常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

1、整理ppt第五章第五章 常用生物化學(xué)檢常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 電化學(xué)分析電化學(xué)分析第三節(jié)第三節(jié) 電泳技術(shù)電泳技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 層析技術(shù)層析技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 自動(dòng)生化分析自動(dòng)生化分析 技術(shù)技術(shù)整理ppt 光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能而建立起來(lái)的一類分析方法，射輻射能而建立起來(lái)的一類分析方法，因不同分子的原子和原子團(tuán)，其發(fā)射光因不同分子的原子和原子團(tuán)，其發(fā)射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質(zhì)在一譜和吸收光譜不同，而相同的物質(zhì)在一定條件下，其發(fā)射光譜和吸收光譜的強(qiáng)定條件下，其發(fā)射光譜和吸收光譜的強(qiáng)度與該物質(zhì)的

2、含量成正比關(guān)系。因此可度與該物質(zhì)的含量成正比關(guān)系。因此可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，此類技術(shù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，此類技術(shù)稱為光譜分析技術(shù)。稱為光譜分析技術(shù)。整理ppt 光譜分析技術(shù)是一種最常用的生化檢光譜分析技術(shù)是一種最常用的生化檢驗(yàn)技術(shù)，它主要包括：驗(yàn)技術(shù)，它主要包括： 吸收光譜分析：吸收光譜分析：可見、紫外、紅外分可見、紫外、紅外分光光度法和原子吸收分光光度法光光度法和原子吸收分光光度法 散射光譜分析：散射光譜分析：散射比濁法和透射比散射比濁法和透射比濁法濁法 發(fā)射光譜分析：發(fā)射光譜分析：火焰光度法、原子發(fā)火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法射光譜法和熒光光譜法 整理ppt 光是一種

3、高速傳播的電磁波，光的波長(zhǎng)光是一種高速傳播的電磁波，光的波長(zhǎng)（）的常用單位是納米（）的常用單位是納米（nm），可見光波長(zhǎng)），可見光波長(zhǎng)400760nm，400nm稱為紫外光，稱為紫外光，760nm稱為紅外光，波長(zhǎng)愈短，能量愈大。稱為紅外光，波長(zhǎng)愈短，能量愈大。 可見、紫外吸收光譜是由于多原子分子的可見、紫外吸收光譜是由于多原子分子的價(jià)電子在電磁輻射的作用下，由基態(tài)躍遷到激價(jià)電子在電磁輻射的作用下，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，這種因物質(zhì)分子對(duì)輻射能的選擇性吸收發(fā)態(tài)，這種因物質(zhì)分子對(duì)輻射能的選擇性吸收而得到的光譜稱為而得到的光譜稱為吸收光譜吸收光譜。第一節(jié)第一節(jié) 吸收光譜分析吸收光譜分析整理ppt 吸收光

4、譜分析法包括可見、紫外、紅吸收光譜分析法包括可見、紫外、紅外和原子吸收分析法。其中最常用的是可外和原子吸收分析法。其中最常用的是可見光分析法，也被不嚴(yán)格地稱為比色分析見光分析法，也被不嚴(yán)格地稱為比色分析法，準(zhǔn)確的名稱應(yīng)是可見光分光光度法。法，準(zhǔn)確的名稱應(yīng)是可見光分光光度法。 用于比色分析的光源與被測(cè)溶液的顏用于比色分析的光源與被測(cè)溶液的顏色應(yīng)為互補(bǔ)色。色應(yīng)為互補(bǔ)色。整理ppt 可見、紫外吸收光譜用于定量分析的依可見、紫外吸收光譜用于定量分析的依據(jù)是據(jù)是光吸收定律光吸收定律，即，即Lambert-Beer定律定律，它，它是吸收光譜法的基本定律。是吸收光譜法的基本定律。整理ppt 一、一、Lamb

5、ert-Beer定律定律 1. Lambert定律定律 當(dāng)一束強(qiáng)度為當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色光的單色光透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，則透過的光線為則透過的光線為It。當(dāng)。當(dāng)溶液濃度不變?nèi)芤簼舛炔蛔儠r(shí)，透過的時(shí)，透過的液層愈厚，則光線強(qiáng)度的減弱愈顯著。液層愈厚，則光線強(qiáng)度的減弱愈顯著。ItI0整理ppt 用數(shù)學(xué)式表示為：用數(shù)學(xué)式表示為： 透光度隨溶液厚度增加而減少，其關(guān)系透光度隨溶液厚度增加而減少，其關(guān)系是是透光度的負(fù)對(duì)數(shù)（透光度的負(fù)對(duì)數(shù)（lgT，吸光度，吸光度A）與溶）與溶液厚度成正比液厚度成正比，即，即0tIIT透光度透光度LKIIII

6、TAt00t lglglg整理ppt 2. Beer定律定律 當(dāng)一束強(qiáng)度為當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色的單色光透過某種吸光溶液后，若光透過某種吸光溶液后，若液層厚度不變液層厚度不變，而濃度不同時(shí)，溶液的濃度愈大，則透過而濃度不同時(shí)，溶液的濃度愈大，則透過光的強(qiáng)度愈弱，其定量關(guān)系光的強(qiáng)度愈弱，其定量關(guān)系A(chǔ)=KC。 當(dāng)液層厚度不變時(shí)，吸光度與溶液濃當(dāng)液層厚度不變時(shí)，吸光度與溶液濃度成正比，這就是度成正比，這就是Beer定律。定律。整理ppt 3. Lambert-Beer定律定律 合并合并Lambert定律與定律與Beer定律可得定律可得 A=KLC 說(shuō)明吸光物質(zhì)對(duì)單色光吸收的強(qiáng)度與物質(zhì)的說(shuō)明吸光物質(zhì)對(duì)

