蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體純化方法研究

1、10化學(xué)與生物工程Chemistry&Bioengineering蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體純化方法研究蔣辰1,李紅梅2,弓愛(ài)君1,邱麗娜1(1.北京科技大學(xué),北京100083;2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,北京100013)摘要:蘇云金芽孢桿菌是目前世界上研究最多、產(chǎn)量最大、,具有專一性強(qiáng)、對(duì)人畜無(wú)害、防治效果好、易生物降解及無(wú)殘毒等優(yōu)點(diǎn)。、液體雙相分離法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換分離法、堿裂解法、關(guān)鍵詞:蘇云金芽孢桿菌;伴孢晶體;純化中圖分類號(hào):TQ45315文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A-(2008)06-0010-03自20世紀(jì)60年代以來(lái),的重視。acillusthuringiensis,Bt)是一種革

2、蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌,其菌體為短桿狀,生鞭毛,單生或形成短鏈。當(dāng)菌體的營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)到一定階段后,在菌體的一端形成芽孢,另一端形成被稱為伴孢晶體的近菱形的蛋白質(zhì)晶體。菌體破裂后可釋放出芽孢和伴孢晶體,其中的伴孢晶體(原毒素)對(duì)鱗翅目或雙翅目等多種昆蟲(chóng)具有毒殺活性1。Bt由于具有專一性強(qiáng)、對(duì)人畜無(wú)害、防治效果好、生物降解無(wú)殘毒、所用原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在蟲(chóng)害防治中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用2,自20世紀(jì)60年代實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來(lái),已成為世界上用途最廣、商業(yè)開(kāi)發(fā)最成功、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲(chóng)劑,每年以20%的速度增長(zhǎng)3,4。隨著對(duì)Bt研究的深入,Bt的基因改造、毒理學(xué)研究、殺蟲(chóng)機(jī)理、對(duì)人類的安全性等方面的研究都對(duì)高

3、純度的Bt伴孢晶體提出了極大的需求,因此,Bt伴孢晶體的分離純化方法逐步得到了發(fā)展,如等密度梯度離心法、液體雙相分離法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換分離法、堿裂解法、高速離心法和生物物理法等。作者在此對(duì)這些方法進(jìn)行了綜述。以上新鮮培養(yǎng)基斜面中。接種后30恒溫培養(yǎng)48h。將菌苔從培養(yǎng)基上刮下來(lái)制成水懸液,用磁力攪拌器攪拌,由于孢子密度較小,大部分進(jìn)入泡沫,而伴孢晶體處于水層,除去泡沫就使孢子和晶體得到初步分離。重復(fù)幾次以盡量去除孢子。然后用超聲波處理,使芽孢、晶體在水中均勻分散5,于10000g離心1020min,棄去上清液,為了消除晶體中內(nèi)生蛋白酶對(duì)晶體的非特異降解,用1molL-1NaCl生理鹽水

4、洗滌沉淀。Augus用1molL-1NaCl于37洗滌晶體,而Yamarnmoto等發(fā)現(xiàn)015molL-1NaCl消除蛋白酶的效果更好。最后將得到的沉淀用1molL-1NaCl+0101%TritonX21006或0101%TritonX2100的生理鹽水5制成孢晶懸液,即伴孢晶體粗品,其中含有細(xì)胞碎片、殘留不溶性培養(yǎng)基及芽孢。2等密度梯度離心法制備伴孢晶體純品等密度梯度離心法是利用密度的差異將伴孢晶體與雜質(zhì)分離,從而獲得純品。該方法的特點(diǎn)是獲得的伴孢晶體純度較高,但產(chǎn)量較低、試劑及實(shí)驗(yàn)條件要求比較嚴(yán)格。其常用的密度試劑有蔗糖7、人工聚合蔗糖(Ficoll)、堿金屬鹽(CsCl、NaBr)、碘

