生物技術(shù)制藥重點

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流生物技術(shù)制藥重點.精品文檔.重點（單選10個，名詞解釋4個，簡單3個，論述2個。）1.生物技術(shù)制藥飛速發(fā)展的30年20世紀(jì)70年代中期 生物時代（重組DNA、DNA的合成、DNA和蛋白質(zhì)的微量測序技術(shù) 、重組蛋白、單克隆抗體 人胰島素）20世紀(jì)80年代中期 技術(shù)平臺時代（新平臺：高通量篩選、組合化學(xué)、胚胎干細(xì)胞技術(shù)，藥物的探索性研究、治療的新模式：反義藥物、基因治療以及在治療中添加使用重組蛋白、胰島素、干擾素、EPO、細(xì)胞集落刺激因子（CSF）、人生長激素等）20世紀(jì)90年代中期 基因組時代（新技術(shù)：基因組、高通量的測序、基因芯片、生物信息、

2、生物能源、生物光電、生物傳感器、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能基因組學(xué)等 制藥工程，新藥研發(fā)）2006年 后基因組時代2.質(zhì)粒三要素、基因工程制藥流程、蛋白質(zhì)純化技術(shù)質(zhì)粒載體的三個要素 （1）復(fù)制子: 又稱復(fù)制起始區(qū) （2）選擇標(biāo)記：用于篩選鑒定 (3) 多克隆位點: 限制性內(nèi)切酶識別序列基因工程制藥流程:1. 目的基因的制備 2. 載體 3. 載體與目的基因的連接 4. 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 5. 重組子的篩選和鑒定 6. 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇 7. 基因重組蛋白的分離和純化 基因重組蛋白的主要純化技術(shù)1. 離子交換層析 利用蛋白質(zhì)等電點的差異，通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可以交換的離子進(jìn)行交換離子交

3、換劑 陰離子交換劑、陽離子交換劑、兩性離子交換劑、選擇性離子交換劑 影響因素 鹽離子濃度、離子大小、洗脫梯度與流速 2. 親和層析 利用固定化配基于目的蛋白之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附 酶與激活劑/受體/底物 抗體與抗原 受體與激素/配體 蛋白質(zhì)與DNA/RNA結(jié)合域親和層析步驟： 配基固定化 親和吸附 洗滌 洗脫解離 再生3.凝膠過濾4. 反相層析和疏水層析 反相層析：有機溶液洗脫，蛋白質(zhì)可能變性 疏水層析：鹽溶液洗脫3.動物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液、培養(yǎng)基、生產(chǎn)用動物細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)基是維持動物組織及細(xì)胞在體外生存、生長的基本的營養(yǎng)物質(zhì)。 1天然培養(yǎng)基：直接采用取自動物體液或組織中提取的成分作培養(yǎng)

4、液，如乳蛋白水解物、酪蛋白水解物、血清、血漿及胚胎浸出液等(維持液：含低濃度或不含小牛血清 /生長液：含520小牛血清 )2合成培養(yǎng)基：化學(xué)成分主要為氨基酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)、維生素、輔酶、激素、生長因子、微量元素及緩沖劑等。 (Eagle培養(yǎng)基含有13種氨基酸、9種維生素、6種無機鹽及葡萄糖； 199培養(yǎng)基含21種氨基酸、17種維生素、7種無機鹽、4種嘌呤、2種嘧啶、谷胱甘肽、ATP、膽固醇、吐溫-80、脫氧核糖、核糖、葡萄糖及醋酸鈉。 )3血清培養(yǎng)基：不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長的成分，如纖連蛋白、

5、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、表皮生長因子等3無血清培養(yǎng)基(serumfree medium)第一代 不含有血清，但含有大量的動物或植物蛋白 第二代 完全不用動物來源的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量很低 (少于100g/ml)，使重組蛋白的純化簡單 第三代 完全不含有蛋白質(zhì)或含量極低，沒有任何動物、 人類蛋白或多肽 新一代 無血清、無蛋白質(zhì)、無動物來源、成分確定動物細(xì)胞培養(yǎng)常用的其他溶液1平衡鹽溶液 2培養(yǎng)基pH調(diào)整液 3細(xì)胞消化液 4抗生素溶液 1平衡鹽溶液 生理鹽水 葡萄糖 維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸堿度平衡 酚紅指示劑 pH 黃/紫紅 Hanks液 緩沖能力弱 Earle液 緩沖能力強 2培養(yǎng)基pH調(diào)整液 合

