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文檔簡介
1、大豆異黃酮苷元檢測方法的研究 作者:張磊,金桂芳,楊紅,習(xí)志剛 【摘要】 目的 建立大豆異黃酮苷元含量測定方法。方法 采用HPLC法,Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 m),流動相:甲醇-0.3%磷酸溶液(體積比4852),流速0.7 mL/min,測定波長260 nm,柱溫25 。結(jié)果 制備的大豆異黃酮苷
2、元總含量為70.98%;大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率分別為98.7%、98.9%和99.2%,RSD分別為2.1%、1.6%和1.4%。結(jié)論 所建立的測定方法重現(xiàn)性好、可靠,可用于3種大豆異黃酮苷元的含量測定。 【關(guān)鍵詞】 大豆異黃酮苷元;高效液相色譜法;含量測定Abstract:Objective To establish an HPLC method for the content determination of isoflavone aglycones. Methods Isoflavone aglycones were analyzed on a D
3、iamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm,5 m). A mixture of MeOH-0.3%H3PO4(4852) was used as the mobile phase with a flow rate of 0.7 mL/min. The detecting wavelength was 260 nm at 25 .Results The content of isoflavone aglycones in the sample was 70.98%.The average recoveries of genistein,daidz
4、ein and glycitein were 99.2%,98.7% and 98.9% with RSD 1.4%,2.1% and 1.6%,respectively. Conclusions This method can be used for the quality control of soy isoflavone aglycones.Key words:soy;isoflavone aglycones; HPLC大豆異黃酮有廣泛的生理活性,具有抗氧化、防癌和抗癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)保護(hù)等作用。有資料表明,在哺乳動物體內(nèi),去除糖基配體后形成
5、的大豆黃酮苷元及其代謝產(chǎn)物均是弱雌激素樣活性物質(zhì),苷元比糖苷更容易被人體吸收1,2。大豆異黃酮苷元廣泛用于保健品、食品和化妝品等,正受到廣泛的關(guān)注,因此建立一個穩(wěn)定、準(zhǔn)確的含量檢測方法有重要的應(yīng)用價值。1 儀器與材料 Dionex P680A高效液相色譜儀,數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省宏華儀器廠),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮儀器廠),SH2-D循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)公司)電子天平(Sartorius)。 染料木素、大豆苷元和黃豆黃素對照品 (購于上海同田生化技術(shù)有限公司,純度均99%),脫脂豆粕(
6、購于山西省曲沃縣),AB-8大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠),聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠);甲醇(色譜純,英國TEDIA公司),屈臣氏蒸餾水,其余試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 大豆異黃酮苷元的制備 取豆粕適量,用8倍量(g/mL)體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液浸泡30 min,80 水浴回流提取2次,每次90 min;合并提取液,過濾后回收乙醇、濃縮;上AB-8大孔樹脂,以體積分?jǐn)?shù)為50的乙醇溶液洗脫,收集洗脫液,濃縮,45 烘干。適量乙醇溶液溶解,拌樣上聚酰胺柱,以體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液洗脫,得粗提浸膏,45 烘干。取一定
7、量的粗提物置于圓底燒瓶中,加入4倍量(g/mL)的7%鹽酸-乙醇液,80 水浴水解2 h,濃縮,乙醚萃取,揮干乙醚;用適量體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇溶液溶解,石油醚脫脂,用200300目硅膠拌勻,自然干燥,上硅膠柱,用三氯甲烷-甲醇(體積比61)洗脫,收集洗脫液,揮去溶劑,得大豆異黃酮苷元混合物3,4。2.2 樣品溶液的制備 精密稱取大豆異黃酮苷元混合物28.50 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容,精密吸取1.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度為0.0570 mg/mL的樣品溶液。2.3 對照品溶液的制
8、備 分別精密稱定大豆苷元、染料木素對照品13.20 mg、14.60 mg各置50 mL量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容,得濃度為0.264 0 mg/mL的大豆苷元及0.292 0 mg/mL的染料木素對照品溶液;精密稱定黃豆黃素27.75 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容,精密吸取1.0 mL,至5 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得0.111 0 mg/mL的黃豆黃素對照品溶液。4 儲存?zhèn)溆谩?.4 色譜條件56 Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 m);
9、柱溫25 ;流動相:甲醇-0.3%磷酸溶液(體積比4852);流速=0.7 mL/min ;測定波長260 nm;進(jìn)樣量:20 L。 2.5 線性關(guān)系 分別精密吸取上述大豆苷元、染料木素、黃豆黃素對照品溶液0. 8、1.5、0.6 mL置100 mL量瓶中,甲醇定容,得混合對照品溶液。同法制備混合對照品溶液-,濃度見表1,混合對照品HPLC色譜圖見圖1。表1 混合對照品溶液中大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的質(zhì)量濃度 (略)Tab.1 Contents of genis
10、tein,daidzein and glycitein in the control sample/按上述色譜條件依法測定,分別以大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的濃度(g/mL)對峰面積作回歸計算,得回歸方程(n6)分別為: y=5836.1x+0.8812,r=0.9994; y=1177.4x+0.1372,r=0.9994; y=3256.6x+0.894,r=0.9992。 大豆苷元、黃豆黃素和染料木素分別在2.11221.12 g/ mL,0.