5、化密度梯度介質(zhì)(Renografin、Metrizamide、泛影葡胺)5等,硅溶膠(Ludox)密度梯度離心純化晶體的方法也有報(bào)道8。其中蔗糖密度梯度離心方法簡(jiǎn)單,成本較低,但蔗糖溶解在水中的密度為113,分離孢晶混合物(平均密度為1131)時(shí)并不理想。人工聚合蔗糖(Ficoll)密度為1伴孢晶體粗品的制備取新鮮固體斜面培養(yǎng)基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂1520g,水1000mL,pH值714716),分別做好標(biāo)記,用無(wú)菌操作方法將待接菌種接入基金項(xiàng)目:國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2005DKA21501),北京市教委產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目收稿日期:2008-02-20作者簡(jiǎn)介:蔣

6、辰(1988-),男,北京人,碩士研究生,研究方向:Bt生物農(nóng)藥伴孢晶體的純化方法;通訊聯(lián)系人:弓愛(ài)君,教授。E2蔣辰等:蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體純化方法研究/2008年第6期111123,使用時(shí)也同樣受到了限制9。碘化密度梯度介液,得到伴孢晶體13。質(zhì)滲透壓低,不易破壞分離物。溴化鈉作為一種理想的梯度介質(zhì)得到了廣泛的應(yīng)用,其價(jià)廉、粘度低,且有足夠大的密度。利用11301134的溴化鈉線性密度梯度離心分離晶體,可在浮力密度1132處得到晶體區(qū)。通過(guò)比較NaCl、CsCl、Renografin等不同介質(zhì)的密度梯度離心可知,晶體在三者中的浮力密度并不相同,這是由于親水程度不同或特異結(jié)合使不同類型密度

7、梯度中的浮力密度并不嚴(yán)格具有可比性,因此選擇合適的梯度類型很重要。如果需要處理大量孢晶懸液時(shí),可用空心轉(zhuǎn)筒代替離心管進(jìn)行區(qū)帯梯度離心10。溴化鈉密度梯度離心純化實(shí)驗(yàn)步驟:同的溴化鈉溶液(218molL-11-1molL-1);黑色的雜質(zhì);,溶液;重復(fù)上述步驟;的溶液于47000rmin-1離心,收集晶體沉淀并用蒸餾水洗滌23次,配成晶體水溶液;置于冰箱中冷凍過(guò)夜后,放入冷卻干燥機(jī)中24h除去冰溶液中的水,即得到白色的伴孢晶體。4等電點(diǎn)沉淀法制備伴孢晶體純品氨基酸可以3種形式存在,即帶正電荷、帶負(fù)電荷和兩性離子,如在酸性溶液中帶正電荷、在堿性溶液中則帶負(fù)電荷。若在某一pH值下氨基酸凈電荷為零,且

8、在電場(chǎng)中不移動(dòng)時(shí),此pH值為它的PI值(等電點(diǎn))。因?yàn)閮綦姾蔀榱?凈電斥力不存在,大部分蛋白質(zhì)于等電點(diǎn)的pH值下,。等電點(diǎn),該方法操作、14500rmin-1、4離心304molL-1乙酸鈉-乙酸溶液(pH值410)調(diào)pH值達(dá)到510左右,4下沉淀4h后于12000rmin-1、4離心30min,沉淀物用無(wú)菌水洗滌數(shù)次后溶于pH值916的20mmolL-1Tris緩沖溶液中,置-20保存。5離子交換分離法制備伴孢晶體純品離子交換分離法是利用離子交換樹(shù)脂上的可交換離子發(fā)生的變換反應(yīng)達(dá)到分離和提純的目的14。離子交換反應(yīng)是可逆平衡反應(yīng)(以陽(yáng)離子交換反應(yīng)為例):R-H+M+R-M+H+。為使反應(yīng)不斷

