分子生物學(xué)基因重組和基因工程

1、基因重組與基因工程基因重組與基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering第十四章第十四章The biochemistry and molecular biology department of BMUKong lijun QQ359452074DNA克隆、測序與重組技術(shù)的歷史克隆、測序與重組技術(shù)的歷史1973年，年，Stanley Cohen等人首次獲得體外等人首次獲得體外重組重組DNA的分子克隆的分子克隆1977年，年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的的化學(xué)裂解化學(xué)裂解DNA測序問世測序問世不久，不久，Sanger

2、 等的雙脫氧測序法等的雙脫氧測序法20世紀(jì)世紀(jì)90年代啟動人類基因組計劃年代啟動人類基因組計劃(human genome project，HGP)重組重組DNA技術(shù)學(xué)技術(shù)學(xué)(Recombinant DNA Technology)第一節(jié)第一節(jié)自然界自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的是經(jīng)常發(fā)生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Naturen自然界不同物種或個體之間的基因重組和基因自然界不同物種或個體之間的基因重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的，它是基因變異和物種演變、轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的，它是基因變異和物種演變

3、、進(jìn)化的基礎(chǔ)。進(jìn)化的基礎(chǔ)。n基因轉(zhuǎn)移和重組也在繁殖、病毒感染、基因表基因轉(zhuǎn)移和重組也在繁殖、病毒感染、基因表達(dá)及癌基因激活等過程中起重要作用達(dá)及癌基因激活等過程中起重要作用n人類進(jìn)行基因克隆、動物克隆以及基因治療等人類進(jìn)行基因克隆、動物克隆以及基因治療等科學(xué)實驗和實踐中所進(jìn)行的基因操作也離不開科學(xué)實驗和實踐中所進(jìn)行的基因操作也離不開基因轉(zhuǎn)移和重組?；蜣D(zhuǎn)移和重組。n重組重組DNA技術(shù)就是基于人們對自然界的基因轉(zhuǎn)技術(shù)就是基于人們對自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組的認(rèn)識發(fā)展起來的。移和重組的認(rèn)識發(fā)展起來的。n基因重組基因重組（Gene re-arrangement，recombination）n是指整段是指

4、整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間、甚至在在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間、甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，井能在新的位置上不同物種之間進(jìn)行交換，井能在新的位置上復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。n是自然界常見的現(xiàn)象，基因重組有病毒介導(dǎo)是自然界常見的現(xiàn)象，基因重組有病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，細(xì)胞在增殖、分裂、分化過程的基因轉(zhuǎn)移，細(xì)胞在增殖、分裂、分化過程也發(fā)生基因重組或重排（也發(fā)生基因重組或重排（rearrangement）n基因重組有多種方式?；蛑亟M有多種方式。DNA重組重組接合作用接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 座

5、座 (transposition)同源重組同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組位點特異的重組(site-specific recombination) 發(fā)生在同源序列間的重組稱為發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組同源重組(homologous recombination)，又稱又稱基本重基本重組（組（general recombination）。 是最基本的是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組是最基本的

6、一、同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式 同源重組需要一些重組蛋白和酶。如同源重組需要一些重組蛋白和酶。如RecA、B、C、D及及DNA連接酶等。連接酶等。 同源重組不依賴特異同源重組不依賴特異DNA序列，而依賴兩序列，而依賴兩分子之間的相同或相似性。若轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的相同或相似性。若轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的外源獲得的外源DNA與宿主與宿主DNA同源同源,那么外源那么外源DNA就可以整合進(jìn)宿主的染色體。就可以整合進(jìn)宿主的染色體。nHolliday模型的模型的4個關(guān)鍵步驟：個關(guān)鍵步驟： 兩個同源染色體兩個同源染色體DNA排列整齊；排列整齊；片段重組體片段重組體(patch recombinant

7、)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；中間體； 通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA； Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體重組體DNA，分別為：，分別為： 片段重組體片段重組體 （見模型圖左邊產(chǎn)物）：（見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組 體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本本D

