藻類檢測(cè)方法

1、水中藻類檢測(cè)的方法姓名：田家宇專業(yè)：市政工程學(xué)號(hào)：04s027026本文主要從以下三個(gè)方面闡述了水中藻類檢測(cè)的方法：1 .藻類檢測(cè)和計(jì)數(shù)新方法一一置式顯微鏡法；2 .改進(jìn)的水中藻類檢測(cè)方法；3 .藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的測(cè)定方法。一、藻類檢測(cè)和計(jì)數(shù)新方法一一置式顯微鏡法由于環(huán)境污染，一些湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度不斷加劇，導(dǎo)致水中藻類的快速增長(zhǎng)。大量藻類的存在，直接影響了自來(lái)水的生產(chǎn)和供應(yīng)。為了了解藻類對(duì)水廠各工藝環(huán)節(jié)的影響，以湖泊水為水源的許多水廠都相繼開展了藻類計(jì)數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目。國(guó)內(nèi)普遍采用的方法是將1L水樣加魯戈試劑固定在一個(gè)容器中，自然沉降24h后，利用虹吸的方法吸去上清液，并濃縮定容到3050mL

2、,然后取1mL放入血球計(jì)數(shù)板，在正置式顯微鏡下進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)1。此方法由于所需的水樣較多（1L）,在需要采集多個(gè)水樣時(shí)，采集和運(yùn)送的工作量大；在沉樣時(shí)還要多次沖洗轉(zhuǎn)移，增加了產(chǎn)生誤差的機(jī)會(huì)，而且操作不便。昆明自來(lái)水總公司的水源之一是富化程度較高的滇池水，因而昆明水司較早開展了此項(xiàng)目，并得到了瑞士蘇黎世供水局的技術(shù)支持和大力幫助。我們所采用的藻類計(jì)數(shù)方法的特點(diǎn)是使用倒置式顯微鏡，藻樣通過沉樣板一步沉降到位，與國(guó)內(nèi)普遍采用的方法相比具有準(zhǔn)確快捷，水樣用量少，運(yùn)送方便，無(wú)須多次沖洗轉(zhuǎn)移，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于生產(chǎn)和科研檢測(cè)。1 .用品準(zhǔn)備（1）沉樣板。由一個(gè)長(zhǎng)12cm,寬4.1cm,中央有圓形凹槽（底

3、面積為5cm2）的長(zhǎng)方形有機(jī)玻璃板和一個(gè)可滑動(dòng)的、底部與凹槽形狀完全吻合的空心圓筒（容積為25mL）以及一塊圓形蓋玻片組成（見圖1）,有機(jī)玻璃板的左側(cè)有一小孔，用于放掉上清液。（2）倒置式顯微鏡。與普通倒置式顯微鏡不同的是，它的載物臺(tái)經(jīng)簡(jiǎn)單改造，增加了一個(gè)長(zhǎng)方形的金屬框，大小恰好可放置沉樣板。金屬框的作用是將沉樣板固定在載物臺(tái)上，使沉樣板可與載物臺(tái)同步移動(dòng)，避免沉樣板發(fā)生偏移。兩個(gè)目鏡，一個(gè)裝有微型刻度尺，可直接測(cè)量藻類的大小和長(zhǎng)度，另一個(gè)裝有“”形標(biāo)尺，在訐數(shù)時(shí)用它界定訐數(shù)范圍。（3）250mL試劑瓶。用于盛裝水樣。（4）移液管（125mL）。2 .藥品準(zhǔn)備魯戈試劑（LugolsSoluti