9、地朝生成物的方向進(jìn)行,需采取不斷分離產(chǎn)物的操作,因此常借助離子交換柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)離子交換以實(shí)現(xiàn)這一目的。酶和蛋白質(zhì)都有電解質(zhì)性質(zhì),故可用離子交換法進(jìn)行分離提純。韓嵐嵐等15通過(guò)HiTrapQ柱層析分離純化BtCry毒素及原毒素蛋白;Bietlot等16用40%(質(zhì)量體積比)的硫酸銨沉淀,再對(duì)緩沖溶液透析后分離純化毒素蛋白。該方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離速率快且效率高的優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、造紙和冶金等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)步驟:取孢晶懸液于緩沖溶液BufferA1(20mmolL-1Ethanolamine,pH值917)中4透析過(guò)夜,然后離心(4,12000rmin-1,10min),取上清

10、液。對(duì)BufferA1、BufferA2(20mmolL-1Etha2nolamine,1molL-1NaCl,pH值917)各1000mL3液體雙相分離法制備伴孢晶體純品液體雙相分離法利用互不相溶的兩種液體對(duì)晶體和芽孢的親和性不同(即晶體、芽孢表面特性不同)而達(dá)到分離目的。該方法產(chǎn)量較高、所用試劑廉價(jià)、儀器簡(jiǎn)單,但純度不高、試劑毒性比較大、操作不方便。其常用的有三種液體雙相體系,一種是聚合物-聚合物雙相體系11,如聚乙二醇(PEG)-葡萄糖-水、聚乙二醇-硫酸葡聚糖鈉和聚丙烯酰胺-葡聚糖鈉;另一種是聚合物-鹽體系,如聚乙二醇-磷酸鹽-水;還有一種是鹽水與有機(jī)溶劑組成的液體雙相體系,如三氟三氯

11、乙烷-硫酸鈉、氯仿-水、四氯化碳-硫酸鈉等體系12。據(jù)報(bào)道,在聚乙二醇-磷酸鹽-水體系中,影響純化效果的因素有:PEG的分子量及濃度、磷酸二氫鈉與磷酸氫鈉的比例、進(jìn)樣量和離心速度。其中,PEG影響著蛋白質(zhì)分子在兩相中的分配;磷酸二氫鈉與磷酸氫鈉的比值較低,更有利于晶體分配到下相。鹽水與有機(jī)溶劑雙相體系純化實(shí)驗(yàn)步驟:取0107gmL-1孢晶懸液,磁力攪拌使之產(chǎn)生泡沫,除去泡沫后,倒入分液漏斗,加入1%硫酸鈉、四氯化碳(體積比為767),振蕩10min后再靜置15min,使晶體進(jìn))40min,棄去上清入水相,將水相離心(28000g,4分別進(jìn)行抽濾、超聲波脫氣處理,先用BufferA1平衡FPLC

12、(Fastproteinliquidchromatography)的MonoQ(1mL)離子交換柱,以1mLmin-1的流速將上清液過(guò)柱,用0%100%鹽線性梯度洗脫,根據(jù)計(jì)算機(jī)讀取的280nm紫外吸收峰,從開(kāi)始出現(xiàn)的第一個(gè)蛋白吸收峰開(kāi)始接收洗脫液1。12蔣辰等:蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體純化方法研究/2008年第6期6堿裂解法制備伴孢晶體純品蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的伴孢晶體是一種堿溶性蛋白,由cry基因和cyt基因所編碼。在pH值高于915時(shí),大多數(shù)的cry毒素和cyt毒素溶解,少數(shù)需要在pH值為12時(shí)才完全溶解。因此選用pH值916的碳酸鈉緩沖溶液才能保證大多數(shù)的蛋白質(zhì)從菌體中溶出。堿裂解法基于上

13、述原理制備伴孢晶體純品。實(shí)驗(yàn)步驟:將孢晶懸液于4500rmin-1、4離心20min,沉淀用含011%TritonX2100的生理鹽水洗蟲(chóng)毒力。作者認(rèn)為,多種方法聯(lián)用、開(kāi)發(fā)新方法將成為Bt伴孢晶體純化的發(fā)展方向。參考文獻(xiàn):1宋平,潘映紅,陸秀君,等.兩種純化蘇云金芽孢桿菌HD273毒素蛋白方法的比較研究J.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(3):63265.2姚偉芳,弓愛(ài)君,邱麗娜,等.蘇云金芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化J.化學(xué)與生物工程,2006,23(11):42244.3朱仕房,楊曜中.雙水相體系分離蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的研究J.世界農(nóng)藥,2000,22(5):39242.4喻子牛,柯云

