生物傳感器的制備及應(yīng)用

1、生物傳感器的制備及應(yīng)用摘要 生物傳感器是一門由生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等多種學(xué)科互相滲透成長起來的高新技術(shù)。因其具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、在復(fù)雜的體系中進行在線連續(xù)監(jiān)測,特別是它的高度自動化、微型化與集成化的特點,從最先提出生物傳感器的設(shè)想至今,其在近幾十年獲得蓬勃而迅速的發(fā)展。在國民經(jīng)濟的各個部門如食品、制藥、化工、臨床檢驗、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測等方面有廣泛的應(yīng)用前景。特別是分子生物學(xué)與微電子學(xué)、光電子學(xué)、微細加工技術(shù)及納米技術(shù)等新學(xué)科、新技術(shù)結(jié)合,正改變著傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)動植物學(xué)的面貌。關(guān)鍵詞 生物傳感器 應(yīng)用 納米材料一、生物傳感器的原理生物傳感器主要是由生物識

2、別和信號分析兩部分組成的生物識別部分是由具有分子識別能力的生物敏感識別元件構(gòu)成,包括細胞、生物素、酶、抗體及核酸等1。信號分析部分通常又叫做換能器,它們的工作原理一般是根據(jù)物質(zhì)電化學(xué)、光學(xué)、質(zhì)量、熱量、磁性等。物理化學(xué)性質(zhì)將被分析物與生物識別元件之間反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)變成易檢測、量化的另一種信號,比如電信號、焚光信號等,再經(jīng)過信號讀取設(shè)備的轉(zhuǎn)換過程,最終得到可以對分析物進行定性或定量檢測的數(shù)據(jù)。生物傳感器識別和檢測待測物的一般反應(yīng)過程為:首先,待測物分子與識別元素接觸;然后,識別元素把待測物分子從樣品中分離出來;接著,轉(zhuǎn)換器將識別反應(yīng)相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)換成可分析的化學(xué)或物理信號;最后,使用現(xiàn)代分析儀器對輸

3、出的信號進行相應(yīng)的轉(zhuǎn)換,將輸出信號轉(zhuǎn)化為可識別的信號。生物傳感器的各個部分包括分析裝置、儀器和系統(tǒng)也由此構(gòu)成。生物傳感器中的識別元素決定了傳感器的特異性,是生物定性識別的決定因素;識別元素與待測分子的親合力,以及換能器和檢測儀表的精密度,在很大程度上決定了傳感器的靈敏度和響應(yīng)速度。二、生物傳感器的分類根據(jù)所用換能器和監(jiān)測物理量、化學(xué)量和生物量可分為電化學(xué)生物傳感器2、光學(xué)生物傳感器3和壓電生物傳感器4等。1、光學(xué)生物傳感器光學(xué)生物傳感器是基于待測物能夠引起傳感器表面某種特定指示劑光吸收率或光傳播發(fā)生反射、折射、散射等性質(zhì)的變化進行設(shè)計的。大量光學(xué)生物傳感器已經(jīng)見諸報道,Borisov等5對近年

4、來光學(xué)生物傳感器的發(fā)展和應(yīng)用進行了綜述。表面等離子共振(SPR)生物傳感器是一種常用的光學(xué)生物傳感器。其光源為偏振光,傳感芯片表面鍍有一層金膜,金膜與微流體流動系統(tǒng)相聯(lián),當(dāng)金膜表面鍵合了目標(biāo)分析物后,檢測器能夠跟蹤溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個過程的變化。SPR生物傳感器能實時監(jiān)測生物分子間的相互作用,且不需要復(fù)雜的標(biāo)記,因此被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床診斷以及食品安全等領(lǐng)域。2、電化學(xué)生物傳感器6電化學(xué)生物傳感器通常包括電流型電位型和電阻型三種類型。它的工作原理是由于待測物的引入使得傳感器表面發(fā)生物理或者化學(xué)變化,這些變化經(jīng)電化學(xué)轉(zhuǎn)換器將其轉(zhuǎn)化為可檢測的電信號。銷電極、金電極和玻

5、碳電極是最常用的工作電極,一方面是因為它們具有良好的導(dǎo)電性;另一方面,它們?nèi)菀滋幚?在檢測過程尤其是生物檢測過程中對待測物無污染。絲網(wǎng)印刷電極也是一種常用的工作電極,常用作電位生物傳感器,電位生物傳感器(在零電流下產(chǎn)生電壓)能夠在很寬的動力學(xué)范圍內(nèi)給出相應(yīng)的對數(shù)響應(yīng)。這種電極雖然只有兩個電極,但是具有很高的靈敏度及良好的穩(wěn)定性,而且即使分析物的制備過程不是很嚴格,也可以對分析物的檢測達到同用HPLC和LC/MS技術(shù)相同的水平。電化學(xué)生物傳感器因其檢測靈敏度高、操作簡便快捷、省時、成本低及所需儀器簡單等優(yōu)點受到廣大科研人員的研究興趣3、壓電生物傳感器7壓電生物傳感器是一種質(zhì)量敏感型生物傳感器,它

