少病變成分而抑制病變進展6。巨噬細胞能表達多種清道夫受體(scavenger recepto

15、r, SR)，包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及SR-E(LOX-1)等，它遷入內(nèi)膜后能通過其表面的SR攝取氧化修飾后的脂蛋白，絕大多數(shù)脂蛋白被轉(zhuǎn)運到溶酶體中消化并降解為氨基酸和游離膽固醇，過多的游離膽固醇以膽固醇酯的形式儲存在胞質(zhì)里，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?。粥樣壞死中心的形成與泡沫細胞的聚集和凋亡密切相關(guān)。研究表明，斑塊脂質(zhì)中心有巨噬細胞抗體CD68的表達，說明壞死物中有巨噬細胞的殘片，這也間接支持粥樣壞死中心是在泡沫細胞聚集凋亡的基礎(chǔ)上形成的。而且，斑塊中的脂質(zhì)越多，其纖維帽中的巨噬細胞及T淋巴細胞也越多，說明粥樣壞死可能在單核細胞向內(nèi)膜遷入過程中起一定的促進作用。在成熟病變中，

16、吞噬細胞吞噬血小板、紅細胞、凋亡細胞及脂蛋白，其中對凋亡細胞的吞噬有利于斑塊的穩(wěn)定，清除凋亡細胞的能力可能對急性粥樣血栓性臨床事件起決定作用6。但晚期病變中，許多因素可引起吞噬細胞清除凋亡細胞的功能受損，導(dǎo)致斑塊內(nèi)壞死、炎癥及血栓形成8。斑塊中細胞大量凋亡不僅直接造成脂質(zhì)中細胞數(shù)量的減少，而且由于巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡后形成的凋亡物質(zhì)難以清除，發(fā)生繼發(fā)性壞死和炎癥反應(yīng)，細胞膜完整性破壞，脂質(zhì)為主的胞漿內(nèi)容物釋放后堆積形成脂質(zhì)池，從而促進斑塊脂質(zhì)中心的形成并逐漸增大。因此，在動脈粥樣硬化晚期，巨噬細胞的凋亡對斑塊的穩(wěn)定是不利的。加強巨噬細胞整體的吞噬功能并非完全有益，然而選擇性加強其對凋亡細胞

17、的攝取，可能有助于動脈粥樣硬化病變的抑制。1.2斑塊中巨噬細胞凋亡與血管平滑肌細胞凋亡的相互關(guān)系在動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞和巨噬細胞都經(jīng)歷著凋亡與壞死，而凋亡占主導(dǎo)地位。血管平滑肌細胞分散于粥樣病灶內(nèi)皮下纖維部分及斑塊纖維帽深部中膜的下層，而巨噬細胞成簇分布于內(nèi)皮下、富含脂質(zhì)的病灶中心和纖維帽的肩部。因此，平滑肌細胞源性泡沫細胞的凋亡主要發(fā)生在纖維區(qū)，而巨噬細胞源性泡沫細胞的凋亡主要發(fā)生在病變的脂質(zhì)核心處，后者比前者更易發(fā)生凋亡，特別是在脂質(zhì)核內(nèi)和脂質(zhì)核周圍，在脂質(zhì)核的非細胞部分可發(fā)現(xiàn)其凋亡殘留物。平滑肌細胞凋亡和巨噬細胞凋亡對動脈粥樣硬化病變的意義不同，在斑塊易損部位平滑肌細胞凋

18、亡能引起纖維帽的強度減弱，平滑肌細胞凋亡只是斑塊破裂的一個征兆，并非會直接導(dǎo)致斑塊破裂，平滑肌細胞凋亡不可能通過纖維帽變薄來促進斑塊破裂9。有研究報道，巨噬細胞分泌的Fas配體可誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡10，而血管平滑肌細胞凋亡也可增加巨噬細胞凋亡，由于這能減少巨噬細胞因過度表達基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)而對細胞外基質(zhì)的破壞，所以有利于斑塊的穩(wěn)定11。1.3巨噬細胞與動脈粥樣硬化的治療動脈粥樣硬化是多因素作用的復(fù)雜病變，在其發(fā)生發(fā)展中巨噬細胞有著重要的作用，抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集、減輕炎癥反應(yīng)，以及選擇性調(diào)控其凋亡程序?qū)⒊蔀閯用}粥樣硬化新的有效的治