6、成培養(yǎng)液微酸性，需調(diào)整pH單獨配制，單獨滅菌，待滅菌后的培養(yǎng)基使用前再加入 3.7、5.6、7.4NaHCO3溶液、羥乙基哌嗪乙磺酸液 3細(xì)胞消化液 (1)胰蛋白酶溶液： 分離自牛、豬等動物胰臟的胰蛋白酶(trypsin)呈黃白色粉末狀，極易潮解，注意冷藏干燥保存.常用1:125和1:250兩種濃度 (2)EDTA溶液： 一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versen液，對細(xì)胞具一定的非酶性解離作用。 常用濃度0.02(個別細(xì)胞系要求濃度較高)使用完，需用Hanks液沖洗凈(血清對其無終止作用) 4抗生素溶液 防止發(fā)生微生物污染 青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的種類1原代細(xì)胞：直接

7、將動物組織或器官經(jīng)過粉碎、消化而制得的懸浮細(xì)胞 (需要大量的動物組織原料、不能直接從細(xì)胞庫獲得 、生長分裂不旺盛)2傳代細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆等步驟，從多種細(xì)胞中純化得到的某種具有一定特征的細(xì)胞系 (在生物學(xué)特性上與腫瘤細(xì)胞有許多相似之處/有時是從腫瘤細(xì)胞衍生而來/從動物胚胎組織中獲取，有明顯的貼壁和接觸抑制特性，有正常細(xì)胞的核型，一般可傳代培養(yǎng)50代，且無致瘤性 /廣泛用于人用治療性藥物的生產(chǎn)，不夠理想 )3轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：正常細(xì)胞經(jīng)過某個轉(zhuǎn)化過程，失去正常細(xì)胞的特點而獲得無限增殖的能力得到的細(xì)胞系(大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn))(無限的生命力 /較短的倍增時間 /較低的培養(yǎng)條件要求 Vero

8、(正常成年非洲綠猴腎細(xì)胞)、CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、Namalwa細(xì)胞(淋巴瘤細(xì)胞)和BHK-21細(xì)胞(幼鼠腎細(xì)胞) )4工程細(xì)胞系：采用細(xì)胞融合技術(shù)或基因工程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細(xì)胞系 (1)融合細(xì)胞系：通過動物細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建 (2)基因工程細(xì)胞系：通過表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)載體的導(dǎo)入以及表達(dá)細(xì)胞株的篩選而構(gòu)建 4.抗體的結(jié)構(gòu)、抗體的種類、嵌合抗體、人源化抗體基本結(jié)構(gòu)：抗體單體由4條多肽鏈（2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈）通過二硫鍵（-S-S-）鏈接而成，為“Y”字形結(jié)構(gòu)。1.輕鏈（L鏈） 2.重鏈（H鏈） 3.可變區(qū)（V區(qū)）:識別

9、并特異性結(jié)合抗原： 與毒素結(jié)合可以中和其毒性 /與病原體結(jié)合，可以組織其對機體細(xì)胞的黏附和感染 恒定區(qū)（C區(qū)）:1.激活補體系統(tǒng) 抗體（IgM、IgG）與抗原結(jié)合形成復(fù)合物可通過啟動C1q激活補體經(jīng)典途徑；IgG4、IgA和IgE的聚合物可以激活補體旁路途徑。 2.介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性 抗體的調(diào)理作用；ADCC作用；介導(dǎo)超敏反應(yīng) 3.穿過胎盤與黏膜 IgG是唯一能夠從母體通過胎盤屏障轉(zhuǎn)運到胎兒體內(nèi)的抗體（胎兒抗感染） 分泌型IgA合成和主要作用部位在黏膜（黏膜局部抗感染）4.超變區(qū)（HVR），又可稱為互補決定區(qū)（CDR） 骨架區(qū)（FR） 5.鉸鏈區(qū)6. 抗原特異性結(jié)合部位 7.補體結(jié)合位點 8.巨