7、單色光吸收的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。濃度和液層厚度成正比。 吸光系數(shù)吸光系數(shù)K的物理意義是的物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度度及單位厚度時(shí)的吸光度，在給定條件下（波長(zhǎng)、，在給定條件下（波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)、濃度）吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，溶液性質(zhì)、濃度）吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，K值愈大，能測(cè)定的濃度值愈大，能測(cè)定的濃度C愈小，則靈敏度愈高。愈小，則靈敏度愈高。整理ppt 二、比色分析儀器二、比色分析儀器 即可見光分光光度計(jì)，各類分光光度計(jì)即可見光分光光度計(jì)，各類分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和原理基本相同，一般包括光源、單色的結(jié)構(gòu)和原理基本相同，一般包括光源、單色器、吸

8、收池、檢測(cè)器和顯色器五大部分。器、吸收池、檢測(cè)器和顯色器五大部分。 1. 光源光源 可見光常用鎢燈，現(xiàn)用鹵鎢燈；可見光常用鎢燈，現(xiàn)用鹵鎢燈；紫外光常用氫燈。紫外光常用氫燈。 2. 單色器單色器 可用濾光片、棱鏡、光柵?？捎脼V光片、棱鏡、光柵。 3. 吸收池吸收池 (比色杯比色杯) 4. 檢測(cè)器檢測(cè)器 光電管或光電倍增管光電管或光電倍增管 5. 顯示器顯示器 指針式或數(shù)字式指針式或數(shù)字式整理ppt 三、比色分析的特點(diǎn)三、比色分析的特點(diǎn) 1. 靈敏度高靈敏度高 被測(cè)定物質(zhì)的最低濃度被測(cè)定物質(zhì)的最低濃度一般為一般為105106mol/L。 2. 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便。測(cè)定快速、簡(jiǎn)便。 3. 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用

9、范圍廣 一些無(wú)色物質(zhì)在一定一些無(wú)色物質(zhì)在一定條件下與顯色劑反應(yīng)，可生成有色物質(zhì)。條件下與顯色劑反應(yīng)，可生成有色物質(zhì)。整理ppt四、比色分析的定量方法四、比色分析的定量方法 （一）對(duì)比法（一）對(duì)比法 又稱標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法，通常在測(cè)定未知濃又稱標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法，通常在測(cè)定未知濃度樣品的同時(shí)，測(cè)定一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液度樣品的同時(shí)，測(cè)定一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液作比較，然后分別測(cè)定兩者的吸光度。作比較，然后分別測(cè)定兩者的吸光度。 AS=KLSCS AR=KLRCR整理ppt 因測(cè)定成分相同，故因測(cè)定成分相同，故K值相同，比色時(shí)用值相同，比色時(shí)用同樣規(guī)格的比色皿故同樣規(guī)格的比色皿故LS=LR，所以比色分析中，所以比色分析中測(cè)

10、定標(biāo)準(zhǔn)液與未知液吸光度的比值也就等于其測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液與未知液吸光度的比值也就等于其濃度的比值，即濃度的比值，即若標(biāo)準(zhǔn)液與樣品用量不等時(shí)，則再乘若標(biāo)準(zhǔn)液與樣品用量不等時(shí)，則再乘 。 用對(duì)比法進(jìn)行定量時(shí)，為了減少誤差，選用對(duì)比法進(jìn)行定量時(shí)，為了減少誤差，選用標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)盡可能接近待測(cè)樣品濃度。用標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)盡可能接近待測(cè)樣品濃度。RSRSCCAA SSRRCAAC RSVV整理ppt （二）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)液，按一配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)液，按一定操作方法顯色后，用選定的波長(zhǎng)分別測(cè)定操作方法顯色后，用選定的波長(zhǎng)分別測(cè)定它們的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，定它們的吸光

11、度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上標(biāo)出各標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上標(biāo)出各坐標(biāo)點(diǎn)，通過連接各點(diǎn)，使其成一直線，坐標(biāo)點(diǎn)，通過連接各點(diǎn)，使其成一直線，即即A-C曲線。曲線。整理pptA0.60.50.40.30.20.1 2 4 6 8 10 12 C整理ppt 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1. 測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。和試劑等），應(yīng)重新繪制。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。應(yīng)準(zhǔn)確。 3. 當(dāng)待測(cè)液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)待測(cè)液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。

12、將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。 4. 標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。的條件完全一致。整理ppt 用波長(zhǎng)用波長(zhǎng)200400nm的紫外光譜測(cè)定無(wú)的紫外光譜測(cè)定無(wú)色物質(zhì)的方法稱為紫外分光光度法色物質(zhì)的方法稱為紫外分光光度法。芳香族。芳香族類及含有共軛雙鍵的烯烴、炔烴等不飽和烴類及含有共軛雙鍵的烯烴、炔烴等不飽和烴類，在類，在200400nm波長(zhǎng)范圍具備光吸收特性，波長(zhǎng)范圍具備光吸收特性，故不需經(jīng)顯色反應(yīng)就能直接利用紫外分光光故不需經(jīng)顯色反應(yīng)就能直接利用紫外分光光度法測(cè)定，其選擇性和靈敏度均高于比色分度法測(cè)定，其選擇性和靈敏度均高于比色分析法。析法。整理ppt

