胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定-

1、胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定王勇,馬武華,鐘 鳴,王可佳(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,廣州510405中圖分類(lèi)號(hào):R614;R743.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-2084(201207-1088-03摘要:目的 建立較理想的S D 大鼠胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法。方法 孕18d(E18S D 大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和機(jī)械分離相結(jié)合的方法進(jìn)行海馬神經(jīng)元的原代無(wú)血清培養(yǎng)。結(jié)果 在體外培養(yǎng)條件下神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征明顯化,并能形成典型的神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論 該培養(yǎng)技術(shù)是海馬神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的理想方法。關(guān)鍵詞:胎鼠;海馬神經(jīng)元;原代培養(yǎng)Primary Cult ure and

2、 Identificat ion of Hippocampal Neuro ns of Fetal Rat Neurons WANG Yong,MA W u-hua,ZHONG Ming,W ANG Ke-jia.(Depar tm ent of Anesthes iology,the Firs t Affliated Hospital of Guang-zhou University of Tr aditional C hines e Medicine,Guangz hou 510405,ChinaAbst rac t:Objective To establish a better pr i

3、mary culture method for the primar y culture for hipocam-pal neur ons of SD fetal ra ts.Met ho ds Trypsin digestion a nd mechanical dissociation wer e a dopted to con-duct monolayer pr imary culture.Res ults Under the culture condition in vitro,fetal rat neurons showed simi-lar for m proper ties to

4、their counter par ts in v ivo and typical nerve fiber net was formed.Conclusion This technique is an ideal tool for culture in vitro for neurons of hippocampal tissue.Key words :Fetal ra t;Hippocampal neurons;Primar y culture海馬是神經(jīng)元高度集中的部位,具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性,在學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)及自主神經(jīng)功能等方面發(fā)揮重要作用。而海馬又是癲癇、缺血/缺氧、神經(jīng)變性疾

5、病的主要病灶。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型是研究神經(jīng)元發(fā)育分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機(jī)制等重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。海馬細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法文獻(xiàn)報(bào)道不一,總體可以分為有血清培養(yǎng)和無(wú)血清培養(yǎng)兩種。有血清培養(yǎng),血清可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分,可以促進(jìn)細(xì)胞的增生和D NA 的合成,但由于血清成分復(fù)雜,對(duì)于要求較高的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果影響較大。無(wú)血清培養(yǎng)步驟簡(jiǎn)便,培養(yǎng)的細(xì)胞活性及生理特性保持良好,具有較大的優(yōu)越性。為了研究中藥對(duì)海馬神經(jīng)元發(fā)育的影響,本課題組采用無(wú)血清培養(yǎng)方法,建立Spra gue-Daw ley(S D大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型,并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定,獲得了一種簡(jiǎn)便可行、易于生長(zhǎng)的培

6、養(yǎng)方法。1 材料與方法1.1 材料免疫組化試劑盒(即用型(武漢博士德生物工程有限公司。配置好的50g/m L 多聚賴(lài)氨酸溶液800L 加入6孔培養(yǎng)板中,輕輕晃動(dòng),使多聚賴(lài)氨酸溶液覆蓋培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶底面,置37,5%CO 2培養(yǎng)箱內(nèi)放置過(guò)夜,吸棄多余的多聚賴(lài)氨酸溶液,并用PBS 輕輕蕩洗兩次,置培養(yǎng)箱中備用。細(xì)胞懸液0.1m L計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果,調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×106個(gè)/mL。按5×1057×105個(gè)/cm2接種于包被好的培養(yǎng)板中,12h內(nèi)禁止晃動(dòng)。酮固定10m in。用PBS液沖洗3遍,3%H2O2(30%雙氧水和純甲醇按19的溶劑比混合封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

7、,室溫下10m in。PBS洗3遍, 0.3%Triton破膜(溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)15min,PBS洗3遍。10%羊血清封閉,室溫10min。吸棄血清(不洗。一抗37反應(yīng)1h (20L NS E+1mL稀釋液;設(shè)空白對(duì)照,以PBS液代替一抗。PBS洗3×5m in,二抗(羊抗兔室溫下18m in,PBS洗3×5min,SABC復(fù)合物37、18min。PBS洗3×5min,DAB顯色(5min。鏡下觀察,自來(lái)水終止。DAB稀釋度(150,蘇木素復(fù)染(3min。95%乙醇脫水,二甲苯透明20m in,中性樹(shù)膠封固。風(fēng)干,鏡下觀察。2 結(jié)果2.1 相

8、差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變海馬神經(jīng)細(xì)胞接種時(shí)呈圓球形,相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)明顯光暈,一般12h開(kāi)始貼壁,呈扁平圓形生長(zhǎng),有小的集落生成。12h后大部分細(xì)胞均已貼壁,呈圓形,周?chē)泄鈺?少數(shù)細(xì)胞伸出一至兩個(gè)突起(圖1-A。24h后突起一般20 40m,生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞透亮勻質(zhì),開(kāi)始鋪展,突起變粗變長(zhǎng),并出現(xiàn)末端分支,同時(shí)由于有部分已貼壁的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的死亡,背景出現(xiàn)許多細(xì)小的球形體(圖1-A。3d后突起進(jìn)一步增多并形成稀疏的網(wǎng)狀,胞體逐漸長(zhǎng)大,光暈良好,軸突和樹(shù)突逐漸延伸,鄰近神經(jīng)細(xì)胞突觸之間形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖1-C。實(shí)驗(yàn)中選取培養(yǎng)79d的神經(jīng)細(xì)胞,此時(shí)細(xì)胞呈錐體狀或多極

9、形,胞體豐滿(mǎn),胞核大,僅見(jiàn)極少胞質(zhì),胞質(zhì)透亮,胞周光暈明顯,立體感強(qiáng),有很強(qiáng)的折光性,胞體突起較長(zhǎng)且較完整,細(xì)胞核呈圓形或卵圓形,常偏于胞體一側(cè),內(nèi)有12個(gè)核仁,神經(jīng)細(xì)胞突起相互交織成網(wǎng)狀,神經(jīng)細(xì)胞的純度高,幾乎難以看見(jiàn)多形和梭形的星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞(圖1-D。A培養(yǎng)12h(×200B培養(yǎng)24h(×100C培養(yǎng)3d(×200D培養(yǎng)7d(×200圖1 培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定結(jié)果普通光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞(>90%NS E免疫陽(yáng)性顆粒位于神經(jīng)細(xì)胞核周質(zhì)及核突起中(呈棕黃色,細(xì)胞核不染色,為一圓形或橢圓形淡然區(qū),此類(lèi)細(xì)胞為神經(jīng)元(圖2-A;空白對(duì)照(以PBS為一抗僅見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色,胞體及突起均不著色(圖2-B。表明本培養(yǎng)方法可得到純度較高的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞。A NS E抗體染色(×400B PBS染色(×400圖2 海馬神經(jīng)元鑒定3 討論大腦海馬部位的神經(jīng)元高度集中,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最易受缺血/缺氧等因素影響造成損傷的部位之一,并與人體多種生理功能密切相關(guān);海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)排除了整體實(shí)驗(yàn)中循環(huán)、體液、內(nèi)分泌及血腦屏障等復(fù)雜因素的影響,是研究腦缺血/缺氧相關(guān)機(jī)制的行之有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｉ窠?jīng)組織的分離細(xì)胞培養(yǎng)是神經(jīng)組織體外培養(yǎng)技術(shù)的