細胞生物學實驗

1、WORD格式實驗室規(guī)那么和要求一般規(guī)定1. 上課第一天請先熟悉環(huán)境，牢記“平安是進展任何實驗最重要的事項。2. 在實驗室內請穿著實驗衣最好長及膝蓋下 ，防止穿著涼鞋、拖鞋腳趾不要裸露。留有長發(fā)者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危險或污染實驗。3. 在實驗室內制止吸煙、吃東西、飲食、化裝、嚼口香糖、嬉戲奔跑，食物飲料勿存放于實驗室的冰箱中，實驗桌上勿堆放書包、書籍、衣服外套及雜物等。4. 所有實驗儀器、耗材、藥品等均屬實驗室所有，不得攜出實驗室外。每組分配之儀器、耗材請在課程開場前確定清點與保管，課程完畢后如數(shù)清點繳回。公用儀器請善加愛惜使用。實驗前后，請把工作區(qū)域清理擦拭，并隨時保持環(huán)境清潔。5

2、. 實驗前詳閱實驗內容，了解實驗細節(jié)的原理及操作，注意上課所告知的本卷須知。實驗進展中有任何狀況或疑問，隨時發(fā)問，切勿私自變更實驗程序。打翻任何藥品試劑及器皿時，請隨即清理。實驗后，適切記下自己的結果，嚴禁抄襲，確實關閉不用之電源、水、酒精燈及瓦斯等。6. 身體不適、睡眠缺乏、精神不濟或注意力無法集中，請立即停頓實驗。實驗時間假設延長，請注意時間的管制及自身的平安，不可自行逗留實驗室。7. 實驗完畢，請清理實驗室、倒垃圾、滅菌、關閉燈光及冷氣，離開實驗室前記得洗手。8. 任何意外事件應立即報告教師或實驗室管理人員，并應熟知相關之應變措施。專業(yè)資料整理WORD格式1專業(yè)資料整理WORD格式藥品1

3、. 使用任何藥品，請先看清楚標示說明、本卷須知，翻閱物質平安資料，查明是否對人體造成傷害，使用完畢請放回原位。2. 新配制的試劑請清楚注明內容物、濃度、本卷須知及配制日期，為防止污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內。3. 揮發(fā)性、腐蝕性、有毒溶劑如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、-巰基乙醇、甲醛、酚等要在排煙柜中戴手套量取配制，取用完應隨即蓋好蓋子，假設不小心打翻試劑，馬上處理。4. 有毒、致癌藥劑例如丙稀酰胺神經(jīng)毒 、溴化乙啶突變劑、SDS粉塵請戴手套及口罩取用，并勿到處污染，脫下手套后，養(yǎng)成洗手的好習慣。5. 使用后的實驗試劑和材料，應放在專用的收集桶內。固體培養(yǎng)基、瓊脂糖或有毒物品不得倒

4、入水槽或下水道中。6. 使用刻度吸管取物時，切勿用嘴吸取，請用自動吸管或吸耳球。儀器1. 使用儀器前先了解其性能、配備及正確操作方法，零件及附件嚴禁拆卸，勿私自調整，并注意插座電壓 110V 或 220V之類別。2. 使用離心機時，離心管要兩兩對稱、重量平衡，離心機未停下不得翻開蓋子。冷凍離心機于開機狀態(tài)時，務必蓋緊蓋子，以保持離心槽之低溫并防止結霜。3. 電源供應器有高電壓，切勿觸摸電極或電泳槽內溶液，手濕切勿開啟電源。專業(yè)資料整理WORD格式2專業(yè)資料整理WORD格式4. 使用微波爐加熱，不可有鋁箔等金屬物品，瓶蓋必須松開，以免爆炸。加熱后戴防熱手套取出瓶子，務必輕搖晃，確認不會突沸。水浴

5、鍋、枯燥器等，使用前熟悉操作手續(xù)，嚴防燙傷。5. 操作臺上有酒精等有機溶劑及易燃物如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等要遠離火苗，不可留置火焰燃燒，萬一著火，應力持鎮(zhèn)定，沉著處理。酒精或乙醚等著火時，應使用泡沫滅火劑或濕毛巾覆蓋，勿使用水沖潑。6. 實驗完畢后需清理實驗臺，除需收回共用物品外，不留任何器皿。傾倒的試劑、水漬應擦干凈，保證實驗臺和實驗前同樣清潔。7. 值日組協(xié)助實驗室管理人員收回共用物品，清潔儀器，清理實驗臺，清掃實驗室。專業(yè)資料整理WORD格式3專業(yè)資料整理WORD格式第一局部根底實驗實驗 1 顯微技術概述實驗目的：使學生了解根本的細胞生物學實驗操作，熟悉常規(guī)和常用的實驗方法。 鍛煉學生