10、噬細(xì)胞等的結(jié)合位抗體的種類：Fab和Fv、單鏈抗體、雙鏈抗體、抗體融合蛋白、嵌合抗體、人源化抗體、超變區(qū)多肽、特殊抗嵌合抗體:是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的抗體，表達(dá)的抗體輕重鏈V區(qū)是異源，而C區(qū)是人源的，即整個抗體分子60%-70%是人源的。人源化抗體：把鼠抗體的CDR序列一直到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得的抗體。5.疫苗的種類、各種亞單位疫苗1.滅活疫苗 2.減毒活疫苗 3.亞單位疫苗 4.聯(lián)合疫苗 5.核酸疫苗 6.治療性疫苗滅活疫苗又稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)的完整的病原微生物殺死，使其喪

11、失感染性和毒性而保持其免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的疫苗。 疫苗液中除含有滅活的病毒顆粒外，還含有細(xì)胞成分和培養(yǎng)病毒時加入的牛血清等蛋白類物質(zhì)，多次接種疫苗容易發(fā)生過敏反應(yīng)。滅活疫苗的優(yōu)點 制造工藝簡單 免疫原性的穩(wěn)定性高 易于制備多價疫苗滅活疫苗的缺點 需要嚴(yán)格的滅活操作，保證疫苗中不含有滅活不完全的顆粒。 需要進(jìn)行多次接種，由于機體反復(fù)接受疫苗中的異性蛋白質(zhì)的刺激，而可能出現(xiàn)不良的過敏反應(yīng)。 接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨時間而下降 滅活疫苗需要量大減毒活疫苗又稱弱毒疫苗，是指將微生物的自然強毒株通過物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法，連續(xù)傳代，使其對原宿主喪失致病力，或只引起亞臨床感染，但仍保持

12、良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株制備的疫苗就叫減毒活疫苗。 減毒活疫苗的作用機制最類似自然感染免疫，因而具有類似自然感染的優(yōu)越性。 當(dāng)前使用的病毒疫苗多數(shù)是減毒活疫苗。 常用的減毒方法：è 體外減毒 :即體外連續(xù)傳代減毒。在異源宿主中連續(xù)傳代；在單一宿主中反復(fù)連續(xù)傳代。è 冷適應(yīng)篩選ü 溫度可以改變病毒的特性，得到冷適應(yīng)株。ü 病毒冷適應(yīng)株常伴有毒力減弱和各種特征性標(biāo)志。ü 冷適應(yīng)篩選穩(wěn)定的減毒突變株是在傳統(tǒng)疫苗設(shè)計中較早采用的方法，而且也是最為行之有效的思路。 減毒活疫苗的優(yōu)點1）可以誘導(dǎo)更全面的免疫應(yīng)答 2）可誘導(dǎo)較強的免疫反應(yīng)，理論上

13、只需要接種一次 3）可能引起水平傳播，擴大免疫效果 4）生產(chǎn)工藝簡單，價格低廉。 減毒活疫苗的缺點 1）有可能出現(xiàn)毒力回復(fù) 2）可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳染源 3）產(chǎn)品的分析評估較為困難 4）保存、運輸條件要求較高 亞單位疫苗是指提取或合成細(xì)菌、病毒外殼的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，即抗原決定簇制成的疫苗，這類疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物質(zhì)，故稱亞單位疫苗。 亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白，因而能消除病毒（或細(xì)菌）的許多無關(guān)抗原決定簇和粗制或半提純的病毒（或細(xì)菌）制劑誘發(fā)的不良反應(yīng)。亞單位疫苗：Ø 純化亞單位疫苗 Ø 合成肽亞單位疫苗 Ø

14、 基因工程亞單位疫苗 合成肽亞單位疫苗（Synthetic peptide subunit vaccine）Ø 合成肽疫苗是指使用化學(xué)方法合成能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫保護(hù)的多肽制成的疫苗。Ø 優(yōu)點：純度和安全性高；副作用小；可長期在常溫下保存；Ø 缺點：其抗原性單一；免疫原性弱。 因此須用幾種合成肽抗原聯(lián)合使用，還須用多種方法提高合成肽的免疫原性。滅活疫苗減毒活疫苗亞單位疫苗制備方法通過化學(xué)或物理方法使病原體失活通過非正常培養(yǎng)選擇減毒株或無毒株以化學(xué)方法獲得病原體的某些具有免疫原性的成分免疫機理病原體失去毒力但保持免疫原性，接種后產(chǎn)生特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞接種后病原體