6、利用對電壓敏感的石英晶體產(chǎn)生彈性形變而引起其本身共振頻率產(chǎn)生變化來進行檢測的。傳感過程中交流電壓(AC)在晶體中產(chǎn)生駐波的特征頻率,這個特征頻率依賴于晶體的彈性形變。當(dāng)表面覆蓋有生物識別元素的受體鍵合上目標(biāo)分析物后,引起晶體共振頻率的改變,這樣就能獲得檢測信號。三、生物傳感器的應(yīng)用1、生物傳感器應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(1)生物傳感器對葡萄糖的檢測8,9人體中血糖的濃度正常值為3.96.0 mmol/L,對血液中葡萄糖的檢測研究一直是生物傳感器發(fā)展的主要方向。Park等將葡萄糖氧化酶固定在肽納米管上制備了一種安培傳感器,借助金納米粒子的放大作用,在低于人體正常血糖濃度范圍內(nèi)(0.5-2.4 mmol/L

7、)該傳感器可以對葡萄糖進行檢測。Wang等利用Mg-Al-C03能使發(fā)光氨在弱酸性(pH 5.8)溶液中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象對更低濃度(檢測線性范圍是0.005-1.0mmol/L,檢測限為0.1 mol/ L)葡萄糖成功實現(xiàn)了檢測;Wu等用電化學(xué)沉積的辦法制備了普魯士藍/Bi2Se3傳感器,在葡萄糖氧化酶的催化下,該傳感器對葡萄糖的檢測范圍為0.01-11mmol/L,適合用于對正常人體血糖濃度或者血糖濃度稍微偏高或偏低者進行檢測;Li等使用金納米粒子和聚啦咯納米纖維構(gòu)建了一種非酶葡萄糖傳感器,該傳感器對葡萄糖的檢測范圍為0.2-13 mmol/L,相對于酶傳感器來說,該傳感器更穩(wěn)定;Wu等使

8、用Ag納米粒子制備了在生理環(huán)境下能進行顯色檢測的SPR傳感器,該傳感器可以對更寬濃度范圍的葡萄糖(0-20 mmol/L)進行檢測; Yilmaz等經(jīng)過進一步研究獲得了一種可以使用葡萄糖氧化酶或氧化葡萄糖酸桿菌作為靈敏元件的電化學(xué)生物傳感器,該傳感器可以分別對較高濃度血糖(葡萄糖氧化酶:2-16 mmol/L,葡萄糖酸桿菌:1.5-25 mmol/L)實現(xiàn)檢測,提高了對血糖濃度檢測的可信度。大多數(shù)葡萄糖生物傳感器的檢測原理是基于葡萄糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成同等濃度的過氧化氫和葡萄糖酸,因此也可以通過檢測H2O2實現(xiàn)對葡萄糖的間接檢測。Yang等使用銀納米線構(gòu)建了一種傳感器,該傳感器對低濃度H2O

9、2 (20 nmol/L-3.62 mmol/L)表現(xiàn)出良好的線性;Wang等用Pt多孔納米線制備了一種安培計傳感器,該傳感器對H2O2的檢測范圍為4.5mmol/L-27.1 mmol/L,既降低了檢測限,又拓寬了線性范圍;Li等用Mg-Fe雙層氫氧化物將血紅素蛋白固定在玻碳電極表面制備了一種電化學(xué)傳感器,進一步降低了 H2O2的檢測限(0.036 mol/L)。(2)生物傳感器對癌細胞的檢測10,11,12癌癥嚴重危害了人類的生命健康,是造成人力資源喪失的主要原因之一,嚴重影響著社會發(fā)展。對目標(biāo)細胞的直接檢測可以實現(xiàn)對疾病的監(jiān)測,這也是近年來各國科學(xué)家努力的方向。一般來講,電化學(xué)細胞傳感器