4、on）;福爾馬林（40%）;灑精（50%）。3 .方法與步驟3.1 取樣先在250mL試劑中加入67滴魯戈劑，再加入200mL,左右水樣，搖勻。如果水樣需保存較長(zhǎng)時(shí)間，可加入適量福爾馬林（40%）。3.2 沉降用移液管取適量水樣加入沉樣板，再加入蒸儲(chǔ)水至滿，加蓋圓玻片，靜沉水樣，同藻類的多寡而定，藻類數(shù)量多可少取，數(shù)量少可多取，一般水樣體積在間。3.3 計(jì)數(shù)將沉樣板上的圓筒用蓋玻片推開，放掉上清液，置于顯微鏡上，以目鏡上的形標(biāo)尺為界線，隨機(jī)選取若干條帶計(jì)數(shù)。24h。取多少125mL之“工工”一般情況是這樣計(jì)數(shù)的；在10X16倍鏡頭下，計(jì)數(shù)全部視野（1cm2）內(nèi)的大型藻類。在X25的倍鏡下，隨機(jī)

5、選取5條帶，計(jì)數(shù)基中的中型藻類。在10X40倍的鏡頭下，隨在實(shí)際運(yùn)用中，可根據(jù)當(dāng)?shù)氐脑孱惽闆r,3.4計(jì)算（5/AS）nN=確定所選取的條帶數(shù)。V式中N-1mL;沉樣板板底部圓形凹槽的底面積,cm2;機(jī)選取1條帶，計(jì)數(shù)其中的微型藻類。S每個(gè)計(jì)數(shù)條帶的面積，cm2;A選取的條帶數(shù)；V水樣體積；mL;N實(shí)際數(shù)的A個(gè)條帶的藻類個(gè)數(shù)。將上述三個(gè)放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)得的藻類依上式分別計(jì)算，再相加，即得到藻類總數(shù)。3.5清洗計(jì)數(shù)完畢，用蒸留水沖洗沉樣板，浸泡于50%的酒精中過認(rèn)，再次用蒸留水沖洗后,晾干待用。4.注意事項(xiàng)5678沉樣前，要將水樣搖勻?qū)⒊翗影宓膱A筒推開時(shí)，要防止產(chǎn)生氣泡。將沉樣板置于顯微鏡上時(shí)，

6、要盡量保持平衡，避免藻類向一側(cè)傾斜。在選取計(jì)條帶時(shí)，既要注意隨機(jī)性，又要注意均勻性。5.實(shí)際樣品檢測(cè)取某水廠原水用上述方法（簡(jiǎn)稱倒置法）和國(guó)內(nèi)普遍采用的傳統(tǒng)方法（簡(jiǎn)稱正置法）1。分別進(jìn)行藻類檢測(cè)和計(jì)數(shù)，結(jié)果見表低，而且由于正置法使用的血球計(jì)數(shù)的容積所限（0.1m3）,出現(xiàn)在計(jì)數(shù)框內(nèi)的藻類種類也有限，如果需要分類計(jì)數(shù)，有一定局限性，不好操作。倒置法可以一邊分類鑒定，一邊分類計(jì)數(shù)，水樣中存在的種類在1cm2的計(jì)數(shù)范圍內(nèi)基本都能看到，分類鑒定和計(jì)數(shù)的結(jié)果比較全面，操作也方便。另外，倒置法將水樣一步沉降到位，省略了許多中間環(huán)節(jié)，減少了多次沖洗轉(zhuǎn)移帶來(lái)的操作誤差，從而提高了準(zhǔn)確度。6結(jié)論利用倒置式顯微鏡

7、進(jìn)行藻類檢測(cè)和計(jì)數(shù)的方法，比使用正置式顯微鏡的血球計(jì)數(shù)板法水樣用量少，中間環(huán)節(jié)少，準(zhǔn)確快捷，精密度較高，在分類鑒定和計(jì)數(shù)時(shí)，操作較為方便。但該方法使用的沉樣板國(guó)內(nèi)尚無(wú)廠家生產(chǎn)，需要從國(guó)外購(gòu)買。二、改進(jìn)的水中藻類檢測(cè)方法水中藻類傳統(tǒng)的測(cè)定方法是將一定量的水樣加魯哥試劑因定，在筒型分液漏斗中進(jìn)行自然沉淀，48h后，借助虹吸方法吸去上層清液，按要求濃縮定容到3050ml,然后在鏡下計(jì)數(shù)，由于固定沉降時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果常滯后于生產(chǎn)和研究，影響了及時(shí)分析和解決問題。為了解決這一問題，下文對(duì)傳統(tǒng)的檢測(cè)蚊法中的沉淀濃縮進(jìn)行了改進(jìn)，摸索出一種快速測(cè)定藻類的方法，測(cè)定時(shí)間縮至當(dāng)天即可出結(jié)果，而且準(zhǔn)確、可靠，適用