8、NA。 拼接重組體拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：（見模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。 Holliday模型中，同源重組主要模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟個關(guān)鍵步驟 兩個同源染色體兩個同源染色體DNA排列整齊排列整齊一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體中間體通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組

9、體重組體DNA，分別為：，分別為：片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_侵?jǐn)_(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3

10、 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體5 3 5 5 5 3 3 3 二、接合作用（二、接合作用（conjugation）當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的轉(zhuǎn)移至

11、另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱轉(zhuǎn)移稱為接合作用。為接合作用。細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組方式細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組方式 可接合質(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。 質(zhì)粒質(zhì)粒 有的細(xì)菌染色體外有一比較大的質(zhì)粒有的細(xì)菌染色體外有一比較大的質(zhì)粒 - F 因因子子(F factor) ，是一個小型環(huán)狀雙鏈，是一個小型環(huán)狀雙鏈DNA。F因因子中含有性鞭毛蛋白編碼基因，這決定性鞭毛子中含有性鞭毛蛋白編碼基因，這決定性鞭毛的形成。有的形成。有F因子的細(xì)菌有性鞭毛。當(dāng)因子的細(xì)菌有性鞭毛。當(dāng)F+和和F-的細(xì)菌相互接觸的時候，它們之間通

12、過鞭毛的的細(xì)菌相互接觸的時候，它們之間通過鞭毛的連接構(gòu)成通道，連接構(gòu)成通道， F+細(xì)菌中雙連細(xì)菌中雙連DNA的一條鏈打的一條鏈打開一個缺口，進(jìn)入另一個細(xì)菌，開一個缺口，進(jìn)入另一個細(xì)菌， F+細(xì)菌按滾環(huán)細(xì)菌按滾環(huán)復(fù)制另一條鏈；進(jìn)入復(fù)制另一條鏈；進(jìn)入F-細(xì)菌的那條連做模板，細(xì)菌的那條連做模板，復(fù)制成兩條鏈，這樣兩個細(xì)菌都成為復(fù)制成兩條鏈，這樣兩個細(xì)菌都成為F+細(xì)菌。細(xì)菌。質(zhì)粒質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子分子三、轉(zhuǎn)化作用三、轉(zhuǎn)化作用(transformation)定義：通過自動獲取或人為地供給外定義：通過自動獲取或人為地供給外源源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞

13、獲得新，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化。的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化。 肺炎雙球菌存在無夾膜不致病的無毒型肺炎雙球菌存在無夾膜不致病的無毒型（RH型）和有夾膜的致病型的肺炎雙球菌型）和有夾膜的致病型的肺炎雙球菌（ SH型）。提取致病型肺炎雙球菌的型）。提取致病型肺炎雙球菌的DNA，加入到加入到RH型菌里培養(yǎng)，型菌里培養(yǎng)，RH型就會轉(zhuǎn)化成致病型就會轉(zhuǎn)化成致病的的SH型型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗：四、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用四、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一細(xì)胞出來、再次感染另一細(xì)胞（受體）（受體）時，

14、發(fā)時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移及基因重組即為及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway) 噬菌體感染細(xì)菌時，其外殼留在細(xì)菌噬菌體感染細(xì)菌時，其外殼留在細(xì)菌的表面，噬菌體的表面，噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)其生活途徑有兩種：內(nèi)，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)其生活途徑有兩種：噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑 (lyso

15、genic pathway)1、溶菌生長途徑、溶菌生長途徑 (lysis pathway) DNA在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制，也可以表達(dá)產(chǎn)生噬在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制，也可以表達(dá)產(chǎn)生噬菌體的外殼蛋白，然后包裝成新的菌體的外殼蛋白，然后包裝成新的噬菌體，噬菌體，當(dāng)生成大量的當(dāng)生成大量的噬菌體后，細(xì)胞溶解，噬菌體后，細(xì)胞溶解， 噬菌噬菌體就釋放出來了。體就釋放出來了。例：例：溶菌時，裂解的溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。片段被另一細(xì)菌攝取。 2、溶源菌生長途徑、溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway) DNA進(jìn)入細(xì)菌后，可以通過基因重組整合到進(jìn)入細(xì)菌后，可以通過基因重組整合到細(xì)菌染色體細(xì)菌染色體DNA