13、（一）單組分測(cè)定原理（一）單組分測(cè)定原理 其基本原理與可見分光光度法相同，除可其基本原理與可見分光光度法相同，除可采用前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和對(duì)比法外，還可采用：采用前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和對(duì)比法外，還可采用： 1. 吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法 對(duì)于對(duì)于單一組分的純物質(zhì)單一組分的純物質(zhì)，只要已知其摩爾吸光系數(shù)，測(cè)得吸光度（只要已知其摩爾吸光系數(shù)，測(cè)得吸光度（A）后，可直接按下列公式計(jì)算物質(zhì)的濃度。后，可直接按下列公式計(jì)算物質(zhì)的濃度。被測(cè)物體積被測(cè)物體積反應(yīng)體系總體積反應(yīng)體系總體積 LAC 整理ppt 例：例：已知維生素已知維生素B12的水溶液在的水溶液在361nm波波長(zhǎng)處的長(zhǎng)處的為為28056，2ml維生素維生

14、素B12的水溶液用蒸的水溶液用蒸餾水稀釋到餾水稀釋到4ml，用，用1cm比色杯測(cè)得溶液的吸比色杯測(cè)得溶液的吸光度為光度為0.414，求該維生素，求該維生素B12水溶液的濃度。水溶液的濃度。Lmol10952241280564140LAC5/. 被測(cè)物體積被測(cè)物體積反應(yīng)體系總體積反應(yīng)體系總體積 整理ppt （二）多組分混合物的測(cè)定原理（二）多組分混合物的測(cè)定原理 多組分指同一試樣中含兩種或兩種以多組分指同一試樣中含兩種或兩種以上待測(cè)組分，測(cè)定時(shí)可根據(jù)各組分吸收光上待測(cè)組分，測(cè)定時(shí)可根據(jù)各組分吸收光譜的重疊程度來(lái)確定定量方法。譜的重疊程度來(lái)確定定量方法。 1. 各組分吸收峰不相互重疊各組分吸收峰不

15、相互重疊 按單組分測(cè)定方法按單組分測(cè)定方法 2. 各組分吸收峰相互重疊各組分吸收峰相互重疊 可采用解聯(lián)立方程法，等收吸雙波長(zhǎng)可采用解聯(lián)立方程法，等收吸雙波長(zhǎng)法、系數(shù)光譜法。法、系數(shù)光譜法。整理ppt （一）火焰光度法（一）火焰光度法 是利用火焰使金屬元素激發(fā)，能發(fā)射出是利用火焰使金屬元素激發(fā)，能發(fā)射出特征譜線的特點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定的一種方法。特征譜線的特點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定的一種方法。 1.基本原理基本原理 某些金屬元素的基態(tài)原子某些金屬元素的基態(tài)原子受到火焰激發(fā)后，其外層電子獲得能量而從受到火焰激發(fā)后，其外層電子獲得能量而從基點(diǎn)躍遷到激發(fā)態(tài)，接著它們又以發(fā)射光譜基點(diǎn)躍遷到激發(fā)態(tài)，接著它們又以發(fā)射光譜的形式釋放

16、出所獲得的能量，而返回基態(tài)，的形式釋放出所獲得的能量，而返回基態(tài)，在相同條件下，同一元素所釋放的單位能量在相同條件下，同一元素所釋放的單位能量相同，故能形成固定光譜。相同，故能形成固定光譜。整理ppt 如如鈉鈉發(fā)射光譜波長(zhǎng)發(fā)射光譜波長(zhǎng)589nm，鉀鉀發(fā)射光譜波發(fā)射光譜波長(zhǎng)長(zhǎng)767nm。 由于火焰供給的能量不強(qiáng)，由于火焰供給的能量不強(qiáng)，只能激發(fā)只能激發(fā)堿堿金屬金屬和和堿土金屬堿土金屬元素元素，生化檢驗(yàn)中常用于鉀、，生化檢驗(yàn)中常用于鉀、鈉的測(cè)定。鈉的測(cè)定。 元素的發(fā)射譜線強(qiáng)度與該元素濃度的關(guān)元素的發(fā)射譜線強(qiáng)度與該元素濃度的關(guān)系可表示為系可表示為I=acb a是與試樣組成，激發(fā)溫度，激發(fā)電位有是與試

17、樣組成，激發(fā)溫度，激發(fā)電位有關(guān)的關(guān)的常數(shù)常數(shù)，b為為自吸收系數(shù)自吸收系數(shù)，當(dāng)濃度很低時(shí)，當(dāng)濃度很低時(shí)，b1，所以上式可寫成，所以上式可寫成I=ac，即發(fā)射譜線強(qiáng)度，即發(fā)射譜線強(qiáng)度與測(cè)定元素濃度成正比。與測(cè)定元素濃度成正比。整理ppt 2.干擾因素干擾因素 （1）共存元素的干擾）共存元素的干擾 共存元素產(chǎn)生的輻射干擾共存元素產(chǎn)生的輻射干擾 由于火焰由于火焰使標(biāo)本中其他元素激發(fā)，當(dāng)發(fā)射時(shí)光譜接近，使標(biāo)本中其他元素激發(fā)，當(dāng)發(fā)射時(shí)光譜接近，甚至重疊時(shí)，可產(chǎn)生干擾，引起誤差，如鈣甚至重疊時(shí)，可產(chǎn)生干擾，引起誤差，如鈣對(duì)鋰、鈉的測(cè)定干擾明顯。對(duì)鋰、鈉的測(cè)定干擾明顯。 陽(yáng)離子的干擾陽(yáng)離子的干擾 主要是通過對(duì)

