酵母表達(dá)的注意事項(xiàng)

1、1、菌株用GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71品，大部分克隆能表達(dá)。2、溫度：在28度和室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)水平可能都不低。3、pH手冊(cè)上用6.0,pH提高到6.8,不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來(lái)。BMMY勺pH7.0-7.5比較合適。國(guó)內(nèi)外做的最好的rHSA,最適pH大概5-6左右。pH3的時(shí)候yeast和peptone好像會(huì)沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào)，具體比例自己去試試。4、偏愛(ài)密碼子codonbias一般不是主要的問(wèn)題，你要表達(dá)的蛋白特性才是主要問(wèn)題，酵母對(duì)分子量大（30KD以上），結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達(dá)，尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對(duì)一些較小的而且結(jié)

2、構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白表達(dá)量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pichia酵母表達(dá)一個(gè)單鏈抗體，29KD含有2對(duì)二硫鍵，表達(dá)量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達(dá)量沒(méi)有什么提高。5、表達(dá)時(shí)間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)了以后，是會(huì)有很多蛋白分泌出來(lái)的，時(shí)間越長(zhǎng)雜蛋白就越多，且分子量都比較大。最好做一個(gè)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)照，這樣就會(huì)比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。6、污染每個(gè)樣品從G418板上挑10個(gè)左右單克隆于2mlBMGY鑿菌（30ml玻璃管，比LB管大一點(diǎn)），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml,余1ml換2mlBMM誘導(dǎo)表達(dá)，3,4層紗布足夠了。污染一般都是跟瓶口覆

3、蓋有關(guān)的原因造成的，只蓋紗布肯定會(huì)污染。加蓋報(bào)紙后，就再?zèng)]遇到過(guò)污染。如果只用6層紗布，污染的可能當(dāng)然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報(bào)紙拴緊封口，空氣浴搖床。7、不表達(dá)蛋白有沒(méi)有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了，一般重復(fù)2-3次實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有表達(dá)菌株，這個(gè)蛋白就放棄表達(dá)了。8、表達(dá)量30KD,10mg/L表達(dá)量已經(jīng)很高，最直接的方法是發(fā)酵，一般提高510倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。9、糖基化酵母分泌表達(dá)的N糖基化是可以預(yù)測(cè)的，有如下序列：NXS/T就是潛在的糖基化位點(diǎn)，X為任意氨基酸，1個(gè)糖基化位點(diǎn)會(huì)加上1-3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無(wú)法預(yù)測(cè)其

4、位點(diǎn)，不過(guò)很少聽(tīng)說(shuō)表達(dá)蛋白有O糖基化的。如果胞內(nèi)表達(dá)，不存在糖基化的問(wèn)題。10、表型與表達(dá)重組Sall和BglII酶切產(chǎn)生單交換和雙交換，結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)生長(zhǎng)快，消耗的甲醇多，后者生長(zhǎng)慢，消耗的甲醇少，所以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對(duì)某些蛋白Muts菌株可能表達(dá)的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá)較好。11、培養(yǎng)基YPD最基本的培養(yǎng)用；BMGY誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用；BMMY誘導(dǎo)表達(dá)用；MD電轉(zhuǎn)化后篩選his+用。YEPD是不能代替BMGY勺，因?yàn)橛衅咸烟?，這樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過(guò)

5、有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPDf的葡萄糖用3%勺甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會(huì)抑制甲醇利用。BMGYBMM次菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY寸也沒(méi)必'要用5%±濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%3醇至你要的濃度。YNB可以高壓滅菌，沒(méi)問(wèn)題的，也可以0.22um過(guò)濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養(yǎng)基高壓滅菌后加入；配YPD時(shí)可以加入YPD一起滅菌，但時(shí)間不能太長(zhǎng)，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致YPDi化。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反