6、動手能力， 增強學生根本科研技能和科研思路；了解目前常用細胞生物學研究方法。任務：細胞生物學作為高校生命科學的主干課程之一，從本質上講是一門實驗科學，因此設置實驗課程十分重要，學生可以通過這一教學環(huán)節(jié)掌握細胞生物學的根本研究手段和方法， 并更深入理解理論課的各方面內容。進一步講，細胞是生物構成的根本單位， 是理解一切生命現(xiàn)象的根底，許多細胞生物學實驗方法也用于遺傳學， 分子生物學， 生物化學等科學實驗研究， 在將來的各項工作中將會有廣泛的實際用途。培養(yǎng)目標：使學生掌握細胞生物學實驗技術，提高學生分析問題和解決問題的能力，為了今后獨立進展科研工作打下堅實的根底。實驗 2 細胞膜的滲透性一、實驗目

7、的了解細胞膜的滲透性質及各種物質跨膜進入細胞的不同速度二、實驗原理將紅細胞放入數(shù)種等滲溶液中，由于紅細胞對各種溶質的滲透性不同，有的溶質可以滲入，有的溶質那么不能滲入； 滲入的溶質能夠提高紅細胞膜的滲透壓，專業(yè)資料整理WORD格式4專業(yè)資料整理WORD格式所以水分進入細胞引起溶血。 由于溶質滲入速度不同， 因此溶血的時間也不一樣。三、實驗器材與試劑器材：50ml 小燒杯， 10ml 移液管，試管 110ml，試管架。試劑：0.17mol/L 氯化鈉， 0.17mol/L 氯化銨， 0.17mol/L 醋酸胺， 0.17mol/L 硝酸鈉， 0.12mol/L 草酸銨， 0.12mol/L 硫酸

8、鈉， 0.32mol/L 葡萄糖， 0.32mol/L 甘油，0.32mol/L 乙醇， 0.32mol/L 丙酮。實驗材料 ：動物血液如羊血四、實驗步驟1、羊血細胞懸浮液取 50ml 小燒杯一只，加一份羊血和 10 份 0.17mol/L 氯化鈉溶液，形成一種不透明的紅色溶液，即稀釋的羊血。2、低滲溶液取試管一只，參加 5ml 蒸餾水，再加 0.5ml 稀釋的羊血，注意觀察溶液顏色變化，由不透明的紅色逐漸澄清， 說明紅細胞發(fā)生破裂造成溶血， 全部紅細胞溶血后光線比較容易透過溶液。3、羊紅細胞滲透性（ 1取試管一支，參加 0.17mol/L 氯化鈉溶液 5ml，再參加 0.5ml 稀釋的羊血，

9、輕輕搖動，觀察顏色變化及溶血現(xiàn)象，說明原因。（ 2取試管一支，參加 0.17mol/L 氯化銨溶液 5ml，再參加 0.5ml 稀釋的羊血，輕輕搖動，觀察顏色變化及溶血現(xiàn)象，說明原因。（ 3另外 8 種等滲溶液進展同上實驗記錄實驗結果并簡單分析表 1 不同低滲溶液中紅細胞溶血現(xiàn)象專業(yè)資料整理WORD格式5專業(yè)資料整理WORD格式溶液種類溶血與否時間結果分析0.17mol/L 氯化鈉0.17mol/L 氯化銨0.17mol/L 醋酸胺0.17mol/L 硝酸鈉0.12mol/L 草酸銨0.12mol/L 硫酸鈉0.32mol/L 葡萄糖0.32mol/L 甘油0.32mol/L 乙醇0.32mo

10、l/L 丙酮五、本卷須知或實驗特別提示六、實驗報告1、結果與討論2、思考題實驗 3 細胞器線粒體的別離與觀察一、實驗目的用差速離心法別離動、植物細胞線粒體二、實驗原理線粒體是真核細胞特有的，司能量轉換的重要細胞器。細胞種的能源物質 糖、脂肪、局部氨基酸在此進展最終的氧化，并通過偶聯(lián)磷酸華生成ATP，供應細胞生理活動之需。對線粒體的構造和功能的研究通常是在離體線粒體上進展的。制備線粒體用組織勻漿在懸浮介質中進展差速離心的方法。在一給定的離心場中對于所使用的離心機，就是選用一定的轉速 ，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、專業(yè)資料整理WORD格式6專業(yè)資料整理WORD格式半徑和懸浮介質的粘度。在一均

