第五節(jié)食品中維生素類(lèi)分析

1、第五節(jié)食品中維生素類(lèi)分析一、水溶性維生素類(lèi)的測(cè)定（一）理化性質(zhì) 水溶性維生素都易溶于水，不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在加熱情況下，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響，如維生素C對(duì)氧、銅離子敏感，易被氧化。 所以測(cè)定水溶性維生素一般都在酸性溶液中進(jìn)行前處理。 （二）維生素B族的測(cè)定 維生素B1、B2通常采用稀鹽酸水解，或再經(jīng)淀粉酶、木瓜蛋白酶酶解，使結(jié)合態(tài)維生素游離出來(lái)，再進(jìn)行提取。為了去除雜質(zhì)，可用活性人造浮石、硅鎂吸附劑等進(jìn)行純化處理。1、維生素B1的測(cè)定 （1）硫色素?zé)晒夥ǎ簢?guó)標(biāo)法。

2、原理：硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中能被氧化成一種強(qiáng)藍(lán)色熒光物質(zhì)噻嘧色素（硫色素）。硫色素在紫外線(xiàn)照射下，發(fā)出熒光，其強(qiáng)度與硫色素濃度成正比，也即與溶液中硫胺素含量成正比。 激發(fā)波長(zhǎng)365nm；發(fā)射波長(zhǎng)435nm。 樣品提?。簩?duì)于一般樣品、高蛋白樣品、淀粉質(zhì)樣品處理方法不同，如樣品中所含雜質(zhì)較多，可用柱層析法處理，使硫胺素與雜質(zhì)分離，然后以所得溶液作測(cè)定。操作過(guò)程：試樣勻漿或粉碎，稱(chēng)樣于三角瓶中加稀鹽酸，放入高壓鍋中加熱水解加淀粉酶、蛋白酶酶解，過(guò)濾得提取液將提取液加入已準(zhǔn)備好的鹽基交換柱中，過(guò)柱熱蒸餾水沖洗交換柱，去雜質(zhì)熱酸性氯化鉀過(guò)柱，收集濾液，即為試樣凈化液凈化液分別加入A、B兩個(gè)反應(yīng)瓶避光

3、，A瓶中加入氫氧化鈉溶液，B瓶中加入堿性鐵氰化鉀溶液，振搖15s加10mL正丁醇，同時(shí)振搖1.5min，靜置分層吸去下層堿性溶液，加無(wú)水硫酸鈉使溶液脫水上機(jī)測(cè)定。 （2）高效液相色譜法待測(cè)樣品 色譜方式 檢 測(cè) 器肉及肉制品 正相液相色譜 熒光檢測(cè)器米粉 反相鍵合相色譜 柱后衍生化后 熒光檢測(cè)器食品 離子交換色譜 紫外檢測(cè)器米及米制品 反相離子對(duì)色譜 紫外檢測(cè)器GBGBT5009.84-2003 食品中硫胺素(維生素B1)的測(cè)定.pdf 2、維生素B2的測(cè)定 國(guó)標(biāo)第一法為熒光法，第二法為微生物法。 （1）熒光分光光度法 原理：樣品經(jīng)酸解、酶解處理使核黃素游離出來(lái)，用高錳酸鉀和過(guò)氧化氫氧化雜質(zhì)，

4、再經(jīng)硅鎂吸附劑進(jìn)行柱層析，吸附提取核黃素，最后用洗脫液丙酮冰乙酸水洗脫并收集核黃素。VB2水溶液呈黃綠色熒光，在440nm的激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)處可產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度。 測(cè)定谷物中VB2時(shí)最好在樣品酸解后，加入一定量的淀粉酶，在3540酶解15小時(shí)左右，這樣有利于結(jié)合型的VB2轉(zhuǎn)化成游離型的VB2 。 （2）高效液相色譜法待測(cè)樣品 色譜方式 檢 測(cè) 器食品 反相鍵合相色譜 熒光檢測(cè)器肉及肉制品 正相液相色譜 熒光檢測(cè)器蛋及奶制品 反相鍵合相色譜 紫外檢測(cè)器米及米制品 反相離子對(duì)色譜 紫外檢測(cè)器 3、維生素B5的測(cè)定 國(guó)標(biāo)方法為微生物法。 （1）溴化氰比色法 VB5與溴化氰結(jié)合后可與對(duì)氨基

5、苯乙酮（或其它芳香族胺）作用生成黃色化合物，因而可在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度，求出VB5的含量。 （2）氣相色譜法 煙酸分子具有羥基，不溶于有機(jī)溶劑，不能直接用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定，但煙酸經(jīng)酯化轉(zhuǎn)變成煙酸乙酯或N2基煙酰胺之后，可以用氣相色譜法進(jìn)行分離測(cè)定。 （3）高效液相色譜法 利用酸水解法提取VB5，經(jīng)高效液相色譜分離，測(cè)定。 4、維生素B6的測(cè)定 國(guó)標(biāo)法為微生物法。 （1）熒光分析法 樣品經(jīng)硫酸加壓水解，采用CGS樹(shù)脂的柱層析分離，以氯化鉀的磷酸緩沖液洗脫。洗脫液在二氧化錳和乙醛酸鈉溶液存在下，可使VB6的混合物即吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺一次轉(zhuǎn)化為吡哆醛。吡哆醛在氰化鉀作用下生成強(qiáng)熒光物質(zhì)