16、中，維持下去，隨著細(xì)菌的分裂中，維持下去，隨著細(xì)菌的分裂繁殖，繁殖， DNA被擴增，當(dāng)在一定條件下，這一段被擴增，當(dāng)在一定條件下，這一段 DNA可以被切下來擴增、復(fù)制，進(jìn)入溶菌途徑?？梢员磺邢聛頂U增、復(fù)制，進(jìn)入溶菌途徑。如果如果 DNA 切下時帶有了細(xì)菌的切下時帶有了細(xì)菌的DNA,包裝成噬菌包裝成噬菌體后，新的噬菌體體后，新的噬菌體DNA就帶有細(xì)菌就帶有細(xì)菌DNA, 當(dāng)其再當(dāng)其再感染另外的一個細(xì)菌時，通過溶源途徑，就將原感染另外的一個細(xì)菌時，通過溶源途徑，就將原細(xì)菌的細(xì)菌的DNA，帶給了新的細(xì)菌，這就是轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。，帶給了新的細(xì)菌，這就是轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。目目 錄錄五、位點特異重組，即特異位點間五、位點

17、特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合發(fā)生的整合 位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由是由整合酶整合酶催化，在兩個催化，在兩個DNA序列的特異序列的特異位點間發(fā)生的整合。位點間發(fā)生的整合。噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒病毒cDNA的的長末端重復(fù)序列長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合（二）細(xì)菌

18、的特異位點重組（二）細(xì)菌的特異位點重組沙門菌沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。 hix為反向重復(fù)序列，它們之間的為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段片段可在可在Hin控制下進(jìn)行特異位點重組控制下進(jìn)行特異位點重組(倒位倒位)。H片段上有兩個啟動子片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動，其一驅(qū)動hin基基因表達(dá)，另一正向時驅(qū)動因表達(dá)，另一正向時驅(qū)動H2和和rH1基因基因表達(dá)，反向表達(dá)，反向(倒位倒位)時時H2和和rH1不表達(dá)。不表達(dá)。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重組酶重組酶轉(zhuǎn)位片段轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hin

19、H2IDNA啟動序列啟動序列H1啟動序列啟動序列沙門菌沙門菌H H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩條重和兩條重鏈鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈其中兩個編碼輕鏈( 和和 )，一個編碼重鏈。，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基基因的因的V-J重排均發(fā)生

20、在特異位點上。在重排均發(fā)生在特異位點上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側(cè)片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基。此重排的重組酶基因因rag (recombination activating gene)共有共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列重組信號序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHOHV

21、J單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程六、轉(zhuǎn)座六、轉(zhuǎn)座(transposition) 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為排稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座。 大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的置。這些可移動的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。列和轉(zhuǎn)座子。 插入序列插入序列(insertion sequences,

22、 IS)組成：組成：（一）插入序列轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座 二個分離的二個分離的反向重復(fù)反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列序列：941bp,位于兩側(cè)位于兩側(cè) 特有的特有的正向重復(fù)序列正向重復(fù)序列：412bp，位于反向重復(fù)，位于反向重復(fù)序列外側(cè)，為插入序列所特有。序列外側(cè)，為插入序列所特有。 一個一個轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因編碼基因：產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶，：產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶，引起轉(zhuǎn)座，位于中間引起轉(zhuǎn)座，位于中間長長7501500bp正向重復(fù)序列正向重復(fù)序列正向重復(fù)序列正向重復(fù)序列IRTransposase GeneIR其組成為：其組成為：插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：插入