11、勻懸浮介質中離心某一時間內，組織勻降中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同而停留在上下不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中最先沉降的是細胞核，其次是線粒體，其他更輕的細胞器和大分子可依次再別離。懸浮介質通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的構造和酶的活性，在pH7.2 的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于別離。整個操作過程應注意樣品保持4，防止酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B janus green B是對線粒體專一的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后

12、帶正電，由電性吸引而堆積在線粒體膜上。線粒體的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質中的染料被復原成無色。本實驗介紹大鼠動物肝臟和玉米植物線粒體的別離。三、實驗器材與試劑四、實驗步驟一、大鼠肝臟線粒體的別離實驗用品1、 材料：大鼠肝臟2、 試劑： 1生理鹽水 21詹納斯綠 B 染液，生理鹽水配制 3蔗糖 Tris 鹽酸緩沖液 pH7.4 0.25mol/L 蔗糖 0.01mol/L Tris- 鹽酸緩沖液pH7.4 0.1mol/L Tris10ml0.1mol/L 鹽酸8.4ml加重蒸水到100ml加蔗糖到 0.25mol/L 。蔗糖為密度梯度離心用D(+)

13、蔗糖0.34mol/L 蔗糖 0.01mol/L Tris- 鹽酸緩沖液pH7.4 配制如上，加蔗糖到0.34mol/L 。（ 4 固定液：甲醇冰醋酸 9： 1（ 5 Giemsa 染液： Giemsa 粉 0.5g，甘油 33ml。先往 Giemsa 粉中加少量甘油在研缽內，研磨至無顆粒， 再將剩余甘油倒入混勻，56 左右保溫2h，令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為Giemsa 原液，保存于棕色瓶中。用時吸出少量專業(yè)資料整理WORD格式7專業(yè)資料整理WORD格式用 1/15mol/L 磷酸緩沖液作10 20 倍稀釋。1/15mol/L 磷酸緩沖液 pH6.8 ：1/15mol/L KH 2P

14、O450ml1/15mol/L Na 2HPO450ml3、 器材高速離心機，解剖刀剪，小燒杯，冰浴盤，漏斗，尼龍織物，玻璃均漿器。實驗方法1制備大鼠肝細胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織1g，剪碎，用預冷到0 4°C 的 0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在 04°C 條件下， 按每克肝加9ml 冷的 0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿，蔗糖溶液分數(shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個別離過程不宜過長，以保持組分生理活性。2差速離心先將 9ml

15、 0.34mol/L 緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心的參加9ml 肝勻漿使其覆蓋在上層。用冷凍控溫高速離心機按照圖1 順序進展差速離心。鼠肝勻漿700 g，離心 10min沉淀上清洗滌可省略10ml 預冷的 0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液， 2 次，每次 1000 g，合并離心 15min。沉淀I上清細胞核及質膜碎片10000 g，離心 10min沉淀洗滌可省略加 10ml 預冷的 0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液，1000 g，15min。沉淀 II線粒體專業(yè)資料整理WORD格式8專業(yè)資料整理WORD格式圖 1 差速離心順序圖3別離物鑒定（ 1 細胞核：取細胞核沉淀一滴涂片，在甲醇

16、冰醋酸溶液中固定 15min ，充分吹干，滴 Giemsa 染液原液 10 20 倍稀釋染色 10 分鐘。自來水沖洗，吹干，鏡檢。觀察結果。（ 2 線粒體：取線粒體沉淀涂片，注意勿太濃密，不待干即滴加 1詹納斯綠 B 染液染色 20min ，蓋上蓋玻片鏡檢。觀察結果。二、玉米線粒體的別離從植物細胞中別離線粒體， 除了做線粒體功能測定之外， 在植物細胞遺傳工程中， 常用于別離核外基因線粒體 DNA 等目的。別離線粒體的方法仍采用均勻介質中的差速離心法。介質中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L 甘露醇代替。 EDTA 螯合二價陽離子， Ca2+除去后細胞間粘著解體， 促使組織分散成單個