18、待測(cè)陽(yáng)主要是通過對(duì)待測(cè)陽(yáng)離子的電離度產(chǎn)生影響，造成發(fā)射時(shí)強(qiáng)度的離子的電離度產(chǎn)生影響，造成發(fā)射時(shí)強(qiáng)度的改變。改變。整理ppt 陰離子的干擾陰離子的干擾 因陰離子可與某些因陰離子可與某些被測(cè)陽(yáng)離子在火焰溫度下形成僅能緩慢蒸被測(cè)陽(yáng)離子在火焰溫度下形成僅能緩慢蒸發(fā)的化合物而抑制了原子激發(fā)，一般用釋發(fā)的化合物而抑制了原子激發(fā)，一般用釋放劑來(lái)消除干擾，與干擾陰離子牢固結(jié)合。放劑來(lái)消除干擾，與干擾陰離子牢固結(jié)合。 （2）火焰對(duì)測(cè)定的影響）火焰對(duì)測(cè)定的影響 火焰是激發(fā)光源，火焰的純度和燃燒火焰是激發(fā)光源，火焰的純度和燃燒狀態(tài)，穩(wěn)定性，可直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)狀態(tài)，穩(wěn)定性，可直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此，要求所

19、用燃料燃燒時(shí)火焰背確度，因此，要求所用燃料燃燒時(shí)火焰背景色淺，溫度高，無(wú)雜色。景色淺，溫度高，無(wú)雜色。整理ppt （3 3）標(biāo)準(zhǔn)品的影響標(biāo)準(zhǔn)品的影響 由于生物樣品中成分復(fù)雜，定量測(cè)由于生物樣品中成分復(fù)雜，定量測(cè)定中會(huì)互相干擾影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，所定中會(huì)互相干擾影響測(cè)定的準(zhǔn)確性，所以，如果以單純的被測(cè)物質(zhì)預(yù)制標(biāo)準(zhǔn)液以，如果以單純的被測(cè)物質(zhì)預(yù)制標(biāo)準(zhǔn)液則與血清樣品的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，故應(yīng)使則與血清樣品的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，故應(yīng)使用血清作為標(biāo)準(zhǔn)以消除影響。用血清作為標(biāo)準(zhǔn)以消除影響。整理ppt （二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 1. 基本原理基本原理 待測(cè)元素經(jīng)原子蒸氣發(fā)生待測(cè)元素經(jīng)原子蒸氣發(fā)生器轉(zhuǎn)

20、化成氣態(tài)原子（處于基態(tài)），由空心陰極器轉(zhuǎn)化成氣態(tài)原子（處于基態(tài)），由空心陰極燈提供的待測(cè)元素的共振線經(jīng)過待測(cè)元素的蒸燈提供的待測(cè)元素的共振線經(jīng)過待測(cè)元素的蒸氣，共振輻射強(qiáng)度被蒸氣中待測(cè)元素的基態(tài)原氣，共振輻射強(qiáng)度被蒸氣中待測(cè)元素的基態(tài)原子吸收而減弱，其吸收規(guī)律遵循子吸收而減弱，其吸收規(guī)律遵循Beer定律。定律。 共振線：共振線：電子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)電子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)所吸收的譜線為共振吸收線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)所吸收的譜線為共振吸收線。簡(jiǎn)稱為共振線。簡(jiǎn)稱為共振線。整理ppt 2. 應(yīng)用應(yīng)用 在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要用于體液、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要用于體液、毛發(fā)、指甲等組織鈣、鎂、

21、鐵、鈉、鋅、鋁、毛發(fā)、指甲等組織鈣、鎂、鐵、鈉、鋅、鋁、汞、鉛、砷等多種元素的測(cè)定。汞、鉛、砷等多種元素的測(cè)定。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 選擇性好選擇性好 受干擾少，原子吸收是光的受干擾少，原子吸收是光的窄帶吸收，僅窄帶吸收，僅0.0010.01nm，而分子對(duì)光的吸，而分子對(duì)光的吸收是寬帶吸收，達(dá)幾個(gè)收是寬帶吸收，達(dá)幾個(gè)nm。 靈敏度高靈敏度高 能測(cè)定能測(cè)定109106g的元素。的元素。 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便測(cè)定快速、簡(jiǎn)便 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣 只需更換不同空心陰極燈，只需更換不同空心陰極燈，儀器昂貴。儀器昂貴。整理ppt （三）熒光分析法（三）熒光分析法 利用某些物質(zhì)光致發(fā)光的特性，籍此對(duì)物利用某些物質(zhì)光致

22、發(fā)光的特性，籍此對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性，定量分析的方法。質(zhì)進(jìn)行定性，定量分析的方法。 1.基本原理基本原理 某些物質(zhì)的分子吸收了光某些物質(zhì)的分子吸收了光能，從基態(tài)躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中的某一振能，從基態(tài)躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中的某一振動(dòng)能級(jí)，處于激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)中的分子通過動(dòng)能級(jí)，處于激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)中的分子通過運(yùn)動(dòng)或與其他分子的碰撞而將吸收過多的能量運(yùn)動(dòng)或與其他分子的碰撞而將吸收過多的能量輸給其他分子，并返回到第一激發(fā)態(tài)的最低振輸給其他分子，并返回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射熒光，躍遷到基態(tài)發(fā)射熒光，動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射熒光，躍遷到基態(tài)發(fā)射熒光，在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與溶液濃度呈在一定濃度范

23、圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與溶液濃度呈線性關(guān)系。線性關(guān)系。整理ppt 2.影響熒光強(qiáng)度的因素影響熒光強(qiáng)度的因素 （1）溶劑）溶劑 增大溶劑的極性，可時(shí)電子增大溶劑的極性，可時(shí)電子躍遷的能量降低，熒光增強(qiáng)。躍遷的能量降低，熒光增強(qiáng)。 （2）溫度、）溫度、pH T分子碰撞頻率分子碰撞頻率，因此熒光強(qiáng)度隨溫度升高而減弱。因此熒光強(qiáng)度隨溫度升高而減弱。pH可影可影響化合物電離或使熒光物質(zhì)水解，如苯胺響化合物電離或使熒光物質(zhì)水解，如苯胺在在pH712溶液中主要以分子形式存在，產(chǎn)溶液中主要以分子形式存在，產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而在生藍(lán)色熒光，而在pH13的溶液中以的溶液中以離子形式存在，不能產(chǎn)生熒光。離子形式存在，不能產(chǎn)生