8、于生產(chǎn)和科研檢測(cè)。1測(cè)定原理利用測(cè)大腸菌的抽濾裝置，對(duì)檢測(cè)水樣進(jìn)行抽濾，藻類被截留在濾膜（0.350.65m）上，利用濾膜對(duì)藻細(xì)胞的吸附力并不強(qiáng)，用少量純水在HJ-3型電磁攪拌器上萃取4、5次就能將全部的藻細(xì)胞洗回水中。濾膜的主要成分是硝化纖維素（CN）,可深于丙酮，而丙酮對(duì)藻細(xì)胞形狀基本沒影響，當(dāng)濾膜遇到丙酮后會(huì)變成透明膠液，不影響鏡下觀察檢測(cè)。由于丙酮易揮發(fā)，濾膜變干會(huì)恢復(fù)原型，為了保證藻細(xì)胞和濾膜的濕度，考慮到丙酮和甘油的相容性，甘油的吸潮性及本身的油脂性，能使藻細(xì)胞和濾膜在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持濕潤(rùn)透明，因此，在丙酮溶劑中加了一定比例的甘油，但甘油太多，會(huì)影響濾膜的溶解。2.實(shí)驗(yàn)方法(8)

9、抽濾萃取法取適量水樣，按100:1的量加魯哥試劑固定，在裝有濾膜的抽濾器上進(jìn)行抽濾。取下濾膜，放到100ml的小燒杯里，有藻細(xì)胞的一面朝上，加5-8ml純水；調(diào)好電磁攪拌器轉(zhuǎn)速，使液體攪拌時(shí)不會(huì)向上濺出，將小燒杯放到攪拌器上轉(zhuǎn)1mim左右，取洗液。加入純水58ml純水；重復(fù)上步聚；振洗5次，定空洗液至50ml,在顯微鏡下記數(shù)，計(jì)算公工：N=（A/Ac）x（Vs/VVa）Xn式中，N為每升原水樣中的浮游植物數(shù)量（個(gè)J1）;A為計(jì)數(shù)框的體積（ml）;n為計(jì)數(shù)所得藻類數(shù)目（個(gè)）。(8) 驗(yàn)證法將上述實(shí)驗(yàn)洗凈后的濾膜放入一平面皿，在空調(diào)下或熱源邊（不要超過40C）使濾膜稍干燥，將濾膜放一載玻片上，加二

10、至四滴濾膜透明液，使膜完全溶解成透明膠液，蓋上蓋玻片，在CHK型顯微鏡下觀察。此方法也可用來(lái)驗(yàn)證傳統(tǒng)沉淀法中的棄液藻細(xì)胞流失情況。3結(jié)果及分析取已知數(shù)量的小球藻9.643X1051-1,按上述方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1,兩種方法在實(shí)際水樣中的應(yīng)用結(jié)果如表2所示。傳統(tǒng)沉淀方法精確度低，平行樣相對(duì)偏關(guān)在+15%;測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)，根據(jù)理論推算，最小的藻為沉?xí)r間需要60,我們實(shí)驗(yàn)靜置學(xué)時(shí)間為43H,常有一些較小的藻細(xì)胞隨棄液流失，而且在南方地區(qū)氣溫較高，藻細(xì)胞大都偏小，易發(fā)生流失現(xiàn)象，流失達(dá)30%以上。裹1回收率試.驗(yàn)東桂編號(hào)23平均刑出侑，個(gè)“山心工船9520x1(/8-Wx.相對(duì)誤差/氣1286.