15、在體內(nèi)有一定生長繁殖能力，類似隱性感染，產(chǎn)生細(xì)胞、體液和局部免疫接種后能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫疫苗穩(wěn)定性相對穩(wěn)定相對不穩(wěn)定穩(wěn)定毒力回升不可能有可能不可能免疫接種多次免疫接種一般為一次性多次免疫接種安全性較安全對免疫缺陷者有危險安全性好常用疫苗乙腦、脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗麻疹、脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗白喉、破傷風(fēng)類毒素，A群腦膜炎球菌多糖疫苗基因工程亞單位疫苗：是指在分離出病原體特異抗原編碼基因的基礎(chǔ)上，將外源基因轉(zhuǎn)入另一個非致病性的微生物內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物，然后通過分離和純化而獲得特異性的蛋白質(zhì)?；蚬こ虂唵挝灰呙绲膬?yōu)點：產(chǎn)量高；純度高；安全性高 ；用于病原體難于培養(yǎng)或有潛在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗

16、研究?；蚬こ虂唵挝灰呙绲娜秉c：與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比 ，免疫效果較差。增強其免疫原性的方法：調(diào)整基因組合使之表達(dá)成顆粒性結(jié)構(gòu) 在體外加以聚團化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球 加入有免疫增強作用的化合物作為佐劑（adjuvant）。 6.固定化酶的性質(zhì)和指標(biāo)、有機相的酶反應(yīng)固定化酶性質(zhì)的改變：1.酶活力的改變：固定話酶活力小于天然酶，專一性也會發(fā)生改變2.酶穩(wěn)定性的提高：熱穩(wěn)定性3.酶最適合PH改變：負(fù)電荷載體制備的固定化酶，最適pH提高；反之亦然 4.酶最適溫度提高5.米氏常數(shù)KM變化指標(biāo)：1.固定化酶（細(xì)胞）的活力酶催化某特定化學(xué)反應(yīng)的能力，可表示為一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度。 單位：

17、每毫克干重固定化酶（細(xì)胞）每分鐘轉(zhuǎn)化底物（或生產(chǎn)產(chǎn)物）的量，表示為mol/(min.mg) 2.偶聯(lián)率及相對活力的測定：用以表示影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)及固定化期間引起的酶失活 固定化酶的活力回收是指固定化以后固定化酶（或細(xì)胞）所顯示的活力占被固定的等量游離酶（細(xì)胞）總活力的百分?jǐn)?shù)3.固定化酶（細(xì)胞）的半衰期 在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示 是衡量操作穩(wěn)定型的指標(biāo)，而操作穩(wěn)定性是影響實用的關(guān)鍵因素。 4.固定化酶的熱穩(wěn)定性 將固定化酶在不同溫度下溫育1h之后，在最適溫度下測定酶活力，固定化酶的活力一般應(yīng)保持在60%以上。為什

18、么采用有機相進(jìn)行酶反應(yīng)？ · 對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物(底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。 · 水的存在往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應(yīng)的發(fā)生。 有機相中酶反應(yīng)的優(yōu)點減少水引起的副反應(yīng) 有利于疏水性底物的反應(yīng) 熱力學(xué)平衡向產(chǎn)物方向移動 提高酶的穩(wěn)定性 酶不溶于有機介質(zhì)，利于回收利用 從低沸點的溶劑中易分離純化產(chǎn)物 無微生物污染 規(guī)模生產(chǎn)水解反應(yīng)（脂肪酶、蛋白酶） 腈水解反應(yīng)（腈水解酶、水合酶） 腈合成反應(yīng)（羥腈化酶） 酯化/酰化反應(yīng)（脂肪酶、蛋白酶） 羰基還原反應(yīng)（酮還原酶、醇脫氫酶）有機相酶反應(yīng)的溶劑體系水-水溶性溶劑均相