24、熒光。整理ppt （3）激發(fā)光和發(fā)射光）激發(fā)光和發(fā)射光 在定量測(cè)定時(shí)，在定量測(cè)定時(shí)，一般應(yīng)選擇熒光物質(zhì)的一般應(yīng)選擇熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)最大激發(fā)波長(zhǎng)（ex）和和最大熒光波長(zhǎng)最大熒光波長(zhǎng)（em），但有些熒光物質(zhì)，但有些熒光物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，受激發(fā)光照射后易分解，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，受激發(fā)光照射后易分解，縮短樣品照射時(shí)間，改變激發(fā)光波長(zhǎng)?？s短樣品照射時(shí)間，改變激發(fā)光波長(zhǎng)。 （4）物質(zhì)濃度的影響）物質(zhì)濃度的影響 熒光分析品適合熒光分析品適合稀溶液，因稀溶液，因熒光物質(zhì)濃度高，分子間碰撞增熒光物質(zhì)濃度高，分子間碰撞增加，使熒光強(qiáng)度減弱，這種現(xiàn)象稱為自熄滅加，使熒光強(qiáng)度減弱，這種現(xiàn)象稱為自熄滅，自熄滅現(xiàn)象

25、隨濃度增加而增強(qiáng)。自熄滅現(xiàn)象隨濃度增加而增強(qiáng)。整理ppt 3. 儀器與測(cè)定方法儀器與測(cè)定方法 作為熒光分析的作為熒光分析的儀器有光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)儀器有光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì) 光電熒光計(jì)的結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)很相光電熒光計(jì)的結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)很相似，不同之處是檢測(cè)器與光線成直角，并似，不同之處是檢測(cè)器與光線成直角，并多一塊濾光片。多一塊濾光片。 如濾光片改為棱鏡或光珊作單色器，如濾光片改為棱鏡或光珊作單色器，就和可見紫外發(fā)光光度計(jì)相似而成熒光分就和可見紫外發(fā)光光度計(jì)相似而成熒光分光光度計(jì)。光光度計(jì)。整理ppt儀器的組成部件的比儀器的組成部件的比 光源光源 單色器單色器 測(cè)定池測(cè)定池 光敏

26、元件光敏元件 檢測(cè)器檢測(cè)器光電比色計(jì)光電比色計(jì) 鎢燈鎢燈 濾光片濾光片 玻璃玻璃 光電池光電池 檢流計(jì)檢流計(jì) (二面透光二面透光) 光電管光電管光電熒光計(jì)光電熒光計(jì) 鹵鎢燈鹵鎢燈 濾光片濾光片 玻璃玻璃 光電管光電管 檢流計(jì)檢流計(jì) (300700nm)兩塊兩塊 (四面透光四面透光) 檢流計(jì)檢流計(jì)可見紫外可見紫外 鎢燈鎢燈 光柵或棱鏡光柵或棱鏡分光光度計(jì)分光光度計(jì) (400760nm) 玻璃玻璃 光電管光電管 檢流計(jì)檢流計(jì) 氫燈氫燈 石英石英 光電倍增管光電倍增管 自動(dòng)記錄自動(dòng)記錄 (200400nm)熒光分光熒光分光 氙弧燈氙弧燈 光柵或棱鏡光柵或棱鏡 玻璃玻璃 光電倍增管光電倍增管 自動(dòng)記錄

27、自動(dòng)記錄光度計(jì)光度計(jì) (200700nm) 石英石英氙弧燈發(fā)射的強(qiáng)烈紫外線對(duì)人眼有害。氙弧燈發(fā)射的強(qiáng)烈紫外線對(duì)人眼有害。整理ppt 熒光分析優(yōu)點(diǎn)：熒光分析優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高靈敏度高 比可見紫外吸收光譜高比可見紫外吸收光譜高103104倍。倍。 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 通過選擇合適的激發(fā)光通過選擇合適的激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)可避開其它物質(zhì)干擾。波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)可避開其它物質(zhì)干擾。 操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好 樣品用量少樣品用量少整理ppt 不足之處：不足之處： 應(yīng)用范圍有一定局限性應(yīng)用范圍有一定局限性，因許多物，因許多物質(zhì)不能產(chǎn)生熒光。質(zhì)不能產(chǎn)生熒光。 對(duì)測(cè)定條件要求嚴(yán)格對(duì)測(cè)定條件要求

28、嚴(yán)格，如試劑、溶，如試劑、溶劑不應(yīng)含有熒光物質(zhì)。劑不應(yīng)含有熒光物質(zhì)。 儀器價(jià)格較貴儀器價(jià)格較貴 熒光分析法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中可用于測(cè)定熒光分析法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中可用于測(cè)定類固醇激素（腎上腺皮質(zhì)激素）及代謝產(chǎn)類固醇激素（腎上腺皮質(zhì)激素）及代謝產(chǎn)物，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（兒茶酚胺，物，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（兒茶酚胺，5-HT）某些維生素（某些維生素（VitA，B族）。族）。整理ppt 電化學(xué)分析是一種以溶液電化學(xué)性質(zhì)為電化學(xué)分析是一種以溶液電化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法?；A(chǔ)測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法。按測(cè)定量的按測(cè)定量的電化學(xué)參數(shù)的不同，可分為電化學(xué)參數(shù)的不同，可分為電位法電位法、電導(dǎo)法電導(dǎo)法、庫(kù)侖法、極譜法和庫(kù)

