PKM2對谷氨酰胺代謝和線粒體損傷的調(diào)控機(jī)制及白藜蘆醇的干預(yù)作用

1、PKM2對谷氨酰胺代謝和線粒體損傷的調(diào)控機(jī)制及白藜蘆醇的干預(yù)作用為應(yīng)對缺氧和低營養(yǎng)條件的腫瘤微環(huán)境, 腫瘤細(xì)胞往往發(fā)生能量代謝的改變,即“代謝重編程”。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面 : 有氧糖酵解和對谷氨酰胺的高度依賴。腫瘤細(xì)胞通過代謝重塑為其生物合成提供大量的中間代謝產(chǎn)物, 表明代謝重編程在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中舉足輕重的作用。腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝途徑均受到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控, 因此探討這兩種代謝途徑間的調(diào)控關(guān)系及其產(chǎn)生原因 , 將為以腫瘤代謝為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。近年來 , 隨著人們對腫瘤細(xì)胞能量代謝重塑的深入研究, 發(fā)現(xiàn) M2型丙酮酸激酶 (M2 type pyruvate

2、 kinase,PKM2)在糖酵解過程中扮演著關(guān)鍵角色。PKM2是糖酵解途徑中將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)化成為丙酮酸和ATP的限速酶。已知 PKM2在腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá), 在協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞葡萄糖相關(guān)代謝途徑 ( 包括糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑 ) 中發(fā)揮關(guān)鍵作用 , 但 PKM2是否參與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控卻鮮為人知。本研究探討了 PKM2與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調(diào)控之間的關(guān)系 , 并對其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究 , 為以代謝為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供新思路 ; 進(jìn)一步以 PKM2作為腫瘤治療的靶點(diǎn) , 探討了白藜蘆醇對 PKM2的干預(yù)作用及分子機(jī)制 , 同時(shí)拓展了白藜蘆醇的藥用價(jià)

3、值。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下 :(1) 探討 PKM2與谷氨酰胺代謝之間的關(guān)系及其分子機(jī)制。研究結(jié)果表明 ,PKM2穩(wěn)定敲低能夠增加谷氨酰胺酶 Gls1 、Gls2,谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)受體SLC1A5及其上游轉(zhuǎn)錄因子 -catenin 、c-Myc 的表達(dá) , 而 PKM2過表達(dá)可抑制其表達(dá) , 表明 -catenin/c-Myc信號(hào)通路介導(dǎo) PKM2對谷氨酰胺代謝的調(diào)控。放線菌素 D實(shí)驗(yàn)顯示 ,PKM2上調(diào) -catenin的表達(dá)主要是通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平 , 而不是通過抑制 mRNA降解。檢測 PKM2不同點(diǎn)突變細(xì)胞株中 -catenin 的表達(dá) , 發(fā)現(xiàn) R399E突變細(xì)胞能明顯抑制 -ca

4、tenin 的表達(dá) , 即二聚體形式的 PKM2發(fā)揮關(guān)鍵作用。PKM2過表達(dá)上調(diào) miR-200a 的表達(dá) ,miR-200a 可與 -catenin 的 3 UTR結(jié)合抑制 -catenin 的表達(dá)。 (2) 探討 PKM2與線粒體功能之間的關(guān)系。采用線粒體探針標(biāo)記 PKM2過表達(dá)及敲低的細(xì)胞中的線粒體 , 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) PKM2過表達(dá)的細(xì)胞中線粒體圍繞細(xì)胞核分布 , 融合線粒體的比例升高 , 線粒體數(shù)量減少。而 PKM2敲低后 , 線粒體分裂為更小的單位 , 數(shù)量增多。qPCR和 western blot 結(jié)果顯示 PKM2過表達(dá)后 , 線粒體分裂蛋白 Drp1 表達(dá)減少 , 融合蛋白

