大豆異黃酮苷元檢測方法的研究

1、大豆異黃酮苷元檢測方法的研究                     作者：張磊,金桂芳,楊紅,習(xí)志剛 【摘要】  目的 建立大豆異黃酮苷元含量測定方法。方法 采用HPLC法，Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 m)，流動相：甲醇-0.3%磷酸溶液（體積比4852），流速0.7 mL/min，測定波長260 nm,柱溫25 。結(jié)果 制備的大豆異黃酮苷

2、元總含量為70.98%;大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率分別為98.7%、98.9%和99.2%，RSD分別為2.1%、1.6%和1.4%。結(jié)論 所建立的測定方法重現(xiàn)性好、可靠，可用于3種大豆異黃酮苷元的含量測定。 【關(guān)鍵詞】  大豆異黃酮苷元；高效液相色譜法；含量測定Abstract:Objective To establish an HPLC method for the content determination of isoflavone aglycones. Methods Isoflavone aglycones were analyzed on a  D

3、iamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm，5 m). A mixture of MeOH-0.3%H3PO4（4852) was used as the mobile phase with a flow rate of 0.7 mL/min. The detecting wavelength was 260 nm at 25 .Results The content of  isoflavone aglycones in the sample was 70.98%.The average recoveries of genistein,daidz

4、ein and glycitein were 99.2%,98.7% and 98.9% with  RSD 1.4%,2.1% and 1.6%,respectively. Conclusions  This method can be used for the quality control of soy isoflavone aglycones.Key words:soy;isoflavone aglycones； HPLC大豆異黃酮有廣泛的生理活性，具有抗氧化、防癌和抗癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)保護(hù)等作用。有資料表明，在哺乳動物體內(nèi)，去除糖基配體后形成

5、的大豆黃酮苷元及其代謝產(chǎn)物均是弱雌激素樣活性物質(zhì),苷元比糖苷更容易被人體吸收1,2。大豆異黃酮苷元廣泛用于保健品、食品和化妝品等，正受到廣泛的關(guān)注，因此建立一個穩(wěn)定、準(zhǔn)確的含量檢測方法有重要的應(yīng)用價值。1  儀器與材料      Dionex P680A高效液相色譜儀，數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省宏華儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮儀器廠)，SH2-D循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)公司）電子天平（Sartorius）。    染料木素、大豆苷元和黃豆黃素對照品 (購于上海同田生化技術(shù)有限公司,純度均99%)，脫脂豆粕（

6、購于山西省曲沃縣），AB-8大孔樹脂（南開大學(xué)化工廠），聚酰胺（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇(色譜純,英國TEDIA公司)，屈臣氏蒸餾水，其余試劑均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1  大豆異黃酮苷元的制備  取豆粕適量，用8倍量（g/mL）體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液浸泡30 min，80  水浴回流提取2次，每次90 min；合并提取液，過濾后回收乙醇、濃縮；上AB-8大孔樹脂,以體積分?jǐn)?shù)為50的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，45  烘干。適量乙醇溶液溶解，拌樣上聚酰胺柱，以體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液洗脫，得粗提浸膏，45 烘干。取一定

7、量的粗提物置于圓底燒瓶中，加入4倍量（g/mL）的7%鹽酸-乙醇液，80  水浴水解2 h，濃縮，乙醚萃取，揮干乙醚；用適量體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液溶解，石油醚脫脂，用200300目硅膠拌勻，自然干燥，上硅膠柱，用三氯甲烷-甲醇（體積比61）洗脫，收集洗脫液，揮去溶劑，得大豆異黃酮苷元混合物3,4。2.2  樣品溶液的制備  精密稱取大豆異黃酮苷元混合物28.50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容，精密吸取1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.0570  mg/mL的樣品溶液。2.3  對照品溶液的制

8、備  分別精密稱定大豆苷元、染料木素對照品13.20 mg、14.60 mg各置50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容，得濃度為0.264 0  mg/mL的大豆苷元及0.292 0  mg/mL的染料木素對照品溶液；精密稱定黃豆黃素27.75 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容，精密吸取1.0 mL，至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得0.111 0  mg/mL的黃豆黃素對照品溶液。4  儲存?zhèn)溆谩?.4  色譜條件56  Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 m)；