14、,劉子鐸,等.滌,4500rmin-1、4離心后用無(wú)菌水洗滌3次,于4500rmin-1、4離心20min,取沉淀溶于50mmolL-1碳酸鈉緩沖溶液(含1%22,pH916),搖勻后于4放置2h。:,2000:11220.5,溫潔.J.微3)2288.6D,FastPG.Bacillusthuringiensis2endotoxin:AnimprovedtechniquefortheseparationofcrystalsfromsporesJ.JournalofInvertebratePathology,1977,29(2):2302231.7ThomasWE,EllarDJ.Bacill

15、usthuringiensisvarisraelensiscrystal7或密度的不同而進(jìn)行分離提純的。該方法對(duì)固體顆粒很小、液體粘度很大及難于過(guò)濾的懸浮液十分有效,對(duì)那些忌用助濾劑或助濾劑使用無(wú)效的懸浮液的分離,也能得到滿意的結(jié)果17。同時(shí)該方法制備時(shí)間縮短、所用試劑廉價(jià),得到的伴孢晶體純度可達(dá)99%以上,是大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的方法18。實(shí)驗(yàn)步驟:將孢晶懸液于18000rmin-1、4離心30min,除去菌體和其它不溶性碎片,取上清液得Bt蛋白溶液,置-20保存19。2endotoxinJ.JCellSci,1983,60:1812197.8YuShengZhu,AllanBrookes

16、,KenCarlson,etal.SeparationofproteincrystalsfromsporesofBacillusthuringiensisbyludoxgradientcentrifugationJ.ApplEnvironMicrobiol,1989,55(5):127921281.9陳濤.生物農(nóng)藥檢測(cè)及其原理M.北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993:1642330.10AngBJ,NickersonKW.PurificationoftheproteincrystalfromBacillusthuringiensisbyzonalgradientcentrifugationJ.Ap2pl

17、iedandEnvironmentalMicrobiology,1978,36(4):6252626.11李萍,劉豐茂.蘇云金芽孢桿菌(Bt)晶體毒素的分離與純化J.農(nóng)藥,1996,35(12):13216.12GuerecaL,BravoA,QuinteroR.Designofanaqueoustwo2phasesystemforthepurificationofICPfromBacillusthuringiensisJ.ProcessBiochemistry,1994,29(3):1812185.13張敏鷹,范秀華,邢建民,等.蘇云金桿菌芽孢與晶體不同配比對(duì)8生物物理法制備伴孢晶體純品生物

18、物理法是利用抗生素破壞芽孢萌發(fā)后的營(yíng)養(yǎng)體,然后離心分離,或利用無(wú)芽孢或寡芽孢突變株獲得純凈伴孢晶體11。該方法所用試劑昂貴、實(shí)驗(yàn)條件苛刻、產(chǎn)率低。亞洲玉米螟的毒效J.生物防病通報(bào),1988,4(4):1612164.14ClairmontFR,MilneRE,PhamVT.RoleofDNAintheacti2vationoftheCry1AinsecticidalcrystalproteinfromBacillusthuringiensisJ.TheJournalofBiochemistry,1998,273(15):929229296.15韓嵐嵐,宋福平,李長(zhǎng)友,等.蘇云金芽孢桿菌cry基

19、因在大腸桿9結(jié)語(yǔ)不同伴孢晶體純化方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。等密度梯度離心法提取蛋白量少,而且超離心時(shí)間很長(zhǎng),約14h,一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)此條件且成本高,不宜大量提取。堿裂解法在提取過(guò)程中需要保持低溫狀態(tài),以免伴孢晶體被自身產(chǎn)生的堿性蛋白水解酶降解。液體雙相分離法能保持伴孢晶體天然的完整結(jié)構(gòu),真實(shí)地反映出蛋白質(zhì)特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)與毒力一致性,但純度不高。等電點(diǎn)沉淀法提取伴孢晶體的量是液體雙相分離法的2倍,但等電點(diǎn)沉淀法破壞了伴孢晶體的形態(tài),影響了殺菌中表達(dá)產(chǎn)物和生物活性J.植物保護(hù),2002,28(5):529.16BietlotH,CareyPR,ChomaC,etal.Facilepreparationandc