19、體系 水-水不溶性溶劑兩相體系 反相膠團（束）體系 單向有機溶劑體系影響有機相酶反應(yīng)的主要因素:水含量 /有機溶劑 /酶 /固定化載體 /pH 7.發(fā)酵過程的影響因素及控制、優(yōu)良菌種的選育發(fā)酵過程的影響因素及控制有一個好的菌種以后要有一個配合菌種生長的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來目標(biāo)是得到最高的產(chǎn)品收率。發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點Ø 菌種本身的代謝特點 生長速率、呼吸強度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率Ø 菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性 溫度、pH、滲透壓、離子強度、溶氧濃度、剪切力等（一）菌體濃度的影響及控制 菌體濃度：是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。菌體濃度不僅反映菌體細(xì)胞的

20、多少，而且反映菌體細(xì)胞生理特性的不同階段。 菌體濃度大小主要取決于：菌體的生長速率以及營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件（溫度、pH、滲透壓和水）。(二) 菌體濃度與產(chǎn)物產(chǎn)率的關(guān)系 在適當(dāng)?shù)纳L速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān)系。 但是，菌體濃度過高，往往也會產(chǎn)生其他的影響，如營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的累積，有可能改變菌體的代謝途徑，特別是對培養(yǎng)液中的溶解氧影響尤為明顯，影響產(chǎn)物產(chǎn)率。 菌體濃度過低，同樣使產(chǎn)物的產(chǎn)率下降?？刂? 在發(fā)酵過程中必須設(shè)法使菌體濃度控制在合適的范圍內(nèi)。 通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中營養(yǎng)基質(zhì)的濃度來控制。首先要有適當(dāng)?shù)呐浔龋缓笸ㄟ^中間補料來調(diào)整。(二）

21、營養(yǎng)物質(zhì)對發(fā)酵的合成和控制各種營養(yǎng)物質(zhì)對微生物生長繁殖和代謝產(chǎn)物的合成都很重要。 1. 碳源的影響及控制 2. 氮源的影響及控制 3. 磷酸鹽的影響及控制 4. 補料的控制1.碳源的影響及控制 碳源可以分為速效碳源和遲效碳源。 速效碳源能被微生物快速利用，合成菌體和產(chǎn)生能量，因此有利于菌體的生長，但過多的分解代謝產(chǎn)物有時會對目標(biāo)產(chǎn)物的合成產(chǎn)生分解代謝阻遏作用，不利于產(chǎn)物的合成。 遲效碳源為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期。 工業(yè)上，采用速效和遲效碳源的混合培養(yǎng)基來控制菌體的生長和產(chǎn)物的合成。 舉例：青霉素乳糖或緩慢滴加葡萄糖2.氮源的影響與控制 氮源分為速效

22、氮源和遲效氮源。 氨基（或銨）態(tài)氮（氨基酸、硫酸銨）和玉米漿屬速效氮源，能被菌體快速利用，促進(jìn)菌體生長，但對某些代謝產(chǎn)物的合成，如抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。 遲效氮源如黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等，對延長次級代謝產(chǎn)物的分泌期，提高產(chǎn)量十分重要。 發(fā)酵過程，要選擇合適的氮源和含量。一般選用含速效和遲效的混合氮源。3.磷酸鹽的影響和控制 磷是微生物分解代謝和合成代謝所必須的成分，保證微生物正常生長所必需的磷酸鹽濃度一般為0.32300mmol，而對次級代謝產(chǎn)物而言所允許的最高平均濃度為1.0mmol，超過10mmol就明顯抑制產(chǎn)物合成，因此控制磷酸鹽濃度對微生物藥物，特別是次級代謝產(chǎn)物

23、的發(fā)酵生產(chǎn)是非常重要的。4.補料的控制 補料對發(fā)酵起到了重要作用：豐富了培養(yǎng)基，避免了菌體過早衰老，使產(chǎn)物合成期延長；控制pH和代謝方向；改善通氣效果；補足因發(fā)酵過程中減少的發(fā)酵液體積。 補料的物質(zhì)包括碳源、氮源、水和其他物質(zhì)（磷酸鹽、前體等）。 補料在菌體生長旺盛后期，發(fā)酵液泡沫液位下降后開始。 補料的關(guān)鍵：控制補料的時間、速率和料配比。（三）溫度的影響及控制 不同微生物的生長對溫度的要求不同，根據(jù)它們對溫度的要求大致可分為四類：嗜冷菌適應(yīng)于0260C生長，嗜溫菌適應(yīng)于15430C生長，嗜熱菌適應(yīng)于37650C生長，嗜高溫菌適應(yīng)于650C以上生長 （四）pH的影響和控制 每一類菌都有其最適的