19、療手段。目前臨床上已有多種對抗動脈粥樣硬化的治療方法，如降脂治療、他汀類藥物的應(yīng)用及血管源性細胞活素療法等，都直接或間接地影響著巨噬細胞的凋亡。相信，隨著蛋白組學(xué)和基因芯片等技術(shù)的逐步完善，我們將會對動脈粥樣硬化中巨噬細胞的凋亡進行更有利的調(diào)控，從而使動脈粥樣硬化有更好更廣闊的臨床治療前景。 2. 聲動力治療 2.1聲動力治療的概況 1989年國際超聲學(xué)會議上，日本學(xué)者Umemura S首次提出了SDT這一概念。SDT是指對腫瘤患者靜脈注射聲敏劑后，應(yīng)用一定頻率和強度超聲作用于腫瘤部位，使聚集在腫瘤部位聲敏劑產(chǎn)生抗腫瘤因子從而對腫瘤細胞進行殺傷，抑制腫瘤的進一步生長。SDT有其獨特的優(yōu)越性：無

20、創(chuàng)性、超聲治療裝置簡單易操作、靶向治療、特異性強、副作用小。 2.2聲動力治療的機制SDT作用機制目前仍不清楚，主要的有超聲空化效應(yīng)、自由基理論、單線態(tài)氧機制等。 2.2.1超聲空化效應(yīng)超聲空化效應(yīng)是指液體中的微小氣泡(空穴) 在聲波作用下所發(fā)生的振蕩、擴大、收縮乃至崩潰等一系列動力學(xué)過程，從而產(chǎn)生如化學(xué)反應(yīng)、發(fā)光、次諧波等現(xiàn)象。 2.2.2自由基理論自由基理論認為由于超聲的空化作用激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑，通過直接熱分解弱鍵或與水熱分解形成的·H 和·OH 反應(yīng)產(chǎn)生光敏劑來源的自由基，自由基與O2 反應(yīng)形成烷氧自由基和過氧基對有機溶液中的有機分子反應(yīng)活性低,更容易到達靶

21、細胞而發(fā)揮作用14。2.2.3單線態(tài)氧機制超聲過程中超聲空化導(dǎo)致聲致發(fā)光，光激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑分子而產(chǎn)生單線態(tài)氧。 O2 具有細胞毒性作用，其較大的擴散半徑,能穿透線粒體膜,參與電子傳遞和氧化作用；能穿透核膜，造成DNA 的損傷；導(dǎo)致胞膜脂質(zhì)過氧化而殺傷細胞等。2.3聲敏劑目前研究中所使用的聲敏劑主要分為三類15：卟啉類化合物、抗炎藥物、抗癌癥藥物。理想的聲敏劑不但要求化學(xué)純性、有效的聲敏化作用，還要對靶組織有較好的選擇性，對人體毒副作用小，可以迅速的從體內(nèi)排除等，目前認為較好的聲敏劑仍是以卟啉類為主。卟啉類化合物作為聲敏劑用于臨床診斷和治療惡性腫瘤已有20多年，其能在腫瘤部位聚集，卟

22、啉由通過超聲產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移給電子而激發(fā)，產(chǎn)生具有細胞毒性的自由基。ALA 屬于第二代光敏劑。與其他光敏劑相比，具有光毒性副作用小，用藥后避光時間短，滲透性好，對組織深層病變的療效和選擇性更佳等優(yōu)點，成為目前光動力治療領(lǐng)域研究的方向和熱點。ALA是一簡單的五碳化合物，多以鹽酸鹽形式存在。分子式為C5H9NO3·HCl，為白色或微黃色針狀結(jié)晶或粉末， 能溶于水和乙醇，極微溶于乙醚和乙酸乙酯。它是人體血紅素代謝的內(nèi)源性前體物質(zhì)， 體內(nèi)代謝途徑見圖116。ALA在各種酶的激活下生成原卟啉(Pp)，原卟啉是血紅素內(nèi)源性合成代謝途徑中的一種前體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖222所示。細胞內(nèi)的Pp是一種很強的