20、haracterizationofthetoxinfromBacillusthuringiensisvar.kurstakiJ.BiochemistryJ,1989,260(1):87291.17弓愛(ài)君,孫翠霞,邱麗娜.Bt生物農(nóng)藥M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:1062107.18周學(xué)永,金紅,楊志生,等.蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液后處理工藝研究進(jìn)展J.化學(xué)與生物工程,2006,23(1):426.19郭艾英,王碩.蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的制備方法J.食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(8):8210.(下轉(zhuǎn)第20頁(yè))20王艷萍等:二茂鐵橋聯(lián)聚倍半硅氧烷修飾電極的制備及循環(huán)伏安表征/2008年第6

21、期hybridorganic2inorganicmaterialsJ.ChemRev,1995,95(5):143121442.4劉豐祎,符連社,王俊,等.橋聯(lián)聚倍半硅氧烷的近期研究進(jìn)性,峰電流稍有下降。這說(shuō)明BESF膜在有機(jī)溶劑中具有良好的穩(wěn)定性,這是物理吸附法無(wú)法達(dá)到的。3結(jié)論以合成的二茂鐵橋聯(lián)聚倍半硅氧烷單體化合物BESF與TEOS為前驅(qū)物,采用溶膠-凝膠法制備了二茂鐵橋聯(lián)聚倍半硅氧烷膜修飾玻碳電極。循環(huán)伏安表征結(jié)果表明,該膜電極具有良好的循環(huán)伏安行為;二茂鐵氧化還原電對(duì)在電極上的反應(yīng)同時(shí)受擴(kuò)散和電子轉(zhuǎn)移速率的控制;多次的連續(xù)掃描和有機(jī)溶劑循環(huán)清洗實(shí)驗(yàn)證明該膜具有良好的穩(wěn)定性。參考文獻(xiàn):

22、1WightAP,DavisME.Designandpreparationoforganic2ichybridcatalystsJ.ChemRev,2002,102)23614.2BaoXY,LiX,ZhaoXS.ofmetbridgedperiodicit.JPhyChemB,2006(62展單體合成及應(yīng)用J.化學(xué)通報(bào),2003,66(6):3822403.5HattonB,LandskronK,WhitnallW,etal.Past,present,andfu2tureofperiodicmesoporousorganosilicasthePMOsJ.AccChemRes,2005,38(

23、4):3052312.6GerveauC,CorriuRJP,FrameryE.Nanostructuredorganic2inor2ganichybridmaterials:KineticcontrolofthetextureJ.ChemMater,2001,13(10):337327,.1二22(三乙氧基硅基)乙基二茂C.:,2006:8.M.北京:北京師范大學(xué)出版社,1995:222.,干寧,葛從辛.輔酶Q在CPT自組裝修飾電極上的電化學(xué)行為及其分析應(yīng)用J.理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2006,42(8):6042607.PreparationandCyclicVoltammetryCharac

24、terizationofFerroceneBridgedPolysilsesquioxanesModifiedElectrodeWANGYan2ping,ZHANGTie2ming,GAOChun2guang,ZHAOYong2xiang(EngineeringResearchCenterofFineChemicalsofMinistryofEducation,SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)Abstract:Anovelferrocenebridgedalkoxysilanewasadoptedtoprepareamodifiedglassycarbonelectrodeviaasol2gelprocess.Themodifiedelectrodewascharacterizedbycyclicvoltammetryin011molL-1tetrabu2tylammoniumfluoroborate(TBAFB)acetonitrilesolutionandshowedapropertyofquasi2reversibleredox.Thefil