23、序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：1、保守性轉(zhuǎn)座、保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition) ：2、復(fù)制性轉(zhuǎn)座、復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)：從原位遷至新位從原位遷至新位插入序列復(fù)制后，一個復(fù)制本遷到新位，插入序列復(fù)制后，一個復(fù)制本遷到新位，另一個保留在原位。另一個保留在原位。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Transposon末端反向重復(fù)序列末端反向重復(fù)序列Terminal repeatsTarget DNATransposase makes staggered cuts in the target siteTransposase Gene1、保守性轉(zhuǎn)座、保守性轉(zhuǎn)座

24、錯位開切錯位開切轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子TransposonThe transposon is insterd at the site of the cutsReplication fills in the gapsduplicating the sequences flanking The transposon復(fù)制轉(zhuǎn)座子的旁側(cè)復(fù)制轉(zhuǎn)座子的旁側(cè) 序列，填補空隙序列，填補空隙2 插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個染色體可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。I

25、RIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 細(xì)菌的可流動性元件細(xì)菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、：含有轉(zhuǎn)座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座

26、子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)又稱又稱DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 重組重組DNA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。的豌豆雜交試驗。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。分子。1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國南舊金山由博耶和

27、斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。藥物。1980年年 開始建造第一家應(yīng)用重組開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。英國羅林研究所成功的克隆了多莉。相關(guān)概念相關(guān)概念n DNA克隆克隆n 工具酶工具酶n 目的基因目的基因n 基因載體基因載體基本原理基本原理 重組重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：一、重組一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷來自同一始祖的

28、相同副本或拷貝的集合。貝的集合。 克隆化克隆化(cloning): 獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆分子克隆分子克隆 （DNA克?。┛寺。┘?xì)胞克隆細(xì)胞克隆 個體克隆個體克隆 （動物或植物）（動物或植物） 技術(shù)水平技術(shù)水平應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的DNA）與載體）與載體DNA結(jié)合成具有結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的自我復(fù)制能力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)即即重組體重組體，

29、繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴增選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴增提取獲得大量同一提取獲得大量同一DNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或基因克隆或重組重組DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆各種來源的各種來源的DNA即目的即目的DNA,也叫外源也叫外源DNA 生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等工程、細(xì)胞工程等 目的：目的： 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)

30、物（蛋白質(zhì)） 基因工程基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因?qū)崿F(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組又稱重組DNA技術(shù)技術(shù) / 重組重組DNA工藝學(xué)。工藝學(xué)。（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（基因工程中重要的酶）（基因工程中重要的酶） DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶(PCR技術(shù)中應(yīng)用的一種耐熱的技術(shù)中應(yīng)用的一種耐熱的 DNA聚合酶，聚合酶，95度不變性度不變性)重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中

31、常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35

32、外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補，標(biāo)記或進(jìn)行填補，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。是細(xì)菌內(nèi)是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶，如果

33、有外來的DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，則RE將其水解掉，對細(xì)菌自身起保護(hù)作用。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease，RE) 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)n19701970年，美國的年，美國的Hamilton SmithHamilton Smith偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌（菌（Haemophilus influenzae RdHaemophilus influenzae Rd）能降解外源噬菌體）能降解外源噬菌體DNADNA，且該菌的無細(xì)胞的抽提液也具有降解（酶）活性。，且該菌的無細(xì)胞的抽提液也具有降解（酶）活性。n該酶能降解該酶能降解E.coli DNAE.col

34、i DNA，但不降解產(chǎn)生該酶的，但不降解產(chǎn)生該酶的HaemophilusHaemophilus自身細(xì)胞自身細(xì)胞DNADNA，稱該酶為，稱該酶為HindHind，能結(jié)合并，能結(jié)合并識別的識別的DNADNA序列為序列為：n限制性內(nèi)切酶能夠在限制性內(nèi)切酶能夠在DNADNA上尋找特定的位點切斷雙鏈，上尋找特定的位點切斷雙鏈，被稱為被稱為“分子剪刀”。5-G-T-Py-Pu-A-C-33-C-A-Pu-Py-T-G-5（Py=嘧啶、Pu=嘌呤） 特點特點1 1）均來自微生物，并據(jù)此而進(jìn)行命名；）均來自微生物，并據(jù)此而進(jìn)行命名；2 2）特異識別連續(xù)的）特異識別連續(xù)的4 4、6 6或或8 8個堿基；個堿基；