23、光敏物質(zhì)，最大吸收峰值位于630 nm，光敏毒副反應(yīng)小，是重要的光動力治療藥物。Pp是一種非常有效的光敏劑，它在一定波長的光照射下，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， 產(chǎn)生單重態(tài)氧和氧化物， 引起細胞膜、線粒體和核酸的損傷，使病變細胞壞死、凋亡，從而起到治療疾病的作用17。圖1 ALA體內(nèi)代謝途徑Fig1.The metabolic pathway of ALA in vivoB圖2. 聲敏劑分子結(jié)構(gòu) A. ALA B. 原卟啉IXFig. 2 Molecular structure of sonosensor A. ALA B.protoporphyrin IX A2.4聲動力治療與動脈粥樣硬化斑塊 1989

24、年Umemura 等通過在體和細胞的實驗研究表明，血卟啉介導(dǎo)的超聲治療比單純的超聲誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死明顯增多，由此首次提出了聲動力治療的概念18。其機理可能是主要地與超聲的空化作用激活聚集在癌組織的血卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧，引起病變組織細胞的壞死和凋亡。2002年Arakawa K等研究了聲動力治療用于兔股動脈置入支架后再狹窄預(yù)防作用19，而聲動力治療對動脈粥樣硬化斑塊的作用的研究目前國內(nèi)外未見報道。 3. ATP 三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是一種核苷酸，作為細胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學(xué)能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。 3.1 機體內(nèi)AT

25、P生物學(xué)作用 三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是一種核苷酸，作為細胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學(xué)能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。人體中ATP的總量只有大約0.1摩爾。人體每天的能量需要水解100-150摩爾的ATP即相當(dāng)于50至75千克。這意味著人一天將要分解掉相當(dāng)于他體重的ATP。所以每個ATP分子每天要被重復(fù)利用1000-1500次。ATP不能被儲存，因為ATP的合成后必須在短時間內(nèi)被消耗。 ATP還可作為能源物質(zhì)。肌肉中儲藏著多種能源物質(zhì)，主要有三磷酸腺苷（ATP）、磷酸肌酸（CP）、肌糖原、脂肪等。 ATP亦參與能源物質(zhì)的代謝：（一

26、）無氧代謝：劇烈運動時，體內(nèi)處于暫時缺氧狀態(tài)， 在缺氧狀態(tài)下體內(nèi)能源物質(zhì)的代謝過程，稱為無氧代謝。它包括以下兩個供能系統(tǒng)。 非乳酸能（ATPCP）系統(tǒng)一般可維持10秒肌肉活動 無氧代謝 乳酸能系統(tǒng)一般可維持13分的肌肉活動 非乳酸能（ATPCP）系統(tǒng)和乳酸能系統(tǒng)是從事短時間、 劇烈運動肌肉供能的主要方式。ATP釋放能量供肌肉收縮的時間僅為13秒， 要靠CP分解提供能量，但肌肉中CP的含量也只能夠供ATP合成后 分解的能量維持68秒肌肉收縮的時間。因此， 進行10秒以內(nèi)的快速活動主要靠ATPCP系統(tǒng)供給肌肉收縮時的能量。 乳酸能系統(tǒng)是持續(xù)進行劇烈運動時，肌肉內(nèi)的肌糖元在缺氧狀態(tài)下進行酵解， 經(jīng)過