11、7734相對(duì)落差骨0-7757.094.W劃收率-/%9H,72的.296.6源牌上殘盯德!a胞*。個(gè)/W個(gè)稅野內(nèi)11V閱個(gè)視野內(nèi)M0一辦內(nèi)S2兩種方法的比較褪淮奉峨法萃取后流洲中殘心而優(yōu)2.99xtf5個(gè)/50個(gè)鹿野內(nèi)2.69kl(f4個(gè)/50個(gè)現(xiàn)時(shí)內(nèi)測(cè)試方法傳統(tǒng)祖淀法50H葬液中殘存珞瓢金£5數(shù)不"；TflSxlS再不/ST不視押內(nèi)J出廠內(nèi)呼/»匚一75/什門/50個(gè)視野內(nèi)1抽濾萃取法能較好地阻止藻細(xì)胞流失，但由于濾敢太小，一般只能抽濾濁度10NTU以下的水，對(duì)于源水最多只能抽濾200ML左右的水量，太多則濾孔就會(huì)被堵而難以達(dá)到抽濾效果，所以存在取水量較少，影

12、響代表性，如有條件，濾膜孔徑可取在1.51.8M,對(duì)于低濁度的出廠水和濾后水，則不存在這個(gè)問題，可抽濾200-300ml水量，而且能準(zhǔn)確地反映水中殘存藻細(xì)胞的數(shù)量。傳統(tǒng)的沉淀方法中由于染色時(shí)間較長(zhǎng)，藻細(xì)胞和雜質(zhì)均被染成褐色，在鏡下觀察時(shí)，影響藻細(xì)胞的分而抽濾萃取則沒有這種問題，因?yàn)樵寮?xì)胞還保存著很好的原本色澤(絕大多數(shù)為綠色)和形狀，較容易與水中的細(xì)菌、真菌以及低等浮游動(dòng)物、顆粒、纖維等區(qū)分開來(lái)。三、藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的測(cè)定方法下文綜述了用分光光度法，熒光檢測(cè)法及高效液相色譜法測(cè)定藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的方法.分別詳細(xì)介紹了各種方法的設(shè)備，程序，計(jì)算公式及特點(diǎn).。此外,還介紹了藻類類胡蘿卜

13、素的高效液相色譜測(cè)定方法。按測(cè)定方法分為六個(gè)部分：(1)葉綠素a,b和c的分光光度法測(cè)定(三色法);(2)葉綠素a的熒光檢測(cè)法;(3)存在脫鎂葉綠素a時(shí)葉綠素a的分光光度法測(cè)定;(4)存在脫鎂葉綠素a時(shí)葉綠素a的熒光法測(cè)定；(5)高效液相色譜(HPLC)測(cè)定藻類的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物;(6)HPLC測(cè)定藻類葉綠素及類胡蘿卜素。藻類的特異性色素是葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素.浮游藻類里常見的三種葉綠素是葉綠素a,b和c.葉綠素a在一切浮游藻類里大占有機(jī)物干重的12%，是估計(jì)藻類生物量的好指標(biāo).細(xì)胞的葉綠素含量隨種類或類群而有所不同，同時(shí)還受年齡、生長(zhǎng)率、光和營(yíng)養(yǎng)條件的影響.脫鎂葉綠素a(一種葉綠素

14、a的普通降解產(chǎn)物)能夠干擾葉綠素a的測(cè)定，因?yàn)槿绻嬖诿撴V葉綠素a，它能在葉綠素a的相同光譜區(qū)吸收光和熒光，造成葉綠素a值的誤差.當(dāng)測(cè)定葉綠素a的時(shí)候還要測(cè)定脫鎂葉綠素a.葉綠素a和脫鎂葉綠素a之比可作為浮游植物生理?xiàng)l件的一個(gè)良好指標(biāo).下文綜述了用分光光度法，熒光檢測(cè)法及高效液相色譜法測(cè)定藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的方法：(1)葉綠素a,b和c的分光光度法測(cè)定(三色法)；(2)葉綠素a的熒光檢測(cè)法；(3)存在脫鎂葉綠素a時(shí),葉綠素a的分光光度法測(cè)定；(4)存在脫鎂葉綠素a時(shí)葉綠素a的熒光法測(cè)定；(5)高效液相色譜測(cè)定藻類的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物;(6)HPLC測(cè)定藻類葉綠素及類胡蘿卜素.1葉綠素a