17、細胞。 牛血清白蛋白 BSA 能包在細胞外面， 并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。實驗用品1、材料玉米黃化幼苗水稻、高梁等幼苗均可2、試劑（ 1別離介質： 0.25mol/L 蔗糖， 50mmol/L Tris- 鹽酸緩沖液pH7.4，3mmol/LEDTA ， 0.75mg/ml BSA。50mmol/L 的 Tris- 鹽酸緩沖液pH7.4 配法：50ml 0.1mol/L 三羥甲基氨基甲烷 Tris溶液與 42ml 0.1mol/L 鹽酸混勻后，加水稀釋至 100ml 。（ 2保存液： 0.3mol/L 甘露醇 pH7.4 （ 3 20次氯酸鈉 NaClO 溶液（ 4 1詹納斯綠 B 染

18、液，生理鹽水配制。3、器材溫箱，冰箱，紗布，瓷研缽，冷凍控溫高速離心機實驗方法1、 玉米種子用20次氯酸鈉溶液浸泡10min 消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內，保持溫度，置溫箱28 于暗處培育2 3d。待芽長到12cm 長時剪下約5g，放 0 41h。2、 加 3 倍體積別離介質，在瓷研缽內快速研磨成勻漿。3、 用多層紗布過濾，濾液經(jīng)700 g 離心 10min 。除去核和雜質沉淀。4、 取上清液10000 g 離心 10min ，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。5、 沉淀為線粒體，可存于0.3mol/L 甘露醇中。注意以上勻漿及離心均控制在04 進展

19、。6、 取線粒體沉淀涂片在清潔載玻片上，不待干即滴加1詹納斯綠B 染色 20min ，鏡下觀察，線粒體為藍綠色圓形顆粒。專業(yè)資料整理WORD格式9專業(yè)資料整理WORD格式五、本卷須知或實驗特別提示六、實驗報告1結果與討論2思考題實驗 4 RNA 的細胞化學 Brachet 反響一、實驗目的了解 Brachet 反響原理，掌握有關的操作方法。二、實驗原理甲基綠派* methyl green-pyronin 為堿性染料，它分別能與細胞內的DNA 、 RNA 結合呈現(xiàn)不同顏色。當甲基綠與派*作為混合染料時，甲基綠與染色質中DNA 選擇性結合顯示綠色或藍色；派*與核仁、細胞質中的RNA 選擇性結合顯示

20、紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA 結合呈現(xiàn)綠色。而派*那么與聚合程度較低的RNA 結合呈現(xiàn)紅色但解聚的 DNA 也能和派*結合呈現(xiàn)紅色。即 RNA 對派*親和力大，被染成紅色，而 DNA 對甲基綠親和力大，被染成綠色。三、實驗器材與試劑（ 1 儀器、用具：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙。（ 2 材料：洋蔥鱗莖內表皮。（ 3 試劑：1 Unna 試劑：甲基綠派*染色液甲液： 5派*水溶液6ml2甲基綠水溶液6ml蒸餾水16ml乙液：1mol/L 乙酸緩沖液 pH4.8 16ml甲液與乙液分別置于

21、4 冰箱備用，使用時兩溶液混勻即可。2 1mol/L 乙酸緩沖液pH4.8 配方：A 液：冰醋酸6ml 加蒸餾水至100ml 。B 液：乙酸鈉13.5g 加蒸餾水至100ml 。取 A 液 40ml B 液 60ml 混勻即為 pH4.8 乙酸緩沖液。專業(yè)資料整理WORD格式10專業(yè)資料整理WORD格式四、實驗步驟（ 1 用鑷子撕取洋蔥鱗莖內表皮一小塊，置于載玻片上。（ 2 滴一滴 Unna 試劑，染色 30min 。（ 3 蒸餾水洗兩次，吸水紙吸去多余水分。（ 4 蓋上蓋玻片，鏡檢。五、本卷須知或實驗特別提示CK 對照：撕取洋蔥鱗莖內表皮， 經(jīng) 5三氯乙酸 90 水浴處理 15min 。再經(jīng)

22、 70乙醇洗片刻，然后按照步驟 1 4制片觀察。六、實驗報告1結果與討論2思考題實驗 5 DNA 的細胞化學 Feulgen 反響一、實驗目的了解 Feulgen 反響的原理，掌握有關的操作方法。二、實驗原理DNA 是由許多單核苷酸聚合成的多核甘酸，每個單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構成。DNA 經(jīng) 1mol/L 鹽酸水解， 其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的雙鍵翻開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff 試劑反響。 Schiff 試劑是堿性品紅和偏重亞硫酸鈉作用，形成無色的品紅液，當無色品紅與醛基結合那么形成紫紅色的化合物。因此但凡有 DNA 的地方，都能顯示紫紅色。紫