5、Mfn2 表達(dá)升高 ;PKM2敲低后 ,Drp1 表達(dá)升高 ,Mfn2 表達(dá)降低 ; 同時(shí) ,PKM2過表達(dá)導(dǎo)致 ATP生成量減少 , 線粒體 DNA拷貝數(shù)增加 , 電子傳遞鏈復(fù)合物的表達(dá)下降。 (3) 探討 PKM2通過 Drp1 調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)平衡的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示 PKM2過表達(dá)能夠在蛋白水平抑制 p53 表達(dá) ,PKM2敲低促進(jìn)其表達(dá) , 而對 p53mRNA水平?jīng)]有影響。采用 p53 siRNA 處理細(xì)胞后 ,Drp1 隨 p53 表達(dá)的下降而下降 , 表明 PKM2能夠通過 p53 調(diào)控 Drp1 的表達(dá)。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)提示 ,PKM2過表達(dá)促進(jìn)了p53 通過蛋白酶體途徑降解

6、 , 而PKM2敲低可增加 p53 蛋白的穩(wěn)定性 , 該過程是通過 MDM2介導(dǎo)的 p53 泛素化實(shí)現(xiàn)的。免疫共沉淀及GST pull-down 實(shí)驗(yàn)表明 ,PKM2與 p53、 MDM2存在相互作用 ,推測 PKM2與 MDM2可結(jié)合到 p53 不同的結(jié)構(gòu)域形成三元復(fù)合物促進(jìn)p53 的泛素化 ,進(jìn)而通過蛋白酶體途徑被降解。免疫組化檢測宮頸癌病人臨床樣本中PKM2和 Drp1 的表達(dá) , 結(jié)果顯示 PKM2與 Drp1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) , 這與細(xì)胞水平得到的結(jié)果是一致的。 (4) 探討 PKM2通過Mfn2 調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)平衡的分子機(jī)制。研究表明 PKM2過表達(dá)能夠抑制miR-106b 的表達(dá)

7、。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-106b 可以直接靶向 Mfn2 3 UTR,進(jìn)而抑制 Mfn2 的表達(dá)。采用 miR-106b 模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后 , 發(fā)現(xiàn) Mfn2的表達(dá)水平顯著降低 , 融合線粒體的數(shù)量及 mtDNA拷貝數(shù)減少 ,ATP 生成量升高。免疫組化檢測乳腺癌病人臨床樣本中 PKM2和 Mfn2 的表達(dá) , 結(jié)果顯示 PKM2與 Mfn2 的表達(dá)呈正相關(guān) , 這與細(xì)胞中所得結(jié)果是一致的。(5) 探討白藜蘆醇對 PKM2的干預(yù)作用及分子機(jī)制。 研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過靶向抑制 PKM2的表達(dá)發(fā)揮其抗腫瘤活性。白藜蘆醇處理后導(dǎo)致線粒體分裂成更小、 更多的線粒體 , 且 Drp1 和 F

8、is 表達(dá)明顯升高 ,Mfn2 的表達(dá)顯著下降 ,PKM2過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象 ; 另外 , 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵分子 GRP78、CHOP和 Caspase12顯著上升 ,PKM2過表達(dá)后其表達(dá)明顯逆轉(zhuǎn)。檢測 PKM2敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株中上述指標(biāo)的表達(dá) , 發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)及線粒體分裂蛋白表達(dá)上調(diào) , 線粒體融合蛋白表達(dá)下降。以上結(jié)果表明 PKM2介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體分裂參與白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示 miR-326 可直接與 PKM2的 3UTR結(jié)合 , 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇能夠通過上調(diào)miR-326 有效抑制 PKM2的表達(dá)。綜上所述 :PKM2缺失可通過激活 -catenin/c-Myc信號(hào)通路促使谷氨酰胺代謝發(fā)揮代償作用。 PKM2一方面通過 p53/Drp1 軸抑制線粒體分裂 , 另一方面通過 miR-106b/Mfn2 軸促進(jìn)線粒體融合 , 最終引起線粒體過度融合、功能受阻。白藜蘆醇可通過上調(diào)miR-3