10、主要是基于測定細胞吸附于傳感器界面引起的電流和阻抗變化,從而對細胞狀態(tài)和數(shù)量實現(xiàn)間接的分析測定。電化學(xué)阻抗和循環(huán)伏安法常被用于監(jiān)測癌細胞的點連、活性、增殖和調(diào)亡等生理過程。Cheng等人發(fā)展了一種基于辣根過氧化物酶與糖類化合物特異性結(jié)合的電化學(xué)細胞傳感陣列,用于細胞表面糖組碳水化合物的動態(tài)分析。由于細胞表面呈現(xiàn)負電性,在一些研究中,人們通過構(gòu)建正電性的傳感界面,基于靜電相互作用實現(xiàn)細胞的固定和檢測。然而這種基于靜電作用只能實現(xiàn)細胞的非特異性固定,多數(shù)應(yīng)用于細胞的生理狀態(tài)監(jiān)測,以及藥物篩選方面的研究,并不能夠滿足醫(yī)療診斷和治療方面的需求。因此,人們越來越關(guān)注于構(gòu)建具有特異性識別功能的細胞傳感器用

11、于癌細胞的選擇性檢測。腫瘤標(biāo)志物如核仁素、葉酸受體等的反常性特征與很多癌癥密切相關(guān),因而常被選作紀向分子用于設(shè)計能夠選擇性檢測腫瘤細胞的細胞傳感器。例如,Feng等基于適配體AS1411對癌細胞表面過表達的核仁素特異性識別能力構(gòu)建了一種選擇性電化學(xué)細胞傳感器。通過測定修飾電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化從而間接檢測固定的癌細胞數(shù)量。由于多數(shù)腫瘤細胞的細胞膜表面具有過表達的葉酸受體,因而對葉酸受體具有高度親和性的葉酸也常被用作特異性識別癌細胞的功能性分子構(gòu)建癌細胞傳感器。Li等將葉酸修飾到電化學(xué)整流器界面,首次實現(xiàn)了基于分子器件高靈敏度檢測Hela細胞,實現(xiàn)了在大量正常細胞(104個細胞/mL)存在下選

12、擇性檢測其中10個Hela細胞,檢測范圍101-106個/mL。構(gòu)建具有特異性識別功能細胞傳感器的研究目前仍處于早期階段。(3)生物傳感器對DNA的檢測13,14許多疾病的發(fā)生與DNA堿基突變有關(guān)。核酸堿基突變在癌癥的發(fā)生中也起著不可忽視的作用,因此發(fā)展高靈敏度檢測DNA的方法一直是相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜夜餐P(guān)注的問題。在分析領(lǐng)域,各國工作者利用核酸適配體、納米材料等構(gòu)筑了一系列生物傳感器用于DNA的檢測,目前DNA的檢測限通常在nmol/L,借助新材料結(jié)果可達pmol/L,甚至fmol/L。Ren等根據(jù)核酸自身的性質(zhì)構(gòu)建了一種對染料敏感的四極子來檢測目標(biāo)DNA,在目標(biāo)DNA的濃度范圍5-200 nmo

13、l/L內(nèi)該突光傳感器顯示出良好的線性;Sharma等使用CdTe量子點和殼聚糖制備了一種檢測白血病DNA的電化學(xué)生物傳感器,該傳感器對目標(biāo)DNA的檢測限可達2.56 pmol/L; Chung等使用多壁碳納米管進一步構(gòu)建一種高靈敏電化學(xué)傳感器,該傳感器可以在0.1-100 pmol/L范圍內(nèi)對目標(biāo)DNA獲得良好的線性,檢測限更是低至0.031 pmol/L。(4)生物傳感器對其他疾病檢測15,16,17近年來也發(fā)展了對人體內(nèi)其他疾病進行有效檢測的方法。級毛膜促性腺激素(HCG)是一種妊娠激素,檢測值的大小可以直接反應(yīng)女性懷孕天數(shù),非孕女性血HCG正常值不超過10 g/L, Marquina等使

14、用磁性納米粒子制備了GMR傳感器,該傳感器能夠有效的用于對HCG的檢測;凝血酶是一種重要的蛋白質(zhì),在機體內(nèi)通常是不表達的,表達的凝血酶通常與某些疾病的發(fā)生有關(guān),Lee等使用適配子-量子點功能化的納米纖維制備了一種突光傳感器,對凝血酶的檢測限達到了 10 pmol/L,當(dāng)上述傳感器的量子點用突光染料代替后,檢測范圍變成10-200 nmol/L,檢測限為1 nmol/L;尿酸是呤代謝的一種產(chǎn)物,血尿酸的高低與痛風(fēng)有直接關(guān)系,成人體內(nèi)尿酸正常值為90-420 nmol/L。Jindal等用CuO制備了一種傳感器,在脲酶的催化作用下,該傳感器能夠?qū)?.05-1 mmol/L濃度范圍內(nèi)的尿酸進行檢測;