15、,b和c的分光光度法測(cè)定(三色法)用丙酮水溶液自浮游生物濃縮樣萃取色素，用分光光度計(jì)測(cè)定萃取物的吸光度.葉綠素自細(xì)胞內(nèi)提出的難度，不同藻類差異相當(dāng)大.為了將色素完全萃出，通常需要用組織研磨器機(jī)械的破壞細(xì)胞.111儀器和試劑(1)分光光度計(jì)：用窄帶的(015210nm).1cm,4cm和10cm光程的比色池.(3)醫(yī)用離心機(jī).(4)組織研磨器(最好使用圓底的研磨管和搗桿).(5)離心:15ml，有刻度和螺帽.(6)過濾設(shè)備：過濾器，濾膜(0145m孔徑,47mm直徑)或玻璃纖維過濾器(GFPC或GFPA,415cm直徑)，真空泵.(7)MgCO3懸浮液：在100ml蒸儲(chǔ)水中加入110g細(xì)粉末Mg

16、CO3.90%(體積比)丙酮水溶液.112測(cè)定程序(1)離心或過濾濃縮水樣.在離心前或過濾的最后一步加入012mlMgCO3懸浮液.(2)把樣品置入組織研磨器，用23ml90%丙酮水溶液覆蓋浸泡.(3)把樣品移入一個(gè)有螺帽的離心管，用幾毫升90%丙酮水溶液洗研磨器，并把洗液加入到萃取液中，用90%丙酮水溶液調(diào)節(jié)體積到510ml.(4)在蓋緊的離心管中于500g離心20min澄清萃取液，把澄清的萃取液傾入一支清潔的，標(biāo)定過的15ml有螺帽的離心管并測(cè)定萃取液的總體積.(5)把萃取移入1cm的比色池，在750、663、645和630nm測(cè)定吸光度(OD).113計(jì)算葉綠素a,b和c的測(cè)定分別使用6

17、63、645和630nm的吸光度.750nm的讀數(shù)用來(lái)校正渾濁度.將每個(gè)色素的OD值中減去這個(gè)渾?度校正值后，帶入下列公式計(jì)算濃度：(1)葉綠素a(mgPl)=11164(OD663)-2116(OD645)+0110(OD630)葉綠素b(mgPl)=20197(OD645)-3194(OD663)-3166(OD630)葉綠素c(mgPl)=54122(OD630)-14118(OD645)-5153(OD663)(2)各單位體積色素量的計(jì)算如下：葉綠素a(mgPm3)=葉綠素a(mgPl)x萃取液的總體積(l)/水樣體積(m3)2葉綠素a的熒光檢測(cè)法葉綠素a的熒光檢測(cè)法比分光光度法靈敏，

18、需樣品較少.而且不要求像分光光度法那樣的波長(zhǎng)分到率，在430nm的激發(fā)波長(zhǎng)和在663nm的發(fā)射波長(zhǎng)抽取在試管內(nèi)測(cè)定葉綠素a可過的最佳靈感度.211儀器和試劑(1)熒光計(jì)，備有高強(qiáng)度F4T.5藍(lán)光燈，光電倍增管R-136(紅敏)，可滑動(dòng)窗孔，光發(fā)射(CS-2-64)和光激發(fā)(CS-5-60)濾光片，以及一個(gè)高靈敏度門.(2)其他設(shè)備和試劑同111212測(cè)定程序用已知濃度的葉綠素溶液標(biāo)定熒光計(jì)：用分光光度法測(cè)定濃度約為2、6、20和60gPl的葉綠素a萃取液，再在每一靈敏度位置對(duì)每一溶液進(jìn)行讀數(shù)，導(dǎo)出標(biāo)定系數(shù)FsFs=CaPRs式中Fs靈敏度位置S的標(biāo)定系數(shù)Rs靈敏度位置S的熒光計(jì)讀數(shù)Ca分光光度