35、n按其識別順序可以計算切割幾率：按其識別順序可以計算切割幾率：n假定四種堿基在假定四種堿基在DNADNA鏈上隨機分布，則識別鏈上隨機分布，則識別4 4、6 6、8 8個堿基個堿基順序出現(xiàn)的幾率分別是順序出現(xiàn)的幾率分別是1/441/44、1/461/46、1/481/48（識別順序出現(xiàn)（識別順序出現(xiàn)的堿基間隔）。的堿基間隔）。n識別序列越長、切點越少。識別序列越長、切點越少。3 3）識別序列多具有回文結(jié)構(gòu)（）識別序列多具有回文結(jié)構(gòu)（palindromepalindrome）；即識別序列呈二元）；即識別序列呈二元旋轉(zhuǎn)對稱。旋轉(zhuǎn)對稱。n回文結(jié)構(gòu)多數(shù)不是重要的結(jié)構(gòu)基因?；匚慕Y(jié)構(gòu)多數(shù)不是重要的結(jié)構(gòu)基因。

36、4 4）其切割后的）其切割后的DNADNA可產(chǎn)生不同的末端?？僧a(chǎn)生不同的末端。 作用：作用：GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 分類：分類：、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型） 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身，保護(hù)自身DNA?；匚慕Y(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字

37、表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 命名：命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶I：切割位點：非特異性，跟識別位點大于：切割位點：非特異性，跟識別位點大于1000bpII: 同于或接近于識別部位同于或接近于識別部位III: 跟識別位點跟識別位點3端端24-26bp處處切割位點：切割位點： 限制修飾系統(tǒng)限制修飾系統(tǒng)(Restriction and Modification System)n限制性核酸內(nèi)切酶與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回

38、文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口二元旋轉(zhuǎn)對稱，即從到的方向閱讀是完全相同的二元旋轉(zhuǎn)對稱，即從到的方向閱讀是完全相同的5 3 識別的回文結(jié)構(gòu)為短小序列大多為識別的回文結(jié)構(gòu)為短小序列大多為4-6bp4-6bp回文結(jié)構(gòu)指的是：二元旋轉(zhuǎn)對稱回文結(jié)構(gòu)指的是：二元旋轉(zhuǎn)對稱(180(180度旋轉(zhuǎn)度旋轉(zhuǎn)) )，即點對稱，即點對稱注意：線對稱不是回文結(jié)構(gòu)注意：線對稱不是回文結(jié)構(gòu)Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口n限制性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為限制

39、性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為48個bp，6個最多見。n不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱配伍配伍末端末端（compatible end),可用連接酶連接?？捎眠B接酶連接。粘性末端粘性末端端突出端突出端突出端突出5 3 5 AATTC 3 G 5 G 3 AATTC S A T O RA R E P OT E N E TO P E R AR O T A S具有反向重復(fù)序列的是：A、CGGTAGCTAGTTCGB、CGAGGATTAGGAGCC、AAGGTTCGAACCTTD、TTACGTATTACGTA來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，

40、這些酶稱同一位點，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶：同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名稱名稱 識別序列

41、及切割位點識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3

42、Sph 5GCATGC.3C.3切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶（三）目的基因（三）目的基因(target gene) 應(yīng)用重組應(yīng)用重組DNA技術(shù)所要分離、獲得的基因。技術(shù)所要分離、獲得的基因。 應(yīng)用重組應(yīng)用重組DNA技術(shù)的目：技術(shù)的目：1、為分離、獲得某種感興趣的基因或、為分離、獲得某種感興趣的基因或DNA序列，即目的基因（序列，即目的基因（target DNA）或

