2022年真核細(xì)胞常見表達載體

1、真核細(xì)胞常見表達載體真核細(xì)胞, 表達載體1、pCMVp-NEO-BAN載體特點:該真核細(xì)胞表達載體分子量為6600堿基對，主要由CMVp啟動子、兔-球蛋白基因內(nèi)含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構(gòu)成，在大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)都能高水平穩(wěn)定地表達外源目的基因。更重要的是，由于該真核細(xì)胞表達載體中抗neo基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用G418篩選，可建立穩(wěn)定的、高表達目的基因的細(xì)胞株。插入外源基因的克隆位點包括Sal1、BamH1和EcoR1位點。注意在此載體中有二個EcoR1位點存在。2、pEGFP, 增強型絳色熒光蛋白表達載體(Enhanced Fluorecent Pro

2、tein Vector)特點: pEGFP表達載體中含有綠色熒光蛋白，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細(xì)胞中高水平表達。載體骨架中的SV40origin使該載體在任何表達SV40 T抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進展復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制，而位于此表達盒上游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。用途: 該表達載體EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位點

3、，將外源基因扦入這些位點，將合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可確定外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達和/或組織中的定位。亦可用于檢測克隆的啟動子活性(取代CMV啟動子,Acet1-Nhe1)。3、pEGFT-Actin, 增強型綠色熒光蛋白/人肌動蛋白表達載體特點:pEGFP-Actin表達載體中含有綠色熒光蛋白和人胞漿-肌動蛋白基因，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細(xì)胞中高水平表達。載體骨架中的SV40origin使該載體在任何表達SV40 T抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進展復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)

4、用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制，而位于此表達盒上游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。用途: pEGFP-Actin載體在真核細(xì)胞表達EGFP-Actin融合蛋白，該蛋白能整合到胞內(nèi)正在生的肌動蛋白，因而在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)含肌動蛋白的亞細(xì)胞構(gòu)造。4、pSV2表達載體特點：該表達質(zhì)粒是以病責(zé)SV40啟動子驅(qū)動在真核細(xì)胞目的基因進展表達的，克隆位點為Hind111。SV40啟動子具有組織/細(xì)胞的選擇特異性。此載體不含neo基因，故不能用來篩選、建立穩(wěn)定的表達細(xì)胞株。5、CMV4 表達

5、載體特點:該真核細(xì)胞表達載體由CMV啟動子驅(qū)動，多克隆區(qū)域酶切位點選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長基因片段以及SV40復(fù)制原點和fl單鏈復(fù)制原點。但值得注意的是，該表達載體不含有neo基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不能用G418篩選穩(wěn)定的表達細(xì)胞株。其他常用克隆Vector：pBluscript II KS DNA     15 ug     pUC18 DNA                25 ug 

6、60;  pUC19 DNA                25 ug     說明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19載體適合于DNA片段的克隆、DNA測序和對外源基因進展表達等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點，當(dāng)外源DNA片段扦入，轉(zhuǎn)化lacZ基因缺乏細(xì)胞，并在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，含有外源DNA載體的細(xì)胞將為白色菌落，而無外源DNA片段載體的細(xì)胞那么為蘭色菌落，由

7、此易于篩選有無外源DNA片段的載體。此外，這些載體中有便于測序的M13、T7和T3的通用引物進展DNA測序。保存液: TE Buffer         TE Buffer組成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0)1mM EDTA             用途: 克隆外源DNA片斷.進展基因表達.使用M13、T7和T3引物進展測序.存在的問題 細(xì)胞的生命活動是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，有些生命活動的機理還不完全清晰，由于插人的目的基因不同，載體構(gòu)建栗用的

8、順式組件不同，組裝的空間位置不同，采用的表達系統(tǒng)不同，目的基因表達水平和陽性克隆篩選率都會有很大差異。另外，由于所有的順式元件存在種屬和組織特異性，所構(gòu)建的高效表達載體不一定在所有細(xì)胞株中均高效表達。再者，細(xì)胞生長狀態(tài)的差異，轉(zhuǎn)染方法的不同培養(yǎng)時閹的長短，篩選藥物濃度的上下，對表達量都有很大影響。所以，需要綜合評價一個表達載體和表達系統(tǒng)，排除一些不定因素，篩選出最正確組合 真核表達載體趨向于既有利于擴增目的基因又有利于篩選陽性克隆的載體的構(gòu)建。許多有效的應(yīng)用范圍廣的強啟動子和增強子被人發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于載體中，大大提高了目的基因的表達量，另外一些強的組成型啟動子，如 SV40早期啟動子+PHTLv，

9、已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞系中。應(yīng)用以GS為篩選標(biāo)志的表達載體可兼有篩選和擴增目的基因兩種功能，是目前研究的重點。以IRES連接的雙順反子表達載體已成為核表達載體的主體。在同一啟動子操縱下，篩選基因或報告基因與目的基因轉(zhuǎn)錄在同一mRNA上通過IRES的作用，表達出兩種蛋白，因而在理論上可認(rèn)為，通過了篩選或表達了報告基因的克隆必為陽性克隆，即表達目的基因的克隆，有報道說這種雙順反子的共表達率為90。這就大大提高了篩選率，簡化了實驗過程。將強啟動子、增強子和可擴增的篩選標(biāo)志組裝在同一載體上，構(gòu)建高效表達和篩選的表達載體并將其運用于最適宜的表達系統(tǒng)中，是當(dāng)今真核表達載體構(gòu)建研究開展方向。內(nèi)容總結(jié)1真核細(xì)胞常見表達載體真核細(xì)胞, 表達載體1、pCMVp-NEO-BAN