29、侖法、極譜法和伏安法伏安法等，下面主要介紹等，下面主要介紹電位法中的離子選擇電極法。電位法中的離子選擇電極法。 整理ppt 是一種電化學(xué)敏感器，它的是一種電化學(xué)敏感器，它的電勢(shì)與溶液電勢(shì)與溶液中給定離子的濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系中給定離子的濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，故可，故可以通過簡(jiǎn)單的電位測(cè)量，直接測(cè)以通過簡(jiǎn)單的電位測(cè)量，直接測(cè) 定溶液中離定溶液中離子活度。子活度。 離子濃度與離子活度的關(guān)系離子濃度與離子活度的關(guān)系 a=f.c 在稀在稀溶液中（溶液中（104mol/L以下）活度系數(shù)接近以下）活度系數(shù)接近1。（ion selective electode ISE）整理ppt ISE分析法的優(yōu)點(diǎn)：分析法

30、的優(yōu)點(diǎn)： 1. 是一種直接的非破壞性分析方法是一種直接的非破壞性分析方法，可，可反復(fù)進(jìn)行，不受樣品溶液顏色、渾濁等因素的反復(fù)進(jìn)行，不受樣品溶液顏色、渾濁等因素的干擾。干擾。 2. 分析速度快分析速度快，單次分析通常只，單次分析通常只12min 3. 測(cè)量范圍寬測(cè)量范圍寬，45個(gè)數(shù)量級(jí)個(gè)數(shù)量級(jí) 4. 操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便 5. 測(cè)量特定離子活度測(cè)量特定離子活度，對(duì)臨床醫(yī)學(xué)和基，對(duì)臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)更有實(shí)用意義礎(chǔ)醫(yī)學(xué)更有實(shí)用意義整理ppt ISE大都大都屬于膜電極屬于膜電極，膜中含有與待測(cè)，膜中含有與待測(cè)離子相同的離子。膜的內(nèi)表面與具有相同離離子相同的離子。膜的內(nèi)表面與具有相同離子的固定濃度溶液接觸，

31、其中插入一內(nèi)參比子的固定濃度溶液接觸，其中插入一內(nèi)參比電極，當(dāng)膜的外表面與待測(cè)離子溶液接觸時(shí)，電極，當(dāng)膜的外表面與待測(cè)離子溶液接觸時(shí)，引起膜電位的改變。由于電極膜材料、制備引起膜電位的改變。由于電極膜材料、制備方法不同，使電板的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏方法不同，使電板的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度也不同。度也不同。整理ppt 膜電位的產(chǎn)生：膜電位的產(chǎn)生：將電極插入待測(cè)離子溶將電極插入待測(cè)離子溶液中時(shí)，由于離子的交換和擴(kuò)散作用，改變液中時(shí)，由于離子的交換和擴(kuò)散作用，改變了兩相中原有的電荷分布，因而存在一定的了兩相中原有的電荷分布，因而存在一定的電位差，因?yàn)閮?nèi)充溶液中有關(guān)離子的濃度恒電位差，因?yàn)閮?nèi)充溶液中有

32、關(guān)離子的濃度恒定，內(nèi)參比電極的電位固定，所以定，內(nèi)參比電極的電位固定，所以ISE的電的電位（位（E）只隨離子活度不同而改變，其電位）只隨離子活度不同而改變，其電位可用可用Nernst方程式表示。方程式表示。 algnFRT303. 2EE0 整理ppt ISE的的E值不能直接測(cè)定，必須將值不能直接測(cè)定，必須將ISE與參比電極浸入被測(cè)溶液中組成原電池，然與參比電極浸入被測(cè)溶液中組成原電池，然后通過電動(dòng)勢(shì)來(lái)測(cè)定后通過電動(dòng)勢(shì)來(lái)測(cè)定E值。值。 參比電極：參比電極：是指在溫度、壓力恒定的條是指在溫度、壓力恒定的條件下，當(dāng)被測(cè)溶液離子濃度有所改變時(shí)，電件下，當(dāng)被測(cè)溶液離子濃度有所改變時(shí)，電極電位保持不變的

33、電極。極電位保持不變的電極。整理ppt離子選擇電極離子選擇電極晶體膜電極晶體膜電極均相膜電極均相膜電極非均相膜電極非均相膜電極剛性基質(zhì)電極剛性基質(zhì)電極流動(dòng)載體電極流動(dòng)載體電極非晶體膜電極非晶體膜電極基本電極基本電極氣敏電極氣敏電極敏化電極敏化電極酶電極酶電極整理ppt （一）晶體膜電極（一）晶體膜電極 其敏感膜為金屬微溶鹽，經(jīng)加壓成片，其敏感膜為金屬微溶鹽，經(jīng)加壓成片，制成單晶、多晶或混晶體電極敏感膜，如氟制成單晶、多晶或混晶體電極敏感膜，如氟電極，其敏感膜為電極，其敏感膜為L(zhǎng)aF3單晶片。單晶片。 （二）非晶體膜電極（二）非晶體膜電極 1. 剛性基質(zhì)電極剛性基質(zhì)電極 其其敏感膜為玻璃敏感膜為

34、玻璃，故，故稱為玻璃電極。成分一般為稱為玻璃電極。成分一般為Na2O-AI2O3-SiO2改變這三種成分的配合比例，分別制出改變這三種成分的配合比例，分別制出對(duì)對(duì)Li+、Na+、K+、Ag+的離子選擇電極。的離子選擇電極。整理ppt 2. 流動(dòng)載體電極流動(dòng)載體電極 其敏感膜是由溶解在與其敏感膜是由溶解在與水不相混溶的有機(jī)溶劑中的離子締合劑或混合水不相混溶的有機(jī)溶劑中的離子締合劑或混合劑作為離子交換體，再將此溶液滲透在具有惰劑作為離子交換體，再將此溶液滲透在具有惰性，微孔性和疏水性的塑料薄膜內(nèi)。性，微孔性和疏水性的塑料薄膜內(nèi)。 （三）氣敏電極（三）氣敏電極 是基于界面化學(xué)反應(yīng)對(duì)氣體敏感的電極，是