43、外源）或外源DNA。2 為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)cDNA (complementary DNA)雙稱互補雙稱互補DNA 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA (通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互補的單鏈互補的單鏈DNA。以單鏈。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。 基因組基因組DNA (genomic DNA) 指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體染色體及線粒體)的所有的所有DNA序列。序列。 目的基因的類型：目的基因的類型：DNADNA克隆時構(gòu)建

44、的嵌合體克隆時構(gòu)建的嵌合體DNADNA組成包括：組成包括：載體載體DNA+DNA+目的目的DNADNA獲取目的基因的方法：獲取目的基因的方法：1、直接從組織或細(xì)胞染色體DNA中分離，限制性酶切；2、利用DNA合成儀化學(xué)法合成，或用PCR法擴增；3、提取mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA直接克隆，或建立c-文庫再從中篩選。4、利用鳥槍法建立G-文庫，再用核酸探針從基因文庫中“釣”取。5、PCR方法（四）基因載體（四）基因載體 定義定義能攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)能攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的可獨立復(fù)制的完整有意義的蛋白質(zhì)所采用的可獨立復(fù)制的完整的一些的一些DNA分子。

45、又稱分子。又稱克隆載體克隆載體。其中為表。其中為表達(dá)出蛋白質(zhì)設(shè)計的載體又稱達(dá)出蛋白質(zhì)設(shè)計的載體又稱表達(dá)載體表達(dá)載體。 常用載體常用載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA、噬菌體、噬菌體DNA、病毒、病毒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為設(shè)計的載體稱為克隆載體克隆載體。(大量獲得基因片段大量獲得基因片段)表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。(大量獲得表達(dá)產(chǎn)物大量

46、獲得表達(dá)產(chǎn)物)n載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；的篩選和鑒定；有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNA插入點），常具有插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多個單一酶切位點，稱為多克隆位點多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。理想基因載體應(yīng)具備的條件理想基因載體應(yīng)具備的條件n可在宿主細(xì)胞內(nèi)自行復(fù)制（具有自身的復(fù)制子并能攜帶外源性DNA一同擴增）；n有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點（多克隆位點）；n載體分子應(yīng)盡可能小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制

47、；n有兩個以上的篩選標(biāo)記（抗藥性、酶基因、營養(yǎng)缺陷型、形成嗜菌斑等）。n拷貝數(shù)多、與宿主易于分離、抗剪切力強。n表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞適應(yīng)的啟動子、前導(dǎo)順序、增強子等。 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點特點: : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈?zhǔn)谴嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。大小約為數(shù)千大小約為數(shù)千堿基對。常有堿基對。常有13個抗藥性個抗藥性基因，以利于基因，以利于篩選，能加篩選，能加0.110kb的基因的基因n以

48、大腸桿菌中的質(zhì)粒載體為例：n大腸桿菌有一套自己的染色體，在染色體之外還有一環(huán)狀DNA拿出來，因為它體積小，容易操作，通過人工改造變成載體。載體有幾個重要部分：n1、用來復(fù)制的部分：克隆的話需要復(fù)制，要有調(diào)控的元件n2、人工改造的部分，用來篩選轉(zhuǎn)到細(xì)胞是否成功。因為這一段的編碼產(chǎn)物可以對抗抗菌素對宿主細(xì)胞的殺傷。如氨芐青霉素抗性基因，根據(jù)需要的不同選擇不同的抗性基因。n3、裝上Lac Z基因：乳糖操縱子，外界給了乳糖，可變成半乳糖，如果沒有葡萄糖 Lac Z 如果成功轉(zhuǎn)到大腸桿菌，就會產(chǎn)生n在含有 X-gal 、IPTG的培養(yǎng)基培養(yǎng)，B-半糖苷酶分解X-gal 的顯色反應(yīng)很靈敏。 B-半糖苷酶可