27、一系列化學(xué)反應(yīng)，最終在體內(nèi)產(chǎn)生乳酸，同時釋放能量供肌肉收縮。 這一代謝過程，可供13分左右肌肉收縮的時間。 (二)有氧代謝：是在氧充足的條件下，肌糖元或脂肪徹底氧化分解，最終生成二氧化碳(Co2)和水(H2O)， 同時釋放大量的分解代謝，稱為有氧氧化系統(tǒng)。 3.2 ATP與“find-me”信號 人體內(nèi)每一天都會更新數(shù)以億計的細胞，而這種快速的、有效地、免疫的清除死亡細胞的方式需要通過吞噬細胞選擇性識別、吞噬凋亡細胞來實現(xiàn)。近期研究表明一類由凋亡細胞釋放的可溶性介質(zhì)在趨化吞噬細胞中起到了重要作用，而這種介質(zhì)我們稱之為“find-me”信號。這些信號包括溶血磷脂酰膽堿、趨化因子、ATP、UTP、

28、S1p等等。其中ATP等確認可以在體內(nèi)環(huán)境下，起到對單核細胞的吸引作用，因此“find-me”信號這一概念證實了凋亡細胞確實對趨化吞噬細胞有積極地作用12。3.3 ATP與caspase凋亡細胞釋放核苷酸依賴于caspase途徑的調(diào)節(jié)功能。在誘導(dǎo)細胞凋亡之前加入caspase抑制劑zVAD-fmk后所取上清液不能夠誘導(dǎo)單核細胞聚集，證明凋亡細胞釋放的ATP依賴于caspase途徑并受其調(diào)節(jié)13。 前 言動脈粥樣硬化是一種與多種危險因素有關(guān)的復(fù)雜疾病，炎癥是其發(fā)生發(fā)展重要的病理生理機制之一，炎癥細胞在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)大量浸潤會導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定，而不穩(wěn)定斑塊的破裂恰恰是許多急性心血管事件的觸發(fā)點

29、。聲動力治療是通過超聲誘導(dǎo)聲敏劑來殺傷細胞的新方法，但是在聲動力治療巨噬細胞后死亡的巨噬細胞及斑塊內(nèi)堆積的脂質(zhì)需要趨化更多的單核細胞進入斑塊進行清除，才能達到改善斑塊內(nèi)的炎癥環(huán)境的目的。本研究用transwell方法證明聲動力治療后的巨噬細胞上清能夠趨化單核細胞，而且這種趨化能夠被ATP酶部分的抑制。用熒光素酶法，證明聲動力治療巨噬細胞后細胞內(nèi)及釋放到上清中的ATP增多，而在抑制了caspase途徑凋亡后，這種增多的趨勢減弱。本研究驗證了聲動力治療巨噬細胞能夠趨化單核細胞，并探討了ATP在趨化過程中的作用，對聲動力治療動脈粥樣硬化的機制進行了有益的探索，并為動脈粥樣硬化的治療提示了一個可能的新

30、方向。材料與方法1. 實驗對象THP-1,人急性單核細胞白血病細胞系， 中科院上海細胞庫2. 試劑與儀器2.1主要試劑 5-氨基酮戊酸（ALA） 天豐生物科技有限公司，西安牛胎血清，RMPI1640培養(yǎng)基Hyclone化學(xué)公司，北京青霉素G，鏈霉素 Beyotime生物技術(shù)，江蘇12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽（PMA） Darmstad公司，德國ATP檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司， 上海ATP酶 碧云天生物技術(shù)有限公司，上海臺盼藍 碧云天生物技術(shù)有限公司， 上海N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)BioVision公司，美國2.2主要儀器Trans

31、well Corning公司，美國Luminometer Thermo 公司，美國3.5cm細胞培養(yǎng)皿 Corning公司，美國IX 71型熒光顯微鏡 Olympus公司，日本3. 實驗方法3.1 細胞培養(yǎng)THP-1（人急性單核白血病細胞系）作為實驗用細胞系。使用添加有10%胎牛血清和50g/ml的青霉素G-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基孵育THP-1細胞。將培養(yǎng)基保存在37、含5%CO2和95%空氣的保濕孵育器內(nèi)，當(dāng)發(fā)生聚集時進行傳代培養(yǎng)。實驗時，將細胞以每孔1x105的數(shù)目植入3.5cm細胞培養(yǎng)皿，并加入添加有濃度為10g/ml PMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時即成為巨噬細胞。3.2 SDT治療