15、癌胚抗原(CEA)是血清中的一種糖蛋白,可以用于檢測腫瘤發(fā)展情況,正常人體內(nèi)癌胚抗原濃度不超過5 ng/L, Lin等使用金納米粒子構(gòu)建了一種突光傳感器,該傳感器可對0.1-10 ng/ml濃度范圍內(nèi)的CEA進行很好的檢測;ATP是生物體內(nèi)一種重要的能量分子,生物體內(nèi)ATP含量的多少可以直接反應(yīng)生物體的狀態(tài),正常細胞和組織裂解液中ATP濃度為0.1-1mol/L, Zhou等設(shè)計了一種基于電化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移的適配子量子點傳感器來檢測ATP,可以檢測至濃度185 nmol/L。由此可見生物傳感器在檢測中有著廣泛的應(yīng)用范圍,隨著新材料、新方法的不斷發(fā)展,其在疾病檢測中的應(yīng)用將有更為廣泛。2、生

16、物傳感器用于食品檢測18,19食品安全問題嚴重影響著人類的身體健康,對食品中各種有毒物質(zhì)的檢測也變得越來越復(fù)雜。生物傳感器的使用使得檢測方法更簡單,檢測結(jié)果更可靠。氨必妥又名瘦肉精,長期接觸或食用會引起人體心律失常等疾病,使用銀納米粒子和石墨稀氧化物構(gòu)建了一種電化學(xué)免疫傳感器,在含量0.01-10ng/ml范圍內(nèi)該傳感器可對氨必妥進行有效的檢測,檢測限低至6.8 pg/ml;亞硫酸鹽被用作多種食品添加劑,因為它們可以防止抑制微生物的活性從而延長食物保持新鮮色澤的時間,但是攝入含亞硫酸鹽食品或飲料容易導(dǎo)致呼吸困難、呼吸急促、哮喘、咳嗽等呼吸道疾病,高濃度的亞硫酸鹽還能造成死亡,國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不同

17、食品中亞硫酸鹽殘留的要求濃度不同:從0.05-0.4 g/kg。Frasca等使用金納米粒子構(gòu)建了一種電化學(xué)傳感器,在人亞硫酸鹽氧化酶的催化作用下,該傳感器對食品中亞硫酸鹽具有良好的選擇性,檢測線性范圍是0.005-5.4 g/kg,可以用于對食品中亞硫酸鹽的檢測。大腸桿菌(E.coli)是一種廣泛存在的細菌,對人類和動物都很重要,生活飲用水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)是不超過3個/L。由于突變的出現(xiàn),新的菌屬越來越多。對健康成年人來說,陌生菌株的危害并不大,但是對于幼兒或者使用某些藥物的病人來講,它們就有潛在的很大威脅,例如E.coli 0157: H7是一種非常危險的菌株。Wang等使用磁性納米粒子構(gòu)建了一

18、種信號放大的表面等離子共振生物傳感器,該傳感器對E.coli0157: H7表現(xiàn)出非常好的檢測性,檢測限為50 CFU/ml,是一般SPR檢測技術(shù)的4倍;Guo等使用金納米粒子功能化的壓電免疫生物傳感器成功實現(xiàn)了對E.coli 0157: H7的檢測,檢測范圍為0-1 log CFU/ml3、生物傳感器用于環(huán)境監(jiān)測20,21,22環(huán)境污染問題在近年來變得日趨嚴重,生物傳感器也已經(jīng)被廣泛的用于大氣污染、水污染等方面的檢測。甲酸是化工工業(yè)的重要原料,在人們的日常生活被廣泛的使用,如建筑涂料、裝飾材料等。由于其較低的溶沸點和良好的水溶性,甲酸常以氣態(tài)或液態(tài)的形式存在于自然界中。過量的甲酵會對人類的呼

19、吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)產(chǎn)生極大的危害,尤其是對呼吸系統(tǒng)有巨大的毒性,用生物傳感器可以實現(xiàn)對甲酵的快速檢測,根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),居室中甲酸的最高值為0.08 mg/m3,一次性食入甲醛超過10 mg就可能引起死亡,水中甲酸含量最高位1 mg/L。Kataky組使用親脂性的四硫富瓦稀-四氰基對苯二醌二甲燒(TTF-TCNQ)鹽作為媒介體,將甲酵脫氧酶固定在聚氨酷膜上構(gòu)建了一種絲網(wǎng)印刷生物傳感器,該傳感器可實現(xiàn)對空氣中甲酸的測定,檢測的線性范圍是從10-3-10-4 mol/L;將乙醇氧化酶固定在相互交叉平面薄膜電極上構(gòu)建了一種電導(dǎo)型酶生物傳感器,該傳感器對甲醒的檢測范圍是1.5-15000 mg