6、應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養(yǎng)基108度35min高壓滅菌。小量發(fā)酵其實(shí)可以把培養(yǎng)基成分中的YNB和生物素去除，培養(yǎng)基價(jià)格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。如果是用自己配置的培養(yǎng)基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥熬浸提液等等，可以不用換液，采取添料來(lái)維持酵母對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)需要。用無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，更省錢。大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個(gè)鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個(gè)批次100h左右估計(jì)34瓶氧氣。關(guān)于Tryptone和Peptone的選擇：1）用培養(yǎng)

7、E.coli的Tryptone替彳弋Peptone對(duì)有些酵母菌可以，例如一般的表達(dá)酵母.但是對(duì)有酵母菌些絕對(duì)不行.例如做雙雜交的AH109,Y187之類表達(dá)酵母，根本就長(zhǎng)不好.2）Tryptone和Peptone雖然都是營(yíng)養(yǎng)月東，但營(yíng)養(yǎng)成分不一樣.即使是一般的表達(dá)酵母可以在Tryptone生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)也沒(méi)有在Peptone中好.但tryptone和peptone就是含量上有點(diǎn)不同外，其他沒(méi)什么區(qū)別，用peptone的目的不是為了提供氮源，提供氮源的是培養(yǎng)基里面的YNB3）如果要求不高，一般使用也還湊合.盡可能的用Peptone,difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國(guó)產(chǎn)的蛋白月東都可以

8、很正常的培養(yǎng)絕大多數(shù)酵母菌.4）用含Peptone的培養(yǎng)基顏色很深，純化表達(dá)蛋白時(shí)顏色要去掉，所以還要進(jìn)行麻煩的后續(xù)處理。而改用Tryptone后，培養(yǎng)基顏色變得很淺，和LB（液體）顏色差不多，后續(xù)處理要簡(jiǎn)單些。invitrogen說(shuō)明書說(shuō)peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競(jìng)爭(zhēng)性抑制目的蛋白的水解，因?yàn)閜eptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培養(yǎng)畢赤酵母，書上說(shuō)BIOTIN儲(chǔ)液是水溶液，但事實(shí)上BIOTIN很難溶于水，可以稍稍水浴加熱一下。配制500XBIOTINstocksolution（0.02%）有這么3種方案：1）、懶人是將Biot

9、in直接溶在去離子水中，放過(guò)夜，基本就能溶；2）、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH就很容易溶解了；3）、水浴加熱，溫度不能高于50度。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過(guò)程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB中、酵母粉、蛋白陳中均含有一定量的生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。MDMM屬于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，沒(méi)有哪種成分會(huì)含有微量生長(zhǎng)因子（如生物素）。所以肯定要加的。附：無(wú)機(jī)培養(yǎng)基配方BSM6機(jī)培養(yǎng)基：85%H3PO426.7ml/LCaSO4?2H2O0.93g/LK2SO418.2g/LMgSO4?2H2O14.9g

10、/LKOH4.13g/L甘油40g/LPMT14.0ml/L100%M水調(diào)pH5.0（1瓶50ml加800ul氨水）或10g/L硫酸鏤調(diào)pH5.0,氨水用于上罐調(diào)pH（便宜，方便）。誘導(dǎo)表達(dá)前調(diào)pH6.0opH5.0是為了防止BSM形成磷酸鈣沉淀，pH6.0是表達(dá)HSA融合蛋白的最適pH。BS曬壓滅菌后再加4.0ml/L過(guò)濾除菌的PTM1（微量元素）4.0ml/L。100%勺500ml甲醇加6mlPMT1,用于補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的融合蛋白。PMT1（1L）配方：CuSO4?5H2O6.0g/LKI0.088g/LMnSO4?H2O3.0g/LNa2MoO4?2H2O0.2g/LH3BO30.0