35、基于界面化學(xué)反應(yīng)對(duì)氣體敏感的電極，它是在一般的離子選擇電極的基礎(chǔ)上，再覆蓋它是在一般的離子選擇電極的基礎(chǔ)上，再覆蓋一層疏水的透氣膜（如聚四氟乙烯），如一層疏水的透氣膜（如聚四氟乙烯），如CO2、NH3電極。電極。整理ppt （四）酶電極（四）酶電極 它由離子敏感膜和覆蓋在表面含有酶的它由離子敏感膜和覆蓋在表面含有酶的酶涂層膠組成，敏感膜對(duì)待測(cè)物的酶促反應(yīng)酶涂層膠組成，敏感膜對(duì)待測(cè)物的酶促反應(yīng)有選擇性響應(yīng)，如尿素酶電極。有選擇性響應(yīng)，如尿素酶電極。整理ppt 1. 響應(yīng)范圍及檢測(cè)下限：響應(yīng)范圍及檢測(cè)下限：響應(yīng)范圍是響應(yīng)范圍是指電極對(duì)待測(cè)離子的響應(yīng)符合指電極對(duì)待測(cè)離子的響應(yīng)符合Nernst式的線式

36、的線性區(qū)，此范圍越寬越好，一般在性區(qū)，此范圍越寬越好，一般在47個(gè)數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)之間，檢測(cè)量級(jí)之間，檢測(cè)F限是指能夠檢測(cè)被檢離子限是指能夠檢測(cè)被檢離子的最低濃度一般在的最低濃度一般在10-510-7mol/L。 2. 選擇性選擇性 是指電極對(duì)待測(cè)離子和共是指電極對(duì)待測(cè)離子和共存干擾離子的響應(yīng)程度的差異。存干擾離子的響應(yīng)程度的差異。常用選擇常用選擇性系數(shù)或選擇比系描述，選擇性系數(shù)越小，性系數(shù)或選擇比系描述，選擇性系數(shù)越小，表示電極選擇性越強(qiáng)。表示電極選擇性越強(qiáng)。整理ppt 3. 響應(yīng)斜率和轉(zhuǎn)換系數(shù)響應(yīng)斜率和轉(zhuǎn)換系數(shù) ISE在在Nevnet響響應(yīng)范圍內(nèi)被測(cè)離子活度變化應(yīng)范圍內(nèi)被測(cè)離子活度變化10倍所引

37、起的電報(bào)倍所引起的電報(bào)電位變化的數(shù)值，即響應(yīng)斜率（電位變化的數(shù)值，即響應(yīng)斜率（S）。）。 從理論上說(shuō)，從理論上說(shuō)，但對(duì)某一但對(duì)某一ISE來(lái)說(shuō)，實(shí)際來(lái)說(shuō)，實(shí)際S值與理論值與理論S值并不完值并不完全相符，其偏差用轉(zhuǎn)換系數(shù)表示，一般轉(zhuǎn)換系全相符，其偏差用轉(zhuǎn)換系數(shù)表示，一般轉(zhuǎn)換系數(shù)達(dá)到理論值數(shù)達(dá)到理論值90以上的電極性能較好。以上的電極性能較好。 4. 電極壽命電極壽命 取決于電極制作材料，結(jié)構(gòu)取決于電極制作材料，結(jié)構(gòu)和使用保管情況。和使用保管情況。nFRT303. 2S 整理ppt 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列不同濃度配制一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其電位值標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其電位值Es，繪制

38、，繪制Es-lgc標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下測(cè)定樣品溶液電標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下測(cè)定樣品溶液電位值位值Ex。 2. 電極校正法電極校正法 用標(biāo)準(zhǔn)溶液校正用標(biāo)準(zhǔn)溶液校正ISE，制成直讀式電儀表。制成直讀式電儀表。整理ppt 1. 電動(dòng)勢(shì)測(cè)量電動(dòng)勢(shì)測(cè)量，對(duì)于，對(duì)于一價(jià)離子一價(jià)離子的響應(yīng)，的響應(yīng)，電勢(shì)測(cè)量每差電勢(shì)測(cè)量每差1mV引起濃度的相對(duì)誤差為引起濃度的相對(duì)誤差為4，對(duì)于，對(duì)于二價(jià)離子二價(jià)離子則為則為8，因此對(duì)于測(cè)量，因此對(duì)于測(cè)量電勢(shì)的儀器精度要求達(dá)到電勢(shì)的儀器精度要求達(dá)到0.1mV。 2. 溫度溫度 Nernst公試中的斜率，內(nèi)參比公試中的斜率，內(nèi)參比電極的電信號(hào)，以及離子活度等都與溫度有電極的電信

39、號(hào)，以及離子活度等都與溫度有關(guān)，因此在整個(gè)測(cè)量過程中應(yīng)保持溫度恒定。關(guān)，因此在整個(gè)測(cè)量過程中應(yīng)保持溫度恒定。整理ppt 3. pH 溶液溶液pH值可影響被測(cè)離子在溶值可影響被測(cè)離子在溶液中的存在形式，從而影響相應(yīng)離子的活度，液中的存在形式，從而影響相應(yīng)離子的活度，如如LaF3電極測(cè)定電極測(cè)定F 時(shí)，如時(shí)，如pH5 ， F則會(huì)則會(huì)生成生成HF，使結(jié)果偏低。，使結(jié)果偏低。 4. 滯后效應(yīng)滯后效應(yīng) 使用使用ISE若先測(cè)濃溶液后，若先測(cè)濃溶液后，再測(cè)稀溶液時(shí)電位平衡緩慢并出現(xiàn)誤差，這再測(cè)稀溶液時(shí)電位平衡緩慢并出現(xiàn)誤差，這一現(xiàn)象稱為一現(xiàn)象稱為“滯后效應(yīng)滯后效應(yīng)”。整理ppt 一、電泳的基本原理一、電泳的