32、向3.5cm培養(yǎng)皿內(nèi)的巨噬細胞加入終濃度為15g/ml的ALA，孵育2小時后，用頻率為1MHz，強度為0.8W/cm2的超聲輻照5 min,之后以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩次，加入無血清細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3.3 Transwell取SDT后6小時細胞上清、對照組細胞上清、ATPase組及SDT-ATPase組細胞上清，分別加入transwell板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為106/ml的單核細胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，對下層細胞進行臺盼藍染色，用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細胞數(shù)。3.4 熒光素酶法檢測細胞上清及細胞內(nèi)ATP 取SDT后20min、對照組、zVAD-f

33、mk組及SDT&zVAd-fmk 組細胞上清及細胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測工作液當(dāng)中，反應(yīng)10s后使用luminometer分別檢測細胞上清液及胞內(nèi)ATP含量。4. 統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P 0.05 為差異有意義。技術(shù)路線THP-1巨噬細胞細胞裂解產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶細胞上清液LuminometerSDT組SDT -zVAD組對照組THP-1 巨噬細胞對照組 SDT- ATPase組 ATPaseATPase細胞上清液 ATP酶組SDT組Transwell zVAD-fmk組結(jié) 果1. 培養(yǎng)THP-1單核細胞并

34、將其誘導(dǎo)為巨噬細胞，見圖3 A B圖3 A THP-1單核細胞 B 巨噬細胞 （200X） 2. Transwell方法測定細胞上清液對單核細胞趨化作用，見圖4 A B C圖4 A Transwell實驗?zāi)Ｊ綀D B 用光學(xué)顯微鏡觀察募集的臺盼藍染色后的單核細胞，并計數(shù) C 細胞遷移數(shù) （*：P<0.05;#：P>0.05）從募集的單核細胞數(shù)量來看，聲動力治療組明顯高于對照組，P<0.05；加入ATPase并進行聲動力治療組與聲動力治療組相比顯著降低，對照組與ATPase組無統(tǒng)計學(xué)差異。3 熒光素酶法測定上清及細胞內(nèi)ATP含量，見圖5AB圖5 A ATP濃度與熒光強度標準曲線

35、B 各組ATP濃度(*:P<0.05;#:P>0.05)聲動力治療后的ATP濃度明顯高于對照組，約為其3倍；加入zVAD-fmk并進行聲動力治療組較聲動力組顯著降低；對照組與zVAD-fmk無統(tǒng)計學(xué)差異；SDT-zVAD組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。BA DC 討論動脈粥樣硬化目前已經(jīng)成為了全球范圍內(nèi)，人類健康的嚴重威脅20,21。巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致易損斑塊破裂的主要因素22，因此在動脈粥樣硬化進展中對巨噬細胞積極性干預(yù)，對于預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生具有非常重要的臨床意義。有研究認為，在斑塊早期，因單核吞噬系統(tǒng)對凋亡巨噬細胞清除能力正常，不會出現(xiàn)繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)和壞死；而隨著病

36、變的進展，單核吞噬系統(tǒng)對凋亡壞死物的吞噬清除功能發(fā)生障礙23，導(dǎo)致斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，脂質(zhì)壞死核心擴大，誘發(fā)斑塊破裂、血栓形成，引發(fā)急性心血管事件。在這個過程中，凋亡細胞釋放的一系列信號，包括“find-me”、“keep-out” 、“dont-eat-me”和“come-get-me”信號等，能夠調(diào)節(jié)單核性吞噬細胞的趨化活性和吞噬功能。目前有研究表明，凋亡細胞釋放的核苷酸可以作為一種“find-me”信號參與對單核性吞噬細胞的募集13。為了驗證SDT治療巨噬細胞后對單核細胞趨化的效果以及凋亡細胞釋放的核苷酸作為“find-me”信號的趨化功能，我們進行了一系列實驗。首先，我們采用trans