6、吡哆醛氰醇衍生物。在激發(fā)波長(zhǎng)355nm，發(fā)射波長(zhǎng)434nm處，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，就可計(jì)算出樣品中VB6的含量。 （2）氣相色譜法 VB6與七氟丁基咪唑反應(yīng)可生成揮發(fā)性的衍生物，該衍生物在氣相色譜中可以很好地分離。最低檢出限10ng。氣相色譜條件：電子捕獲檢測(cè)器；3%SE52，固定相Chromosorb WHPO （3）液相色譜法 樣品水解后上機(jī)測(cè)定。 C18柱熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)290nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm。 5、維生素B12的測(cè)定 （1）比色法 樣品用濃硫酸和高氯酸鉀消化后，樣品中的鈷與M吡啶聯(lián)腙生成鈷的紅色化合物，可以進(jìn)行比色測(cè)定，再?gòu)拟挼暮繐Q算成VB12的含量。注意：樣品中存在游離鈷離

7、子將使測(cè)定結(jié)果偏高，可以預(yù)先用8羥基奎寧氯仿溶液提取，分離除去。 （2）原子吸收分光光度法 維生素B12的分子中含有鈷離子，占VB12的4.35%，采用原子吸收分光光度法可以測(cè)定其鈷含量，再換算成VB12的含量。 樣品預(yù)處理： 樣品用VB12提取液（無(wú)水磷酸氫二鈉1.3g檸檬酸1.2g無(wú)水焦亞硫酸鈉1.0g加水至100ml）提取，濾液中加入EDTA，用氨水調(diào)pH至7，再加入活性炭，振搖，用無(wú)灰濾紙過(guò)濾，VB12被吸附在活性炭上，將活性炭連同濾紙一起在600下灰化完全，用硝酸將殘?jiān)芙?，以原子吸收分光光度法測(cè)定鈷的含量。 從鈷換算為VB12的換算系數(shù)=22.99。GBGBT 5009.217-2

8、008 保健食品中維生素B12的測(cè)定.pdfGBGBT 5009.210-2008 食品中泛酸的測(cè)定.pdfGBGBT 5009.211-2008 食品中葉酸的測(cè)定.pdf文章高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中B族維生素.pdf（三）維生素C的測(cè)定 在食品中VC有三種存在形式：還原型抗壞血酸（2H，氧化）脫氫型抗壞血酸 二酮古洛糖酸。 1、提取方法 食品中的維生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對(duì)維生素C的破壞作用。草酸對(duì)維生素C有很好的穩(wěn)定性能；偏磷酸能沉淀蛋白質(zhì)，澄清提取液，適合于蛋白質(zhì)含量較高的樣品。2、還原型抗壞血酸的測(cè)定 （1）分

9、光光度法 在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍(lán)鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼-2-羥基丁酰內(nèi)酯衍生物。在最大吸收波長(zhǎng)420nm處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。 非蛋白性樣品在乙酸溶液中提取，過(guò)濾后上清液供測(cè)定；蛋白性樣品需再加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，沉淀蛋白質(zhì)。 （2）2,6二氯靛酚滴定法 還原型抗壞血酸可以還原染料2,6二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色，被還原后成無(wú)色溶液。在終點(diǎn)時(shí)，過(guò)量的未被還原的染料在酸性溶液中呈粉紅色，因此，在滴定過(guò)程中當(dāng)溶液從無(wú)色轉(zhuǎn)變成微紅色時(shí)，表示還原型抗壞血酸全部被氧化為脫氫抗壞血酸，此時(shí)即為滴定終點(diǎn)。3、總抗壞血酸的測(cè)定 （1）熒光法： 國(guó)標(biāo)第一法。 樣品中還原型

10、抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成有熒光的喹喔啉衍生物，其熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測(cè)定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。 激發(fā)光波長(zhǎng)338nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm。 當(dāng)食物中含有丙酮酸時(shí)，也與鄰苯二胺反應(yīng)生成一種熒光物質(zhì)，干擾測(cè)定。這時(shí)加入硼酸。硼酸與脫氫抗壞血酸結(jié)合生成硼酸脫氫抗壞血酸螯合物，此螯合物不能與鄰苯二胺反應(yīng)生成熒光物質(zhì)；而硼酸不與丙酮酸反應(yīng)，丙酮酸仍可發(fā)生上述反應(yīng)。因此，加入硼酸后測(cè)出的熒光值即為空白的熒光值。 注意事項(xiàng)： 試樣用偏磷酸-乙酸溶液提?。?活性炭加入量要適量，量過(guò)多，對(duì)抗壞血酸有吸附作用，使結(jié)果偏低；