9、柱溫25 ；流動相：甲醇-0.3%磷酸溶液（體積比4852）；流速=0.7 mL/min ；測定波長260 nm；進(jìn)樣量：20 L。  2.5  線性關(guān)系       分別精密吸取上述大豆苷元、染料木素、黃豆黃素對照品溶液0. 8、1.5、0.6 mL置100 mL量瓶中，甲醇定容，得混合對照品溶液。同法制備混合對照品溶液-，濃度見表1，混合對照品HPLC色譜圖見圖1。表1  混合對照品溶液中大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的質(zhì)量濃度 （略）Tab.1  Contents of genis

10、tein,daidzein and glycitein in the control sample/按上述色譜條件依法測定，分別以大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的濃度(g/mL)對峰面積作回歸計算,得回歸方程（n6）分別為：    y=5836.1x+0.8812，r=0.9994；    y=1177.4x+0.1372，r=0.9994；    y=3256.6x+0.894，r=0.9992。    大豆苷元、黃豆黃素和染料木素分別在2.11221.12 g/ mL，0.

11、666 06.66 0 g/mL,4.38043.80 g/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。1.大豆苷元  2.黃豆黃素  3.染料木素圖1  對照品HPLC色譜圖（略）Fig.1  HPLC chromatogram of reference substance2.6  精密度試驗       取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積值，計算RSD值，得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD分別為0.5%、 0.6%和0.8%。2.7  重復(fù)性試驗  取同一批次

12、大豆異黃酮苷元混合物6份，按“2.2”項下，制備樣品溶液，測定峰面積值，計算RSD值，得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD分別為2.0%，1.2%和1.4%。     2.8  穩(wěn)定性試驗       取同一樣品溶液分別在0、2、4、6、8、12 h于上述色譜條件下測定峰面積值，計算RSD值，得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD分別為0.70%、1.4%  和0.74%。2.9  回收率試驗  取大豆異黃酮苷元混合物6份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入3種對照

13、品溶液各適量，余同“2.2”項下操作。分別計算得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率，結(jié)果見表2、表3、表4,結(jié)果表明，3種苷元回收率均符合要求。2.10  大豆異黃酮苷元含量測定  精密吸取樣品溶液（0.171 mg/mL），測定3次，結(jié)果見表3,樣品中種苷元總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.98%,樣品HPLC圖見圖2。表2  大豆苷元加樣回收率實驗結(jié)果（略）Tab.2  Recovery results of daidzein（n6）表3  黃豆黃素加樣回收率實驗結(jié)果（略）Tab.3  Recovery results of glycitei

14、n（n6）表4  染料木素加樣回收率實驗結(jié)果（略）Tab.4  Recovery results of genistein（n6）表5  樣品含量測定結(jié)果（略）Tab.5  Results of sample determination（n3）1.大豆苷元  2.黃豆黃素  3.染料木素圖2  樣品HPLC色譜圖（略）        Fig.2  HPLC chromatogram of the sample3  討 論

15、60;       大豆中異黃酮存在的形式主要是結(jié)合型的糖苷,其含量占大豆中異黃酮含量的95%以上,雖然游離的苷元含量不足5%,但它們表現(xiàn)出來的活性要比結(jié)合型的糖苷高得多。在用水解法制備大豆異黃酮苷元時，常用酶、堿和酸法水解。酶水解條件要求高、成本高，堿性條件水解得到異黃酮苷元不穩(wěn)定，容易降解，本試驗用酸水解，而常用強(qiáng)酸中,硫酸、硝酸有氧化性，可能破壞異黃酮苷元上的酚羥基，所以本試驗選用鹽酸。        本實驗分別考察了不同體積比的甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸，乙腈-水作為流動相，結(jié)果顯示甲醇-磷酸，且流速為0.7 mL/min時,可使大豆苷元、黃豆黃素和染料木素3種苷元達(dá)到基線分離，也可使大豆苷、染料木苷和上述3種苷元共5種成分達(dá)到基線分離；豆粕提取物中有油脂，樣品用石油醚脫脂后，測定干擾少，效果理想。     本文采用高效液相色譜法同時測定3種大豆異黃酮苷元的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為大豆異黃酮苷元產(chǎn)品的生產(chǎn)制備及推廣應(yīng)用提供了支持。參考文獻(xiàn)】  1 張遜，姚文，朱偉云.腸道大豆異黃酮降解菌研究進(jìn)展J.世界華人消化雜志，2006，14（10）：973-978.2 虞丹.植物雌激素大豆異