PCR反應(yīng)中遇到的幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策

1、PC 阪應(yīng)中遇到的幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策問(wèn)題 1:1:無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)M 樣品 A 樣品 B 正對(duì)照原因分析:1 1 .模板：含有抑制物，含量低2 2 .Buffer.Buffer 對(duì)樣品不合適3 3 . .引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解4 4 .反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短對(duì)策：1 1 . .純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNAEDNAE 加大模板的用量2 2 . .更換 BufferBuffer 或調(diào)整濃度3 3 .重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物4 4 .降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間問(wèn)題 2:2:非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或

2、者非特異性擴(kuò)增帶原因分析：1 1 .引物特異性差2 2 .模板或引物濃度過(guò)高3 3 . .酶量過(guò)多4 4 .Mg2+.Mg2+ 度偏高5 5 . .退火溫度偏低6 6 . .循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：1 1 .重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式 PCRPCR2 2 .適當(dāng)降低模板或引物濃度3 3 . .適當(dāng)減少酶量4 4 .降低鎂離子濃度5 5 . .適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法6 6 . .減少循環(huán)次數(shù)問(wèn)題 3:3:拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈 SmearSmear 狀態(tài)。M12原因分析：1.1.模板不純2.Buffer2.Buffer 不合適3 3 . .退火溫度偏低4 4 . .酶量過(guò)多5 5 .dNTP.dNTP、MgMg2+度偏高6 6 . .循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：1 1 . .純化模板2 2 . .更換 BufferBuffer3 3 . .適當(dāng)提高退火溫度4 4 . .適量用酶5 5 . .適當(dāng)降低 dNTdNT 可口鎂離子的濃度6 6 . .減少循環(huán)次數(shù)問(wèn)題 4:4:假陽(yáng)性現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因分析：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交差污染對(duì)策：1 1 .操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2 2 . .除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