19、法測(cè)定的葉綠素a濃度(WgPl)在能夠取得適中讀數(shù)的各靈敏度位置測(cè)定樣品的熒光，將讀數(shù)乘以適當(dāng)?shù)臉?biāo)定系數(shù)，得到葉綠素a濃度.3存在脫鎂葉綠素a時(shí)葉綠素a的分光光度法測(cè)定由于脫鎂葉綠素在接近葉綠素a相同的波長(zhǎng)上有吸收，因而含有脫鎂葉綠素時(shí)葉綠素a的測(cè)定值可能偏高.葉綠素a由于酸化作用變成脫鎂葉綠素a，吸收峰的值比原來(lái)大約降低40%,并從663nm移至665nm，酸化前后產(chǎn)生的吸收峰之比為1170，可用來(lái)表觀葉綠素a的濃度作脫鎂葉綠素a的校正.311儀器和試劑(1)同111HCl1molL-1312測(cè)定程序(1)用90%丙酮水溶液萃取色素，離心澄清，在750、663nm讀取OD值.(2)在1cm的

20、比色池中用兩滴1molL-1HCl酸化萃取液，輕輕攪拌12min后在750、665nm讀取OD值.(3)酸化前OD663和酸化后OD665值都減去OD750值.313計(jì)算使用校正過的值計(jì)算葉綠素a濃度(C)與脫鎂葉綠素a濃度(P)C(mgPm3)=26173(663b-665a)V1PV2LP(mgPm3)=26173117(665a)-663bV1PV2L式中V1萃取液的體積(l)V2水木的體積(m3)L比色皿液層厚度(cm)663b,665a分別為酸化前后90%丙酮水溶液萃取的吸光度.26173是吸光度校正4存在脫鎂葉綠素a時(shí)葉綠素a的熒光法測(cè)定用熒光法測(cè)定脫鎂葉綠素a的濃度，需要測(cè)定酸化

21、前后丙酮萃取液的熒光.葉綠素a由于酸化后變成脫鎂葉綠素a，致使熒光降低，利用這一原理進(jìn)行測(cè)定萃取液的脫鎂葉綠素a濃度.411儀器和試劑(1)同21a(2)HCl1mol-L-1(3)純?nèi)~名素a412測(cè)定程序校準(zhǔn)熒光計(jì)，在每一靈敏度位置測(cè)定酸化前后萃取液的熒光.計(jì)算校準(zhǔn)系數(shù)(Fs)，用酸化前的熒光讀數(shù)除以酸化后的熒光讀數(shù)，算出酸化前后的熒光比.413計(jì)算葉綠素a(mgPm3)=Fs(Rb-Ra)rP(r-1)脫鎂葉綠素a(mgPm3)=Fs(rRa-Rb)rP(r-1)式中Fs靈敏度位置S的換算系數(shù)Rb萃取液酸化前的熒光Ra萃取液酸化后的熒光77第1期戴榮繼等：藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的測(cè)定方法?

22、1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.rRbPRa高效液相色譜測(cè)定藻類的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物511儀器和試劑除色素提取物外還包括：(1)高效液相色譜儀，流速為210mlPm.(2)裝有100微升進(jìn)樣環(huán)管的高壓進(jìn)樣閥.(3)保護(hù)柱(4103015cm,C18,3科m)(4)反相HPLC柱(C18,10cm,3科m)(5)熒光檢測(cè)器，波長(zhǎng)為430±30nm，可發(fā)射超過600nm熒光.(6)數(shù)據(jù)紀(jì)錄裝置，長(zhǎng)條紙記錄器或電子積分儀.(7)注射器，玻璃,250科LHPLC洗脫齊IJ:洗脫齊1JA(80：15