24、和能耐受的pH范圍，大多數(shù)細(xì)菌生長的最適pH范圍在6.37.5，霉菌和酵母菌生長的最適pH范圍為36，放線菌生長的最適pH范圍為78。 微生物生長階段和產(chǎn)物合成階段的最適pH往往不一樣，這與菌種的特性和產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。引起發(fā)酵液pH下降的因素：培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)，碳源過多，特別是葡萄糖過量，或中間補糖過多，加之溶解氧不足，致使有機酸大量積累而使pH下降；消沫劑加的過多，生理酸性物質(zhì)的存在及氮被利用等。 引起發(fā)酵液pH上升的因素：培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)，氮源過多，氨基酸釋放等；生理堿性物質(zhì)存在，中間補料中氨水或尿素等堿性物質(zhì)加入過多等。（五）溶氧的影響和控制 溶氧是需氧微生物生長所必需的

25、。 發(fā)酵過程中需要不斷通氣和攪拌，才能滿足溶氧要求。 發(fā)酵過程中應(yīng)保持氧濃度在臨界氧濃度以上。 一般發(fā)酵前期，由于產(chǎn)生菌大量繁殖，需氧量大幅度增加，如果此時需氧超過了供養(yǎng)，會使溶解氧明顯下降，溶解氧曲線出現(xiàn)一個低峰。（七）泡沫的影響與控制 發(fā)酵過程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過多的泡沫是有害的 泡沫的定義：一般來說：泡沫是氣體在液體中的粗分散體，屬于氣液非均相體系 美國道康寧公司對泡沫這樣定義：體積密度接近氣體，而不接近液體的“氣/液”分散體。優(yōu)良菌種的選育1.遺傳性轉(zhuǎn)穩(wěn)定2.生長速度快,不易污染3.目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率4.目標(biāo)產(chǎn)物最好分泌到胞外5.盡可能減少類似物的

26、產(chǎn)量6.其所利用生長的培養(yǎng)基簡單,價格低廉8.羥化反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、甾體邊鏈降解1. 甾體的微生物轉(zhuǎn)化：羥化反應(yīng)微生物對甾體羥化的位點眾多，其中以c9、c11，c11、c14, c15, c16, c16、c17、c19角甲基和邊鏈c26位上的羥化較為重要。 微生物轉(zhuǎn)化甾體的羥化酶多是細(xì)胞色素P450依賴型，P450作為末端氧化酶，需要利用分子氧以及與NADPH-依賴的脫氫酶相連接的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。羥化酶所轉(zhuǎn)化的羥基由空氣中的氧直接取代甾體上的氫形成，因此工業(yè)上利用黑根霉菌 轉(zhuǎn)化甾體時需要充分供氧 1）C9羥化：C9位導(dǎo)入羥基后，容易在C9-C10之間引入雙鍵，并可進(jìn)一步導(dǎo)入C11- 羥基或?qū)敕?/p>

27、原子，因此C9羥化屬于甾體藥物合成中的一個關(guān)鍵中間步驟。 另一方面，C9羥化還涉及甾體邊鏈選擇性降解， 在微生物降解甾體邊鏈過程中，防止甾體母核破裂的關(guān)鍵是抑制9-羥化酶對9的羥化。 2）C11羥化：微生物所特有的C11羥化反應(yīng)是最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，它的成功應(yīng)用替代了困難的化學(xué)合成，而其在皮質(zhì)激素類藥物的合成中所得產(chǎn)物具有強抗炎活性，促進(jìn)了皮質(zhì)激素類藥物的合成。 3）C11羥化：C11羥化同樣可以應(yīng)用于甾體激素生產(chǎn)。其中研究較廣泛的有新月彎孢霉，該霉菌對底物結(jié)構(gòu)的變化有較廣的耐受性，能對許多結(jié)構(gòu)不同的甾體進(jìn)行11-羥化。 4）C15 羥化:研究人員將雷斯青霉固定在海藻酸鈣凝膠上