11、空白氧化液中加入硼酸溶液后需在4 冰箱中放置2-3h，使反應(yīng)完全，否則本底偏高。 （2）2,4二硝基苯肼比色法： 國(guó)標(biāo)第二法。 樣品中VC用草酸提取，活性炭使提取液中還原型抗壞血酸氧化成為脫氫抗壞血酸，然后與2,4二硝基苯肼作用生成紅色的脎。在85硫酸溶液的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色的無(wú)水化合物雙-2,4二硝基苯。最大吸收波長(zhǎng)500nm，吸光度與總抗壞血酸的總量成正比，進(jìn)行定量分析。文章獼猴桃中維生素C的高效液相色譜分析.pdf二、脂溶性維生素類(lèi)的分析測(cè)定（一）理化性質(zhì) 1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。 2、耐酸堿性：維生素A、D對(duì)酸不穩(wěn)定，VE對(duì)酸穩(wěn)定

12、。VA、D對(duì)堿穩(wěn)定，VE對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下也能經(jīng)受堿的煮沸。 3、耐熱性、耐氧化性：VA、D、E耐熱性好；VA、E易氧化，光、熱能促進(jìn)氧化；VD不易被氧化。 根據(jù)上述性質(zhì)，測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常先用皂化法處理樣品，水洗去除類(lèi)脂物。然后用有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素（不皂化物），濃縮后溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲袦y(cè)定。為了防止氧化，常加入抗氧化劑。對(duì)于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。 操作在避光條件下進(jìn)行。 （二）維生素A的測(cè)定 1、比色法 國(guó)標(biāo)第二法。 維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻作用，生成藍(lán)色化合物，在波長(zhǎng)620nm處有特異吸收。 適用于維生素A含量

13、較高的樣品。 該法的主要缺點(diǎn)是生成的藍(lán)色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差，比色測(cè)定必須在6s內(nèi)完成，否則藍(lán)色會(huì)迅速消退，造成極大誤差。 2、高效液相色譜法 國(guó)標(biāo)第一法。 （1）原理： 試樣中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取處理后，將其從不可皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用高效液相色譜C18反相柱將維生素A及維生素E分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定。 內(nèi)標(biāo)物：苯并e芘標(biāo)準(zhǔn)液 流動(dòng)相：甲醇水（982） 紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng)300nm （2）樣品處理： 皂化：準(zhǔn)確稱(chēng)樣于皂化瓶中加無(wú)水乙醇，攪勻加抗壞血酸（抗氧化劑），加苯并e芘標(biāo)準(zhǔn)液（內(nèi)標(biāo)物）加氫氧化鉀（11）于沸水浴回流30min，使皂化完全立即放入冰水中冷卻。

14、提?。涸砘镆迫敕忠郝┒芳右颐烟崛壢ニ畬印?洗滌：用水洗乙醚層，至水層不顯堿性。 濃縮：將乙醚提取液脫水（經(jīng)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾）后移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的球形蒸發(fā)瓶中55 水浴中減壓蒸餾蒸發(fā)瓶中剩余2mL乙醚時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，用氮?dú)獯蹈杉右掖既芙馓崛∥镫x心，上清液供色譜分析。 （三）維生素E的測(cè)定 1、比色法 維生素E與FeCl3反應(yīng)，F(xiàn)e3+被還原成Fe2+，F(xiàn)e2+可與 聯(lián)氮苯發(fā)生顏色反應(yīng)，呈紅色，因此在520nm處測(cè)定吸光度，可定量測(cè)定樣品中VE的含量。 2、GC法 3、HPLC法維生素E測(cè)定的GC分析條件化合物 檢測(cè)器 固定相 檢測(cè)波長(zhǎng) 內(nèi)標(biāo)物生育酚 FID SE30 275nm 十六烷基 棕櫚酸

15、酯生育酚 FID DB5 300nm 膽甾烷膽固醇 （程序升溫，260 300）（四）胡蘿卜素的測(cè)定 1、高效液相色譜法 國(guó)標(biāo)第一法。 試樣中的胡蘿卜素，用石油醚-丙酮（8020）混合液提取，提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，殘?jiān)蒙倭渴兔讶芙?，然后?jīng)三氧化二鋁柱純化，收集洗脫液，用0.45m微孔濾膜過(guò)濾，濾液用C18反相柱進(jìn)行HPLC分析。 流動(dòng)相：甲醇乙腈（9010） 紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng)448nm 2、紙層析法 國(guó)標(biāo)第二法。 試樣經(jīng)過(guò)皂化后，用石油醚提取食品中的胡蘿卜素及其他植物色素，以石油醚為展開(kāi)劑進(jìn)行紙層析，胡蘿卜素極性最小，移動(dòng)速度最快，從而與其他色素分離，剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450nm波長(zhǎng)下定量測(cè)定。（五）維生素D的測(cè)定1、比色法維生素D與三氯化銻在氯仿中產(chǎn)生橙黃色物質(zhì)，于500nm處定量測(cè)定。 2、HPLC法樣品經(jīng)過(guò)抽出脂肪、堿性皂化、乙醚抽提不皂化物以及經(jīng)過(guò)