23、：5;甲醇：I型試齊：離子對(duì)溶液)，洗脫齊UB(80:20;甲醇：丙酮).(9)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物：分別將1ml純?nèi)~綠素a和b溶于100ml90%丙酮中，用分光光度法測(cè)定其準(zhǔn)確濃度.用上述葉綠素a和b標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)鹽酸酸化后制得脫鎂葉綠素a+a'和b+b'標(biāo)準(zhǔn)物;從硅藻中萃取葉綠素c和脫植基葉綠素a，酸化脫植基葉綠素a制得脫鎂葉綠素酸a，分別用薄層色譜法(TLC)純化，分光光度法校準(zhǔn)，作為標(biāo)準(zhǔn)物.512測(cè)定程序(1)用洗脫劑A，流速為210mlPm,建立和平衡HPLC系統(tǒng);校準(zhǔn)熒光計(jì)的感光度，用葉綠素a標(biāo)樣的濃度最大值作為滿刻度.(2)通過先前制備的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)的工作標(biāo)準(zhǔn).分別混合

24、葉綠素與脫植基葉綠素a脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素酸a，作為混合標(biāo)準(zhǔn)物.混合1ml標(biāo)準(zhǔn)與300dL離子對(duì)溶液，平衡5分鐘后進(jìn)樣.混合1ml90%丙酮與300dL離子對(duì)溶液作為空白液.用150dL標(biāo)準(zhǔn)液漂洗注射器2次,注射器中吸入250dL標(biāo)準(zhǔn)液用于進(jìn)樣，將注射器插入進(jìn)樣閥，充滿100dL的進(jìn)樣環(huán)管.建立標(biāo)準(zhǔn)色素濃度與熒光峰面積(或高)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.(3)混合1ml90%丙酮色素提取物與300dL離子對(duì)溶液，作為進(jìn)木¥樣品.(4)使用兩步溶劑程序，用于優(yōu)化葉綠素及其降解產(chǎn)物的分離.進(jìn)樣后,5分鐘內(nèi)將洗脫劑A轉(zhuǎn)變?yōu)橄疵搫〣，維持B15分鐘,流速為210mlPm.在下一次進(jìn)樣前，需用洗脫劑A重新

25、平衡色譜柱5分鐘.總分析時(shí)間約為25分鐘.(5)用下列公式計(jì)算各色素的濃度Ci=AsFiVePVEVs式中Ci=各色素白濃度mgPlAs=各次進(jìn)樣的色素峰面積Fi=標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)因子Ve=進(jìn)樣體積(011ml)VE=萃取體積(ml)Vs=樣品體積(l)(6)這種方法僅用于葉綠素及其降解產(chǎn)物的定量.(7)檢測(cè)限隨熒光計(jì)結(jié)構(gòu)與流速而變，但對(duì)于大多數(shù)葉綠素與它們的降解產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，每次進(jìn)樣檢測(cè)限范圍在10100Pg.HPLC法的精確度主要取決于色素標(biāo)準(zhǔn)樣的純度.更理想的方法是測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣的吸收光譜(350750nm)并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比較.色素的純度也可用HPLC法來(lái)測(cè)定條件是不存在能與標(biāo)準(zhǔn)物的吸收和熒光譜帶相重疊的共洗脫污染物.如果分光光度法測(cè)得的數(shù)據(jù)經(jīng)脫鎂色素校正，HPLC的結(jié)果表達(dá)為色素當(dāng)量(例如：葉綠素a當(dāng)量=脫植基口t綠素a+葉綠素a+葉綠素a',假定使用正確的分子量校正值)，那么HPLC法與分光光度法提供的色素濃度與提供的EPA標(biāo)準(zhǔn)符合得很好.因此如果明顯的存在色素衍生物，用分光光度法測(cè)得的數(shù)據(jù)會(huì)偏高.要HPLC法與熒光法測(cè)得的數(shù)據(jù)一致則取決于附加的葉綠素b,c和它們的衍生