49、以分解X-gal 變成藍(lán)色，如果這個基因遭到破壞，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色， IPTG半乳糖的類似物，很有效地啟動乳糖操縱子的基因轉(zhuǎn)錄。人工構(gòu)建質(zhì)粒人工構(gòu)建質(zhì)粒PBR322全長全長4363堿基對，堿基對，有一個復(fù)制起始點，有一個復(fù)制起始點，2個抗生素的抗性基因個抗生素的抗性基因（氨芐青霉素抗性基因、（氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因）四環(huán)素抗性基因）有多個單一的酶切位點有多個單一的酶切位點 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克隆克隆目的基因較小目的基因較?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆系列（置換型，適用基因組

50、克隆目的基因目的基因較在大較在大） 噬菌體噬菌體(phage) M13 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（改造系統(tǒng)（含含lacZ基因基因） M13mp系列系列 pUC系列系列n對 噬菌體噬菌體DNA中間部分進(jìn)行改造，替換原來的結(jié)構(gòu)基因，裝上目的基中間部分進(jìn)行改造，替換原來的結(jié)構(gòu)基因，裝上目的基因，利用它容易感染原核和真核細(xì)胞的性質(zhì)，把目的基因帶進(jìn)去，其容因，利用它容易感染原核和真核細(xì)胞的性質(zhì)，把目的基因帶進(jìn)去，其容量高，量高，8020Kbn病毒載體用的越來越多，因為病毒感染細(xì)胞的效率非常高（如，大腸桿病毒載體用的越來越多，因為病毒感染細(xì)胞的效率非常高（如，大腸桿菌載體效率不高菌載體效率不高）而病毒幾

51、乎百分之百。）而病毒幾乎百分之百。n病毒依靠表面的蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞結(jié)合，去感染，把它的內(nèi)容物釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)。病毒基因組在兩頭有包裝信號，中間是病毒的結(jié)構(gòu)基因，第一步改造是把兩頭的結(jié)構(gòu)信號拿掉，僅把結(jié)構(gòu)基因重組，轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞，能轉(zhuǎn)成功的話，進(jìn)入的全是結(jié)構(gòu)基因與宿主的基因組整合，利用宿主的一切系統(tǒng)，把它的所有基因產(chǎn)物表達(dá)出來，在胞漿呆著，叫包裝細(xì)胞；第二步，包裝信號與目的基因重組，然后再與載體重組，轉(zhuǎn)染到剛才已經(jīng)建好的包裝細(xì)胞中。包裝信號是與目的基因連在一起的，利用宿主的基因組不斷復(fù)制更多的帶目的基因和包裝信號的片段，這些片段當(dāng)它與與已經(jīng)有了的病毒蛋白相遇，包裝信號發(fā)揮作用，可以包裝成新的病毒（

52、含有目基因但沒有病毒的結(jié)構(gòu)基因了），有感染力但無結(jié)構(gòu)基因了。 柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒動物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）3、其他其他 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid)二、重組二、重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基

53、因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 如果要獲得一個如果要獲得一個DNA克隆，操作：克隆，操作：1、從真核生物染色體、從真核生物染色體DNA中中獲取目的獲取目的DNA。2、基因、基因載體載體的選擇和構(gòu)建，如質(zhì)粒。的選擇和構(gòu)建，如質(zhì)粒。3、將載體和目的基因用同一種限制性內(nèi)切酶來、將載體和目的基因用同一種限制性內(nèi)切酶來切割，產(chǎn)生相同的粘性末端。切割，產(chǎn)生相同的粘性末端。4、切割后將載體與目的基因連接起來（外源基因、切割后將載體與目的基因連接起來（外源基因與載體的并接成與載體的并接成重組體重組體）。）。5、將重