28、制成固定化細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)， 生產(chǎn)后15羥化活性可恢復(fù)。 應(yīng)用-環(huán)糊精無論使用游離細(xì)胞還是固定化細(xì)胞都能提高轉(zhuǎn)化率。 5）C16羥化：除C11位點的羥化外，皮質(zhì)甾體類藥物合成中的另一個重要反應(yīng)是甾體母核的C16羥化。目前C16羥化常采用放線菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入C16-羥基后，使其對電解質(zhì)影響減小，同時抗炎和糖代謝作用不變。 6）C17羥化：在甾體母核上引入C17-羥基后能增加皮質(zhì)甾體藥物的抗炎和糖代謝作用。綠色木霉能對黃體酮的C17羥化，樹枝狀孢囊菌和小瓶瘤孢菌也能對甾體母核進(jìn)行C17羥化。7）C19羥化:C19羥化產(chǎn)物是制備19-失碳甾體化合物的重要中間體。19-失碳甾體較原甾體具有更顯著的生理

29、活性，如19失碳孕甾酮的療效較孕甾酮活性高48倍。 8）雙羥基化：目前，甾體母核常見的雙羥基化反應(yīng)一般發(fā)生在C7 與C15位置。 并頭狀菌屬的某些菌株能將黃體酮轉(zhuǎn)化為7, 15-雙羥基黃體酮。 1. 甾體的微生物轉(zhuǎn)化：脫氫反應(yīng)在皮質(zhì)甾體類藥物的母核C1,2位置導(dǎo)入雙鍵后，能成倍地增加其抗炎 活性。但由于在動物體內(nèi)缺乏相應(yīng)的酶，甾體激素類化合物的C1,2脫氫反應(yīng)不能進(jìn)行， 而通過體外進(jìn)行c1,2脫氫，即可得到更高效的甾體藥物，這也是人工改造獲得高效藥物 的典型例子。 采用化學(xué)脫氫的方法，一般用二氧化硒脫除法，產(chǎn)品中帶有少量難以除盡的對人體有毒害的硒。 微生物脫氫高效無毒，目前己經(jīng)成為甾體抗炎激素

30、藥物合成中不可缺少的一步。 一般情況下，細(xì)菌的脫氫能力比真菌強，如棒狀桿菌中的節(jié)桿菌和分枝桿菌脫氫活力較強。 3-酮基甾體-1-脫氫酶 （KS1DH）是微生物體內(nèi)最常見的脫氫酶。(該反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè))KS1DH 可催化4-3-酮甾體的脫氫，其作用是在3-酮基甾體的A環(huán)上引入1, 2位雙鍵。 KS1DH 同時也是甾體母核降解的關(guān)鍵酶，因為甾體母核降解時也需要甾體A環(huán)上1,2位雙鍵的引入。 KS1DH可催化脫氫反應(yīng)的逆反應(yīng)即C1,2-氫化反應(yīng)，該酶的氫化活性對底物 的特異性類似于3-酮-4-烯甾體的脫氫反應(yīng)。 1. 甾體的微生物轉(zhuǎn)化：甾體邊鏈降解各類具有生理活性的甾體藥物的基本母核目前都是

31、從高等植物和動物中的天然甾體化合物經(jīng)過邊鏈降解、除去厄長的邊鏈得到基本甾體母核 研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物都能夠?qū)⒐檀碱惢衔镒鳛樘荚蠢?，最終將甾體母核環(huán)戊烷多氫菲和邊鏈完全氧化為CO2和水。 固醇邊鏈降解的機制與脂肪酸的氧化途徑相似。膽固醇的邊鏈降解途徑始于C27羥基化，再通過氧化形成C27酸，然后-氧化后先失去丙酸、醋酸，最后脫去丙酸，形成C17酮化合物9-羥化酶 C1,2-脫氫酶(KS1DH) 如何避免甾體母核的降解 (1)對固醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造達(dá)到選擇性降解甾體邊鏈的目的。 在甾體的A 環(huán)形成芳香核后不再會發(fā)生母核的破裂。 或當(dāng)C6-19氧橋存在時會阻礙C1,2 雙鍵導(dǎo)入，從而保護(hù)甾體母核不被