23、紅色的產生，是由于反響產物的分子內含有醌基，醌基是一個發(fā)色基團，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預先用熱的三氯醋酸或DNA 酶處理，得到的反響是陰性的，從而證明了Feulgen 反響的專一性。三、實驗器材與試劑（ 1 儀器、用具：顯微鏡，恒溫水浴箱、溫度計、解剖針、酒精燈、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙。（ 2 材料：洋蔥鱗莖。專業(yè)資料整理WORD格式11專業(yè)資料整理WORD格式3試劑：1 1mol/L 鹽酸的配制：取82.5ml 密度 1.19g/ml 的濃鹽酸加蒸餾水至1000ml 。2 Schiff 試劑的配制和保存：稱取0.5g 堿性品紅參加到100ml 煮沸的蒸餾水中用三角燒瓶，時

24、時振蕩， 繼續(xù)煮 5min勿使其沸騰 ，使之充分溶解。 然后冷卻至50時用濾紙過濾，濾液中就參加10ml 1mol/LHCl ，冷卻至 25時，參加 0.5g Na2S2O5偏重亞硫酸鈉 ，充分振蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處靜置至少24h有時需23d，使其顏色退至淡黃色，然后參加0.5g 活性炭，用力振蕩1min ，最后用粗濾紙過濾于棕色瓶中，封嚴瓶塞，外包黑紙。濾液應為無色無沉淀，貯于4冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可參加少許偏重亞硫酸鈉或鉀，使之再轉變?yōu)闊o色時，仍可使用。3 亞硫酸水：取200ml 自來水，參加10ml10 偏重亞硫酸鈉或鉀水溶液和10ml1mol/L

25、HCl ，三者于使用前混勻。四、實驗步驟1將洋蔥鱗莖內表皮放在1mol/L HCl中，加熱到60水解 8 10min 。（ 2 蒸餾水水洗。（ 3 Schiff 試劑遮光染色 30min 。4用新鮮配制的亞硫酸水溶液洗3 次，每次1min。（ 5 水洗 5min。（ 6 顯微鏡觀察。細胞中有 DNA 的部位應呈現(xiàn)紫紅色陽性反響。五、本卷須知或實驗特別提示CK 對照：另取同樣材料一份，不經(jīng)1mol/L HCl水解，直接在Schiff 試劑中染色，然后按照步驟4 6制片觀察。六、實驗報告1結果與討論2思考題實驗 6 考馬斯亮藍 R250 Coomassie blue R250 染色法觀察細胞骨架一

26、、實驗目的掌握動植物細胞內微絲的染色方法。專業(yè)資料整理WORD格式12專業(yè)資料整理WORD格式二、實驗原理真核細胞質中有錯綜復雜的纖維網(wǎng)，稱為細胞骨架cytoskeleton 。根據(jù)纖維的直徑分為微絲 microfilament, MF, 7nm 、微管 microtubule, MT, 25nm 、中間纖維 intermediatedfilament, IF, 10nm 。此外，還散布著一些比微絲還細的纖維36nm。目前觀察細胞骨架的主要手段有電鏡、間接免疫熒光技術、酶標、組織化學等。微絲是肌動蛋白構成的纖維，稱為F-actin 。單根微絲直徑約7nm，在光學顯微鏡下看不到。本實驗觀察到的是

27、由微絲平行排列組成的纖維束，在動物細胞里稱為“應力纖維 （ stress fiber 應力纖維在體外培養(yǎng)的貼壁細胞中尤為興旺。一般當細胞充分鋪展時，經(jīng)考馬斯亮藍 R250 染色，可看到沿細胞長軸伸展的粗大纖維束，即應力纖維。應力纖維上還周期性地分布著微絲結合蛋白，包括-輔肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、類肌鈣蛋白等。應力纖維的端部連接著質膜上的粘著斑， 與加強細胞對基質的附著、 鋪展及維持細胞特定形狀有關?？捡R斯亮藍R250 可以染各種蛋白，并非特異染色微絲，實驗中用1Triton X 100 抽提掉胞質中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地顯示微絲束。三、實驗器材與試劑四、實驗步驟一、考馬斯亮藍