54、組體、將重組體導(dǎo)入受體細(xì)菌（細(xì)胞）導(dǎo)入受體細(xì)菌（細(xì)胞）。6、篩選出含有重組體的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞篩選出含有重組體的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，并無性繁殖，并無性繁殖重組體的目的基因（細(xì)菌重組體的目的基因（細(xì)菌擴增擴增得到得到DNA克?。?。克?。?。7、如果要獲得蛋白質(zhì)，最終還需要表達(dá)。、如果要獲得蛋白質(zhì)，最終還需要表達(dá)。Host宿主細(xì)胞E.Coli the “factory” used in the genetic engineering of insulinn有了基因有了載體，要想最終實現(xiàn)獲得大量基因或產(chǎn)物，最終都要放到host cells實現(xiàn)。最常用的有3類：大腸桿菌、單細(xì)胞的真核生物（酵母B4）真核哺育類細(xì)胞。n

55、拿基因根據(jù)目的不同，取的組織或細(xì)胞不同 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程（一）目的基因的獲取（一）目的基因的獲取分分n化學(xué)合成法化學(xué)合成法（化學(xué)合成儀）（化學(xué)合成儀） 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列的氨基酸序列 ；或可推導(dǎo)出序列的基因，；或可推導(dǎo)出序列的基因，如胰島素的基因、干擾素的基因。如胰島素的基因、干擾素的基因。2. 基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase cha

56、in reaction, PCR) (見第見第22章章) 1 1 化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有由克隆載體所攜帶的所有基因組基因組DNA的集合。的集合。簡稱簡稱G文庫。文庫。它表達(dá)了細(xì)胞整套基因。它表達(dá)了細(xì)胞整套基因。2、從基因組、從基因組DNA文庫獲文庫獲取目的基因

57、取目的基因基因文庫：基因文庫：n提純生物體全部DNA，用限制性內(nèi)切酶隨機切割成大致相同的數(shù)以萬計的片段，重組入同一類載體上，轉(zhuǎn)化宿主菌保存，即得基因文庫。n（1） G-文庫：n用基因組總DNA制備的基因庫。n（2） c-文庫：n用細(xì)胞全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備全套cDNA后建立的基因庫。G-文庫比 c-文庫基因數(shù)目多n就研究一個基因，而且知道這個基因組織中是表達(dá)的，表達(dá)量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑電泳，成功的 RNA是5.8S 18S 28S三個條帶非常清楚，如果5.8S不清楚，湊合用，如果28S 18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA實驗時要在一個獨立的空間，

58、所有東西都獨立，不能與別的實驗混合。得到的是總RNA，我們需要的是mRNA， mRNA尾巴上有polyA ，利用這個特別純化，去掉tRNA、 rRNA，有了mRNA為模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相當(dāng)穩(wěn)定，可以長期保存下來。n有了cDNA，酶、引物、底物通過PCR技術(shù)，大量擴增。由于知道想做的這段基因的分子量，如果想知道這段基因的分子量，跑電泳，就可以大概知道拿到的這段基因是不是想要的基因，如果與理論基因分子量是對應(yīng)的，那就可能是，最終的結(jié)論還需要測序。n如果是想要的基因，與載體重組，重組后轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)到細(xì)胞有三種方法：化學(xué)的、物理的，生物的 。物理的方法比較簡單有

59、基因槍，電轉(zhuǎn)；化學(xué)的方法，比如用Ca2+Cl2處理細(xì)胞，細(xì)胞表面的膜變得疏松，載體容易進(jìn)入。質(zhì)子體感染、病毒感染等都可以轉(zhuǎn)入細(xì)胞n是否轉(zhuǎn)進(jìn)去，就開始篩。用抗生素先篩質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)進(jìn)去了，再用藍(lán)白斑篩目的基因是否進(jìn)去（藍(lán)斑沒有進(jìn)去，白斑進(jìn)去了）限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR

60、cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫基因文庫用隨機切割的真核生物染色體用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫片段構(gòu)建基因文庫 mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 3、 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 提取細(xì)胞全部的提取細(xì)胞全部的mRNAmRNA做模板，通過做模板，通過逆轉(zhuǎn)錄合成互補的逆轉(zhuǎn)錄合成互補的全套雙鏈全套雙鏈cDNAcDNA后后, ,建建立的基因文庫。立的基因文庫。 簡稱簡稱c c文庫文庫。cDNA文庫文庫逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T