32、微生物進(jìn)一步降解。 (2)在酶抑制劑存在下對甾體進(jìn)行選擇性邊鏈降解。對甾體母核的選擇性邊鏈降 解不但方便甾體藥物的改造，而且可以防止甾體母核的破裂。在微生物轉(zhuǎn)化過程中抑制甾體母核降解的關(guān)鍵酶9-羥化酶或C1,2-脫氫酶的活性，從而達(dá)到選擇性降解固醇邊鏈 的目的。 幾類對甾體母核降解有抑制作用的化合物 作用機制化合物Fe3+絡(luò)合劑2，2'-雙聯(lián)吡啶、1, 10-二氮雜菲羥基喹琳、5-硝基-1，10- 二氮雜菲 ,二苯基硫卡巴腙 二乙基硫氨基甲酸酯、異菸酰肼 鄰苯二胺、4-異丙基-芳庚酚酮取代Fe的金屬離子Ni2+、Co2+、Pb2+ 阻礙巰基功能Se032-、AS02- 氧化還原染料次甲

33、藍(lán)、刀天青(3)應(yīng)用誘變或分子生物學(xué)技術(shù)篩選或構(gòu)建選擇性降解甾體邊鏈的菌株。 采用紫外線、AT-甲基亞硝基胍等 誘變劑，通過誘變技術(shù)篩選可以得到生化阻斷突變株，由于生化阻斷突變株中酶的缺損，可選擇性降解甾體邊鏈而不導(dǎo)致甾體母核的降解，且可以大量積累所需要的中間體。 隨著基因工程的發(fā)展，人們已大量釆用基因工程的手段如基因同源重組技術(shù)改造菌株使之穩(wěn)定高效地積累所需化合物甾體藥物中間體。 9.蛋白質(zhì)化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)藥物化學(xué)修飾、修飾的作用（意義）、修飾策略蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾:通過基團的引入或去除而使蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程 蛋白質(zhì)的藥物化學(xué)修飾:主要是指在分子水平上對蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行化學(xué)改造，通過

34、對主鏈的切割、剪接及化學(xué)基團的引入，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)和生物活性的改變，屬于蛋白質(zhì)改性的范疇蛋白質(zhì)虎穴修飾的意義: 循環(huán)半衰期延長 免疫原性降低或消失，毒副作用減小 物理、化學(xué)、生物穩(wěn)定性增強 修飾策略 :隨機修飾 定點修飾隨機修飾：游離氨基多，同時發(fā)生在多個游離-NH2定點修飾：PEG-醛對-NH2進(jìn)行定點修飾 蛋白質(zhì)分子表面游離賴氨酸殘基的-NH2和N-末端氨基酸殘基的-NH2,兩者具有較高的親核反應(yīng)活性，是蛋白質(zhì)化學(xué)修飾中最常用的被修飾基團。 巰基修飾 · 多為定點修飾。 · 由于蛋白質(zhì)分子中巰基含量較少，利用巰基的高親和性，選取能夠特異性與巰基偶聯(lián)的化學(xué)修飾劑

35、，可以對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行定點修飾。 · 定點引入巰基：糖蛋白的糖基化位點、蛋白質(zhì)的抗原決定簇、蛋白質(zhì)末端等 羧基修飾的位點包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先把修飾劑(如PEG)分子中的羥基轉(zhuǎn)化為氨基，再在碳二亞胺存在下與蛋白質(zhì)的羧基縮合，得到修飾的蛋白質(zhì)。 10.RNA干擾、基因治療、腫瘤的基因治療（新型技術(shù)制藥PPT）有一條論述大題在這里! RNA干擾（RNA interference，RNAi）:是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控和基因沉默的過程 ，其廣泛存在于從植物、無脊椎動物到哺乳動物的各種生物。RNAi的作用原理 雙鏈RNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)RNAi的過程主要分為兩個階段： 啟動階段 執(zhí)行階段 啟動階段 當(dāng)細(xì)胞中由于感染等原因出現(xiàn)雙鏈RNA分子時，細(xì)胞中一種稱為Dicer的核酸酶就會識別這些雙鏈RNA，并將其降解成21-23bp長的小干擾RNA（siRNA），單鏈siRNA與一些蛋白形成復(fù)合體，構(gòu)成“RNA誘導(dǎo)的沉默小體”（RISC） 執(zhí)行階段 當(dāng)目標(biāo)mRNA與RISC中的siRNA完全配對時， RISC就會切割目標(biāo)RNA，并由細(xì)胞中的核酸酶將其進(jìn)一步降解，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá) 長鏈的RNA會誘