28、R-250 染動物細胞微絲1、 儀器光學顯微鏡、溫箱、細胞培養(yǎng)設備2、 材料平皿，直徑30mm 小染缸，載波片，蓋玻片條剪掉一角以區(qū)別細胞正反面。體外培養(yǎng)的貼壁生長的HeLa 細胞3、 試劑細胞培養(yǎng)基 DMEM 、RPMI 1640 等，磷酸緩沖鹽溶液 PBS，pH7.4 ，0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液 pH7.3 ，M 緩沖液， 1 Triton X-100用 M 緩沖液配制，0.2%考馬斯亮藍 R250， 3.0%戊二醛用 0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液配制。4、 實驗步驟1細胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上，尚未致密時即可使用。取出蓋玻片，用PBS洗 3 次。（ 2用 1Triton X-10

29、0 處理 25 30min，室溫或 37 度均可。3立即用 M- 緩沖液輕輕洗細胞3 次。（ 4略晾干后，用 3.0%戊二醛固定細胞 515min 。（ 5 PBS 洗數(shù)次，濾紙吸干。（ 6用 0.2%考馬斯亮藍 R250 染色 1 小時， 然后用水小心沖洗， 蒸餾水沖洗， 空氣中略枯燥。（ 7普通光學顯微鏡下用 40×物鏡或油鏡觀察。專業(yè)資料整理WORD格式13專業(yè)資料整理WORD格式二、考馬斯亮藍R-250 染植物細胞微絲實驗步驟：1、 取洋蔥鱗莖表皮，大小約1cm2，放入盛有0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液6.8的小燒杯中。2、 吸去緩沖液，用1 Triton X-100 處理洋

30、蔥表皮20 30min 。3、 除去 Triton X-100 ，用 M- 緩沖液充分洗3 次，每次約10min 。4、 加 3.0%戊二醛用0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液配制，pH6.8 固定 0.51h。5、 用 PBS 洗 3 次，濾紙吸去殘液。6、 0.2%考馬斯亮藍R250 染色 30min 。7、 蒸餾水洗數(shù)遍。將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，光學顯微鏡下觀察。五、本卷須知或實驗特別提示六、實驗報告1結果與討論2思考題實驗 7 動物細胞傳代培養(yǎng)與觀察實驗一、實驗目的熟練掌握細胞的傳代培養(yǎng)法。二、實驗原理傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的根底。當細胞在培養(yǎng)

31、瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶， 細胞才能繼續(xù)生長。 這一過程就叫傳代。 傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需。 傳代要在嚴格的無菌條件下進展， 每一步都需要認真仔細的無菌操作。三、實驗器材與試劑1.材料：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細胞。2.藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640 或 DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25 胰蛋白酶。3. 儀器： C02培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺。四、實驗步驟1人進入無菌室之前用肥皂洗手，用75酒精擦拭消毒雙手。2倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置 37下預熱。專業(yè)資料整理W

32、ORD格式14專業(yè)資料整理WORD格式3超凈臺臺面應整潔，用0.1 新潔爾滅溶液擦凈。4翻開超凈臺的紫外燈照射臺面20 min 左右，關閉超凈臺的紫外燈，翻開抽風機清潔空氣，除去臭氧。5點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。6將培養(yǎng)用液瓶口用75酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2 3 mL Hanks 液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。8每個大培養(yǎng)瓶參加1 mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注

33、意勿使細胞提早脫落入消化液中。9參加少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復吹消除化好的細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7 10 mL大瓶， 35 mL小瓶 ) 制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋， 適度擰緊后再稍回轉，以利于CO2氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回 CO2培養(yǎng)箱。10對懸浮培養(yǎng)細胞，步驟7-9 不做。可將細胞懸液進展離心去除舊培養(yǎng)基上清，參加新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。五、本卷須知或實驗特別提示1傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細胞之間的穿插污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進展一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應嚴格分開。2

34、每天觀察細胞形態(tài)，掌握好細胞是否*的標準：*細胞的形態(tài)飽滿，折旋光性好，生長致密時即可傳代。3如發(fā)現(xiàn)細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復清洗，隨后培養(yǎng)基中參加較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等。六、實驗報告1、結果與討論2、思考題專業(yè)資料整理WORD格式15專業(yè)資料整理WORD格式第二局部綜合實驗實驗 8 MTT 法檢測化學藥物對體外培養(yǎng)細胞增殖及存活的影響一、實驗目的了解掌握MTA 法的根本原理及根本過程。二、實驗原理測試藥物對細胞增殖的影響，對細胞的殺傷作用，一般采用集落形成法，生長曲線法等。這些方法作用量大，費時對于處理大量樣品和受試對象，那么更為繁瑣。 1983 年，T.Mosmann結合微空培養(yǎng)方法，利用細胞對tetrazolium( 簡稱