11、2g/LCoCl2?6H2O0.5g/LZnCl220.0g/LFeSO4?7H2O65.0g/LBiotin0.2g/L濃H2SO45.0ml12、蛋白降解分泌表達(dá)的目標(biāo)蛋白比胞內(nèi)蛋白確實(shí)容易被降解?？梢試L試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養(yǎng)液的pH值減少酶活，酵母生長(zhǎng)pH值比較廣，47都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當(dāng)酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最適下罐（搖瓶也一樣），寧可少表達(dá)點(diǎn)也別給降解光了。實(shí)在沒(méi)辦法，只好換菌株或做pcr突變酶切位點(diǎn)（當(dāng)然不能影響表達(dá)和蛋白活性）。Severalstrategieshavebeenreportedaseffectiveinminimizin

12、gtheproteolyticinstabilityofspecificforeignproteinssecretedintotheP.pastorisculturemedium.1）、Thefirstisaddingtotheculturemediumofamino-acidrichsupplementsuchaspeptoneorcasaminoacid,whichreduceproductdegradationpossiblybyactingasexecesssubstratesforoneormoreproblemproteases.2）、Thesecondstrategytomini

13、mizeproteolyticdegradationistooptimizetheculturepHbetweenpH3.0andpH7.0.3）、Thethirdstrategyinvolveselevatingthelevelofammoniumintheculturebrothadequately,whichisexplainedbythehypothesisthatporteaseactivityisinducedundernitrogenstarvation.Theforthstrategyislettheculturetemperature28deginsteadof30deg.連

14、續(xù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的堿性氨基酸相鄰的結(jié)構(gòu)，如果有的話，在這一位點(diǎn)是很容易被蛋白酶切斷，產(chǎn)生偏小的多肽。13、換液通常用BMGYeBMM鏘要換液的，但也可以不用換液。培養(yǎng)到菌液渾濁后，直接向BMGYS加甲醇誘導(dǎo)就行了。GS115在第4天達(dá)到了最高表達(dá)量。換液不是必要的，適量甘油的存在有時(shí)反而會(huì)使表達(dá)量提高，10ml生長(zhǎng)培養(yǎng)后，等體積換液。我用250三角瓶，裝量25mlBMG您酉22天，再取0.5ml加入BMMY250三角瓶，裝量25ml）中誘導(dǎo)發(fā)酵.BMG林口BMMY勺換液方式有2種：1）一種是離心換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到滅菌大離心管中，4000rpm室溫離心5分鐘后，用BMM毗下菌體，再

15、轉(zhuǎn)移到搖瓶，整個(gè)過(guò)程均用滅菌移液管操作。另外2）一種是靜止換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，將搖瓶在無(wú)菌室靜止4小時(shí)后，直接在酒精燈旁傾倒培養(yǎng)液，再加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此種方法的缺點(diǎn)有少量生長(zhǎng)培養(yǎng)基殘留。是離心換液或者靜止換液，到底那個(gè)好，只有根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)考量。如果只是從防治污染的角度來(lái)說(shuō)，靜止換液也好一些，因?yàn)椴僮鳟吘股僖恍?，速度也快。總之，無(wú)論是取樣還是補(bǔ)料、加甲醇，盡量用滅菌的移液管（因?yàn)楸容^長(zhǎng)，不容易引起污染）。當(dāng)然，微量的如200ul,還是用移液器加（快而準(zhǔn)確），可以在瓶口處往瓶?jī)?nèi)加入100%甲醇等。用新開(kāi)啟的分析純甲醇，我們都沒(méi)有過(guò)濾或者其他處理，一直放在無(wú)菌室里面，每次直接用滅菌TI

16、P吸取加入搖瓶就可以了。實(shí)驗(yàn)室里也有人試過(guò)用膜過(guò)濾，結(jié)果膜都溶解了。14、上罐表達(dá)放罐時(shí)OD能達(dá)到400左右，生長(zhǎng)過(guò)程最高OD50曲右，重組蛋白發(fā)酵水平大約300-400mg/L。30g/L甘油初始培養(yǎng)OD勺40左右，流加約420g/L甘油后，菌體密度達(dá)到最高約500。開(kāi)始誘導(dǎo)后，起初3-5h之內(nèi)流加的甲醇很少，發(fā)酵體積變化小，但是菌體的OD值是快速下降的，一般是原來(lái)的90%£右，每次都是這樣，確切原因我們也還不清楚，估計(jì)是酵母從高速生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向營(yíng)養(yǎng)饑餓過(guò)程中，菌體形態(tài)發(fā)生很大變化，比如大小、含水量、折光率等。隨酵母逐漸適應(yīng)利用甲醇為碳源，mut+型酵母的誘導(dǎo)可以將甲醇的流速逐步提高，此