20、/L; Xu等使用甘氨酸作為伯胺提供者來檢測水產(chǎn)品中的甲酸含量,在檢測范圍從0.3-0.75 mg/ml之間獲得了良好的線性相關(guān)系(R2=0.999),測得樣品中甲醒的含量為1.2mg/kg。水質(zhì)監(jiān)測包括很多方面,包括水體中無機有毒物和有機物檢測。無機有毒物檢測包括懸浮物、非金屬有毒物質(zhì)(如氰化物、砷)及金屬毒性離子(如汞、鉻、鎘、銅、鎮(zhèn))等的檢測;有機物檢測包括生化需氧量(BOD)、農(nóng)藥及微生物代謝物等的檢測。以往的檢測都涉及大型儀器及復(fù)雜的操作步驟,利用生物傳感器可以實現(xiàn)靈敏、簡便、及時快速檢測。長期飲用含銅、砷等毒性物質(zhì)的水,會導(dǎo)致人或動物中毒,嚴重的會導(dǎo)致死亡。中華人民共和國對污水中總

21、銅和總神的排放要求最高為0.5 mg/L, Lin等制備了一種功能化聚吡咯納米管電化學(xué)傳感器,該傳感器對水體中Cu2+顯示出了良好的選擇性,檢測范圍是0.0064-1.92 mg/L; Wu等用金納米粒子構(gòu)建了基于核酸適配子的生物傳感器,該傳感器對As (III)的檢測范圍是0.001-1.5 mg/L,目測下檢測限為0.04mg/L,色譜檢測限為0.6g/L,說明該傳感器可以很好的用于水中砷的檢測。微囊藻毒素是一種藍綠藻產(chǎn)生的毒素,可通過飲用水使人類中毒,國際衛(wèi)生組織規(guī)定生活飲用水中微囊藻毒素的最高含量為0.001 mg/L,Shi等用石墨煉氧化物成功構(gòu)建了一直焚光能量共振轉(zhuǎn)移的傳感器,該傳

22、感器對微囊藻毒素的檢測限是0.5g/L; BOD是表示水中有機需氧污染物含量的一個重要指標(biāo),國際標(biāo)準(zhǔn)檢測法是用5天時間,表示為B0D5,檢測范圍在2100000 mg/L,純水的B0D5為13 mg/L,高于10 mg/L說明水質(zhì)很差,一般工業(yè)廢水B0D5最高容許排放值為20 mg/L, Chang等用微生物燃料電池構(gòu)建了一種可以進行實時監(jiān)測BOD的生物傳感器,該傳感器在1.05h對廢水中的BOD的檢測值可達l00mg/L,大大縮短了檢測時間;我國是世界上最大的農(nóng)藥生產(chǎn)國,農(nóng)藥年產(chǎn)量達200萬噸,而有機 殺蟲劑的產(chǎn)量約占50%,有機磷殺蟲劑是一類有毒的農(nóng)藥,其本身和分解過程的中間體不僅會對人或

23、動物產(chǎn)生致癌、致畸作用,甚至?xí)鸹蛲蛔兊?生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥的過程中會產(chǎn)生大量污水對水體造成污染,有機 農(nóng)藥的大量使用也會造成水體的污染,因此對有機 農(nóng)藥的監(jiān)測一直是社會的焦點,我國對工業(yè)廢水中有機磷農(nóng)藥的排放標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為0.2 mg/L, Gong等用碘氧化秘制備了一種光電化學(xué)傳感器,在乙酰膽堿酯酶的催化作用下,該傳感器對有機磷殺蟲劑的檢測限為40ng/L,大大提高了對有機 殺蟲劑的檢出效率。生物傳感器在近年來得到了迅速發(fā)展。針對識別元素種類的千差萬別,生物傳感器對目標(biāo)物的特異性更強,對同一目標(biāo)物的檢測方法也多種多樣。隨著換能器質(zhì)量的不斷提高,生物傳感器的靈敏度也獲得極大提高。這些不僅推動著社

24、會的發(fā)展,也推動著人類健康的發(fā)展。另一方面,由于生物傳感器種類的多樣性,還存在很多尚需解決的問題,尋找和開發(fā)新型識別元素的步伐從未停息。參考文獻1 Ben-Yoav H, Melamed S, Freeman A, et al. Whole-cell biochips for bio-sensing : integration of live cells and inanimate surfaces J. Crit. Rev. Biotechnol., 2011, 31 (4): 337-353.2 Chung D-J, Whittaker A K, Choi S-H. Electrochem

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