農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機理

1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機理農(nóng)桿菌是從土壤中分離出來的革蘭氏陰性細菌,根據(jù)宿主范圍和致病癥狀可分為5種，其中研究最多也最透徹的是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens),它能將自身Tumor-inducing(Ti)質(zhì)粒的一段DNA(T-DNA$移到植物細胞中,從而使植物損傷部位形成冠癭瘤。T-DNA的轉(zhuǎn)化是在Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)一系列Vir基因的作用下產(chǎn)生的。T-DNA是質(zhì)粒上一段1030kb的序列,編碼5個與致瘤有關(guān)的生長素和細胞分裂素合成酶基因。其左右邊界各有一段高度保守的25bp的同向重疊序列(Directrepeat)與T-DNA的轉(zhuǎn)化有關(guān)。其中右邊界是VirD2的共價結(jié)合序列

2、及VirD1/VirD2內(nèi)切的靶序列,VirD2與右邊界的共價結(jié)合及鄰近右邊界的過度驅(qū)動(Overdrive)序列導(dǎo)致了單鏈T-DNA由右邊界剪切并轉(zhuǎn)移的極性，而VirD2與左邊界的結(jié)合可能導(dǎo)致了載體骨架序列的轉(zhuǎn)移。農(nóng)桿菌侵染時，在單糖轉(zhuǎn)運蛋白ChvE的配合下，雙元組分系統(tǒng)的VirA作為感受信號的天線分子受到植物傷口產(chǎn)生的酚類物質(zhì)和糖類的誘導(dǎo)而自動磷酸化,并且隨后使雙元組分系統(tǒng)的另一組分VirG磷酸化為活性狀態(tài),進而通過vir-box激活其他Vir基因的表達,最后由VirD1/VirD2剪切的單鏈VirD2-T-DNA復(fù)合體由VirB和VirD4蛋白組裝成的TypeIVSecretionSys

3、tem(T4SS)運送到宿主細胞，另外的幾個Vir蛋白VirE2、VirE3、VirF、VirD5也同時通過這個通道運送到宿主細胞質(zhì)中。VirD2-T-DNA復(fù)合體在進入宿主細胞質(zhì)中不久,VirE2就結(jié)合上去,通過VirD2核定位信號的引導(dǎo)并在幾個宿主蛋白和農(nóng)桿菌因子的協(xié)助下向細胞核轉(zhuǎn)運，最后結(jié)合在T-DNA上的蛋白被降解，而T-DNA通過一種尚不清楚的機制整合到宿主基因組中(圖1)。由于T-DNA轉(zhuǎn)化不具有序列特異性，因此可用任何感興趣的基因能代替內(nèi)源的T-DNA基因進行轉(zhuǎn)化。圖1T-DNA的加工、轉(zhuǎn)運和整合的途徑（修改自Rossietal.）Fig.1ThepassageofT-DNApr

4、ocessing,transfer,andintegration影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素1、菌株及載體遺傳轉(zhuǎn)化中常用的農(nóng)桿菌菌株有3種類型：胭脂堿型（以C58菌株為代表）、章魚堿型（以LBA4404菌株為代表）和琥珀堿型（以EH101EHA105®株為代表）,菌株選擇的合適與否直接影響了最終的轉(zhuǎn)化效率。另外,菌株和載體的組合對轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，其中超雙元載體pSB131和pTOK233-般用LB4404進行轉(zhuǎn)化。Hiei等的實驗表明,菌株和載體搭配不合適如超強菌株和超雙元載體組合的轉(zhuǎn)化效率比普通農(nóng)桿菌與雙元載體組合的效率還要低。2、Vir基因的活化酚類物質(zhì)或酚類物質(zhì)含量低而不能誘導(dǎo)Vir基因

5、的活化另外,在共轉(zhuǎn)化其間還有許多因素與Vir基因的表達有關(guān),這些因素包括:酸性pH值、低溫培養(yǎng)、高滲透壓等。一些小分子量的糖類如半乳糖、葡萄糖等也能誘導(dǎo)Vir基因的表達,當(dāng)酚類物質(zhì)的水平較低時,糖類誘導(dǎo)Vir基因表達的效果更明顯，這些研究結(jié)果通過Hiei等的GUS舜時表達系統(tǒng)得到了進一步證實。3、受體材料、生長狀況及基因型不同來源、不同發(fā)育狀態(tài)和不同基因型的受體材料對農(nóng)桿菌的敏感性雖然不盡相同，但保持旺盛的細胞分裂和DNAS制是T-DNA整合所必需的。4、培養(yǎng)基成分農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化大致可以分為侵染、共培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)和再生等幾個過程除基本培養(yǎng)基外,根據(jù)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的機制,一般還在

6、培養(yǎng)基中加一些特殊組分來提高農(nóng)桿菌的附著能力、Vir基因的活性和受體材料的感受態(tài)。5、選擇性標記基因除了有效的遺傳轉(zhuǎn)化以外,高效的選擇標記系統(tǒng)也是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所必須的。常用的選擇標記基因主要有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptII（卡那霉素、G418及新霉素抗性）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt（潮霉素B抗性）、修飾的草丁瞬乙酸轉(zhuǎn)移酶pat（草丁膦和雙丙氨膦的抗性）、草丁膦乙酸轉(zhuǎn)移酶bar（雙丙氨膦抗性）、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因epsps（草甘膦抗性）。以上通過抗生素或除草劑殺死未轉(zhuǎn)化細胞進行篩選的系統(tǒng)都屬于負向選擇系統(tǒng)。在這種選擇系統(tǒng)中,雖然陽性轉(zhuǎn)基因株具有抵抗篩選劑的能力,但是標記基因的產(chǎn)物在一定程度上還是對陽性轉(zhuǎn)基因株有一定的毒性,因此目前人們更傾向于使用轉(zhuǎn)化頻率更高的正向篩選系統(tǒng):即標記基因產(chǎn)物通過促進特殊底物的代謝使陽性轉(zhuǎn)基因株“脫穎而出”,從而達到篩選的目的。目前,磷酸甘露糖異構(gòu)酶mpi基因（甘露糖抗性）已用于玉米的正向選擇系統(tǒng)。另外,還需要開發(fā)新的選擇標記以適應(yīng)多基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因后代和高通量篩選的需要，原嚇咻原氧化酶基因ppo（英拜除草劑抗性）