17、時(shí)仍然能發(fā)現(xiàn)OD值下降，我們認(rèn)為這主要是發(fā)酵體積增加的原因造成的。我們誘導(dǎo)過(guò)程一般增加約40%的體積7L到10L,最終OD直約為最高OD直白80%£右，簡(jiǎn)單換算一下，應(yīng)該知道菌體生物量增加約1/7。其實(shí)，這和畢赤酵母代謝甲醇途徑也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分繼續(xù)氧化成甲酸進(jìn)而生成CO2產(chǎn)生菌體所需的能量，另一部分可以被菌體同化，進(jìn)入小分子碳架的合成途徑，提供菌體生長(zhǎng)所需的碳源。15、菌體密度：菌體是在BMM件培養(yǎng)的，可以不用BMM做對(duì)照，在600nm處測(cè)OD直，培養(yǎng)基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。麥芽浸提液培養(yǎng)酵母（不換液，補(bǔ)料），生長(zhǎng)階段結(jié)束后，密度可達(dá)到10-12

18、,誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，密度可達(dá)到18左右。如果用1體積的BMGY在生長(zhǎng)階段結(jié)束后，換液時(shí)，加入1/101/2體積的BMMY®行誘導(dǎo)培養(yǎng)（即濃縮培養(yǎng)），細(xì)胞密度也可達(dá)到20以上。通常，真正的高密度發(fā)酵只有在發(fā)酵罐里才能實(shí)現(xiàn)，OD600可達(dá)到40-60及以上。搖瓶很難達(dá)到那樣的密度，不過(guò)可以采取濃縮培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)高密度。搖瓶不能像發(fā)酵罐那樣保證通氣量，但可以通過(guò)裝量來(lái)暫時(shí)替代這個(gè)指標(biāo)。17、菌種保存用15%t油做保護(hù)劑，-70度長(zhǎng)期保存，-20度短期保存使用。不過(guò)要注意凍存前一定充分混勻，酵母菌體很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。一般OD2-6的YPD過(guò)夜菌吸取300ul菌液到滅菌的

19、EP管然后加等體積的甘油，混勻，放于20度.保存長(zhǎng)的話最好放8。度冰箱。重組菌株傳代次數(shù)太多，確實(shí)可能存在菌株退化的現(xiàn)象。這在用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如CHONS0系統(tǒng)更為明顯，所以一定要保存好最原始的重組菌株，每次從中劃板，挑單克隆表達(dá)，盡量減少菌株傳代次數(shù)。不行的話再用相同的方法重新轉(zhuǎn)化篩選高表達(dá)菌株。GS115的鑒定方法接種GS115于5mlYPD夜體培養(yǎng)基，30C,200rpm振蕩過(guò)夜，涂布YPD平板，30c培養(yǎng)48小時(shí)，用YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長(zhǎng)而在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的單菌落劃YPD平板，4c保存。GS115的his4基因突變了，不能在

20、組胺酸缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，一般的YPD培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，什么都有了，而YNB卻只含基本氮源，GS115應(yīng)該在上面不長(zhǎng)，就是從YPD上挑菌落，在YNB和補(bǔ)充了HIS的平板上對(duì)應(yīng)的點(diǎn)一下，在HIS上長(zhǎng)而YNB±不長(zhǎng)的是GS115這樣能挑到純的，以防突變。附：TCA沉淀方法；ELISAprotocol;原位雙膜法快速檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)株:TCA沉淀方法培養(yǎng)基上清直接電泳跑出來(lái)的條帶經(jīng)常很難看，可以TCA沉淀濃縮后跑電泳，。表達(dá)上清很少有直接考染能看得到條帶的，1ml表達(dá)上清濃縮到20ul直接電泳。一般表達(dá)量大于1mg/ml可以看到明顯條帶，但重復(fù)性不好。具體步驟：1 .菌液10000g，離心5分鐘