37、well 趨化性實驗證明聲動力治療后的凋亡巨噬細胞能夠趨化單核性吞噬細胞，并且初步驗證核苷酸能夠作為一種“find-me”信號（從實驗室現(xiàn)有藥品及可行性出發(fā)，我們初步選定ATP作為驗證對象）。取SDT后6小時細胞上清、對照組細胞上清、ATPase組及SDT-ATPase組，分別加入transwell板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為106/ml的單核細胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，對下層細胞進行臺盼藍染色，用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細胞數(shù)。SDT組較對照組單核細胞數(shù)顯著增加。此實驗結(jié)果證實聲動力治療后的凋亡巨噬細胞能夠趨化單核細胞的聚集。而SDT-ATPase組較對照組顯著下

38、降說明ATP可能作為一種“find-me”信號在凋亡巨噬細胞趨化單核細胞的過程中起到一定的作用。 為進一步驗證ATP為凋亡細胞釋放的一種“find-me”信號，我們使用luminometer測定聲動力治療后ATP濃度。取SDT后20min、對照組、zVAD-fmk組及SDT-zVAd 組細胞上清及細胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測工作液當(dāng)中，反應(yīng)10s后使用luminometer分別檢測細胞上清液及胞內(nèi)ATP含量。SDT組明顯高于對照組，而SDT-zVAd組較SDT組顯著降低。本實驗證明聲動力治療后的凋亡巨噬細胞促進ATP的釋放，從而趨化單核細胞的聚集；而且ATP的釋放與caspase途徑

39、依賴的凋亡有關(guān)。 綜上所述，本實驗證明了聲動力治療巨噬細胞通過促進ATP釋放趨化單核細胞，從而為聲動力療法治療動脈粥樣硬化的機制進行了有益的探索，對聲動力治療動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用起到了推動作用。結(jié)論1. 聲動力治療巨噬細胞通過促進ATP釋放趨化單核細胞聚集。2. 聲動力治療巨噬細胞后ATP釋放增加依賴于caspase途徑的凋亡。致謝在七年制基礎(chǔ)科研訓(xùn)練即將完成之際，首先向我們的指導(dǎo)教師田野教授表示最衷心的謝意！本論文是在田老師的細心指導(dǎo)下完成的，在課題設(shè)計，實驗進行和結(jié)果分析的整個過程中處處都凝聚著老師的心血。他獨特的思維方式，嚴謹?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，執(zhí)著的事業(yè)追求和崇高的敬業(yè)精神以及對學(xué)生的嚴格要

40、求和細心關(guān)懷令我們受益終生，他的人格魅力也令我們難忘，所有的這些也將成為我們今后做人做事的準則。特別感謝孫鑫師兄、郭淑媛師姐、陳海波師兄在課題設(shè)計和實驗過程中給予的悉心指導(dǎo)和無私幫助，在實驗方面的大力支持，在實驗中給予的意見和建議，使我們受到很大的啟發(fā)，為實驗的順利進行打下了良好的基礎(chǔ)。感謝本教研室的劉暢、旦菊花、姚劍挺、田芳等師兄師姐在實驗上對我的支持。感謝同組七年制的鄭子玲、黃宇航、馬偉康同學(xué)，在一起為了實驗而奮斗的日子里，我們一起收獲了成功的喜悅、拼搏的艱辛，這段難忘的時光，我們結(jié)下了深厚的友誼，這些都是我們終生的財富。感謝哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室為我們提供了一個良好的科研環(huán)境，這里

41、，不僅培養(yǎng)了我們的科研能力、創(chuàng)新思維，也增強了我們的獨立性和自信心，同時，也讓我們學(xué)到了書本上學(xué)不到的知識，這是一筆難得的人生財富，將陪伴我們在以后的事業(yè)中，勇往直前。衷心地祝愿病理生理教研室的全體老師和同學(xué)工作順利，身體健康！祝愿病理生理教研室永遠輝煌！最后，感謝哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制的所有同學(xué)在日常學(xué)習(xí)生活中對我們的幫助和支持！參考文獻1.LI JJ，F(xiàn)ANG C HAtheroscleritis is a more rational term for the pathological entity currently known as atherosclerosisJMed Hyp

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