11、666 06.66 0 g/mL,4.38043.80 g/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。1.大豆苷元 2.黃豆黃素 3.染料木素圖1 對照品HPLC色譜圖(略)Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance2.6 精密度試驗 取對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,測定峰面積值,計算RSD值,得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD分別為0.5%、 0.6%和0.8%。2.7 重復(fù)性試驗 取同一批次
12、大豆異黃酮苷元混合物6份,按“2.2”項下,制備樣品溶液,測定峰面積值,計算RSD值,得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD分別為2.0%,1.2%和1.4%。 2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品溶液分別在0、2、4、6、8、12 h于上述色譜條件下測定峰面積值,計算RSD值,得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD分別為0.70%、1.4% 和0.74%。2.9 回收率試驗 取大豆異黃酮苷元混合物6份,精密稱定,分別準(zhǔn)確加入3種對照
13、品溶液各適量,余同“2.2”項下操作。分別計算得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率,結(jié)果見表2、表3、表4,結(jié)果表明,3種苷元回收率均符合要求。2.10 大豆異黃酮苷元含量測定 精密吸取樣品溶液(0.171 mg/mL),測定3次,結(jié)果見表3,樣品中種苷元總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.98%,樣品HPLC圖見圖2。表2 大豆苷元加樣回收率實驗結(jié)果(略)Tab.2 Recovery results of daidzein(n6)表3 黃豆黃素加樣回收率實驗結(jié)果(略)Tab.3 Recovery results of glycitei
14、n(n6)表4 染料木素加樣回收率實驗結(jié)果(略)Tab.4 Recovery results of genistein(n6)表5 樣品含量測定結(jié)果(略)Tab.5 Results of sample determination(n3)1.大豆苷元 2.黃豆黃素 3.染料木素圖2 樣品HPLC色譜圖(略) Fig.2 HPLC chromatogram of the sample3 討 論
15、60; 大豆中異黃酮存在的形式主要是結(jié)合型的糖苷,其含量占大豆中異黃酮含量的95%以上,雖然游離的苷元含量不足5%,但它們表現(xiàn)出來的活性要比結(jié)合型的糖苷高得多。在用水解法制備大豆異黃酮苷元時,常用酶、堿和酸法水解。酶水解條件要求高、成本高,堿性條件水解得到異黃酮苷元不穩(wěn)定,容易降解,本試驗用酸水解,而常用強(qiáng)酸中,硫酸、硝酸有氧化性,可能破壞異黃酮苷元上的酚羥基,所以本試驗選用鹽酸。 本實驗分別考察了不同體積比的甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸,乙腈-水作為流動相,結(jié)果顯示甲醇-磷酸,且流速為0.7 mL/min時,可使大豆苷元、黃豆黃素和染料木素3種苷元達(dá)到基線分離,也可使大豆苷、染料木苷和上述3種苷元共5種成分達(dá)到基線分離;豆粕提取物中有油脂,樣品用石油醚脫脂后,測定干擾少,效果理想。 本文采用高效液相色譜法同時測定3種大豆異黃酮苷元的含量,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,為大豆異黃酮苷元產(chǎn)品的生產(chǎn)制備及推廣應(yīng)用提供了支持。參考文獻(xiàn)】 1 張遜,姚文,朱偉云.腸道大豆異黃酮降解菌研究進(jìn)展J.世界華人消化雜志,2006,14(10):973-978.2 虞丹.植物雌激素大豆異
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