21、，收集表達(dá)上清。2 .取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9體積的100%TCA顛倒10次混勻。3 .樣品置于冰浴中大于0.5小時(shí)，過(guò)夜效果更好。4.15000g,離心1020分鐘，可見(jiàn)有棕黑色沉淀，倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。5.將EP管倒置于吸水紙長(zhǎng)，37度烘箱1020分鐘，待管底無(wú)明顯液體殘留，如果管壁還殘留有液體，可以吸水紙吸掉?？梢愿某墒覝鼗蛴秒姶碉L(fēng)，關(guān)鍵是除去管底和管壁殘余液體。6.15000g,離心1020分鐘，用20ul槍頭盡量吸去管底殘余的液體，此步驟要快，不然沉淀容易散開(kāi)，降低蛋白回U率，一般最多幾u(yù)l或者沒(méi)有，注意不要吸到沉

22、淀。7 .EP管倒置于吸水紙長(zhǎng)，37度烘箱5分鐘，確認(rèn)管壁和管底沒(méi)有液體殘留。8 .加入20-50ulLoadingbuffer,95度加熱10nim,一般沉淀會(huì)自動(dòng)溶解，如果不溶，用手指輕彈管壁或用20ul槍頭輕輕吸打，注意整個(gè)操作盡量不要碰到管壁，因?yàn)楣鼙诳赡苷从袣堄郥CA如果藍(lán)色的Loadingbuffer不變成黃色，說(shuō)明殘余TCA吸棄了干凈，如果變黃，一般不影響電泳。此方法連丙酮洗這一步都省了，而且不影響電泳效果?；蛘叩?步和第6步改為丙酮洗：5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指輕彈EP管，洗去管底和管壁殘余的TCA6.15000g,離心1020分鐘，倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上輕

23、輕控幾下，除去殘余在管Loadingbuffer溶解蛋白沉淀，始終不能溶解，Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，顏色比較少，一般用丙酮洗一步后很好溶。沉淀不溶,口的液體。樣品是酵母細(xì)胞超聲后離心獲得的上清，用而且加熱超過(guò)10分鐘以后也依舊不溶解。是綠的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的,很可能是TCA沒(méi)有除干凈）ELISAprotocol用BMM格養(yǎng)基一般表達(dá)12天收集表達(dá)上清，稀釋一定比例鋪板做ELISA檢測(cè)1 .取510ulBMMY表達(dá)上清用0.05MNaHCO3稀釋到100ul鋪ELISA板，37度或室溫振蕩大于1小時(shí)。注意一定要做一個(gè)GS115空菌株表達(dá)上清作為陰性對(duì)照，最

24、好還找一個(gè)帶有histag的蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。2 .TPBS洗板3次，方法：倒掉鋪板液，倒置于毛巾上輕輕拍打幾次，力口TPBS至滿，重復(fù)。3 .加封閉液（TPBS力口1%脫脂奶粉）350ml/孔，室溫下放置40分鐘一1小時(shí)，TPBSc3次。4 .加封閉液稀釋的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.51小時(shí)，TPBSc3次。很多公司都有histag的單抗，個(gè)人覺(jué)得Qiagen和Pharmacia單抗較好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1:1000-5000稀釋，不同公司的抗體效價(jià)不同。5 .加封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.51小時(shí)，TPBS洗3次。二抗很多公司有，國(guó)產(chǎn)的華美都可以，1:500-10000如果是HRP標(biāo)記的histag抗體，不加二抗直接顯色。6 .加入OPD顯色液100ul/孔，避光反應(yīng)約1030分鐘。顯色液配方：1