40、基本原理 （一）（一） 電泳的概念電泳的概念 溶液中帶電顆粒在直流電場(chǎng)中向電荷相反溶液中帶電顆粒在直流電場(chǎng)中向電荷相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。利用電泳現(xiàn)象對(duì)物方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。利用電泳現(xiàn)象對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)叫電泳技術(shù)。質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)叫電泳技術(shù)。第三節(jié)第三節(jié) 電泳技術(shù)電泳技術(shù)整理ppt 電泳技術(shù)的應(yīng)用始于電泳技術(shù)的應(yīng)用始于1937年，瑞典年，瑞典Tiselius利用界面電泳將血清蛋白質(zhì)分離成五種成分。利用界面電泳將血清蛋白質(zhì)分離成五種成分。 1948年年Wieland發(fā)明紙電泳，使電泳技術(shù)大發(fā)明紙電泳，使電泳技術(shù)大為簡(jiǎn)化。此后，電泳技術(shù)發(fā)展迅速，特別是電為簡(jiǎn)化。此后，電泳技術(shù)發(fā)展迅速，

41、特別是電泳技術(shù)與層析法，免疫學(xué)方法的結(jié)合，使其分泳技術(shù)與層析法，免疫學(xué)方法的結(jié)合，使其分辨率達(dá)到辨率達(dá)到 mg/ml水平，成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的一種重水平，成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的一種重要分析技術(shù)。要分析技術(shù)。整理ppt （二）（二） 溶液中粒子的帶電狀態(tài)溶液中粒子的帶電狀態(tài) 蛋白質(zhì)分子電離時(shí)蛋白質(zhì)分子電離時(shí)有帶正電荷的氨基有帶正電荷的氨基，也，也有電離有電離帶負(fù)電荷的羧基帶負(fù)電荷的羧基，故蛋白質(zhì)是一種兩性，故蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。電解質(zhì)。 在酸性條件下，羧基電離受抑制，在酸性條件下，羧基電離受抑制，NH2 -NH3 + 帶帶正電正電 在堿性條件下，羧基電離增強(qiáng)，在堿性條件下，羧基電離增強(qiáng)，COOH COO

42、帶帶負(fù)電負(fù)電。整理ppt （三）（三） 電泳遷移率電泳遷移率 指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度作用下的指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度作用下的電泳速度電泳速度，通常用，通常用表示表示 =V/E V為粒子移動(dòng)速度（為粒子移動(dòng)速度（cm/s）E為電場(chǎng)強(qiáng)為電場(chǎng)強(qiáng)度（度（V/cm） 遷移率取決于帶電粒子的性質(zhì)（粒子遷移率取決于帶電粒子的性質(zhì)（粒子所帶電量所帶電量Q，粒子大小，粒子大小r形狀）介質(zhì)粘度形狀）介質(zhì)粘度，對(duì)于球狀分子，根據(jù)對(duì)于球狀分子，根據(jù)Stoke定律定律 V= QE/6r U=Q/6r整理ppt 在實(shí)際測(cè)定中，電泳速度在實(shí)際測(cè)定中，電泳速度V以單位時(shí)間以單位時(shí)間t（秒）（秒）內(nèi)移動(dòng)的距離內(nèi)移動(dòng)的距離d（

43、厘米）表示（厘米）表示 V=d/t（cm/s） 電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度E以單位長(zhǎng)度以單位長(zhǎng)度I（厘米）上所施加（厘米）上所施加的電勢(shì)差的電勢(shì)差V（伏特）表示（伏特）表示 E=V/I（V/cm） 故故u=V/E=（d/t）/（V/I） =dI/Vt（cm2 /v.s） 通過測(cè)量通過測(cè)量d,l,v,t便可計(jì)算出顆粒的遷移率。便可計(jì)算出顆粒的遷移率。整理ppt 由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因此在同一電場(chǎng)中的移動(dòng)距離不同，故能將其分此在同一電場(chǎng)中的移動(dòng)距離不同，故能將其分離，根據(jù)公式離，根據(jù)公式 d A=V.t/l A d B=V.t/l B A、B移動(dòng)距離差為移動(dòng)

44、距離差為 d=( d A d B)=（ d A d B）V.t/l 分離距離與電壓和電泳時(shí)間成正比，與支分離距離與電壓和電泳時(shí)間成正比，與支持物長(zhǎng)度成正比。持物長(zhǎng)度成正比。整理ppt 二、二、 電泳的分類和電泳儀電泳的分類和電泳儀 （一）（一） 電泳的分類電泳的分類 1. 根據(jù)被分離樣品的多少根據(jù)被分離樣品的多少 分析電泳，制分析電泳，制備電泳。備電泳。 2. 根據(jù)電泳電壓的高低根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳，高壓常壓電泳，高壓電泳。電泳。 3. 根據(jù)是否使用支持介質(zhì)根據(jù)是否使用支持介質(zhì) 自由電泳，區(qū)自由電泳，區(qū)帶電泳。帶電泳。 4. 根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一 連續(xù)電

45、連續(xù)電泳，不連續(xù)電泳。泳，不連續(xù)電泳。 整理ppt （二）電泳儀（二）電泳儀 由直流電源和電泳槽兩部分組成。由直流電源和電泳槽兩部分組成。 1、直流電源、直流電源 將交流電源經(jīng)整流，濾波將交流電源經(jīng)整流，濾波后獲得。分為后獲得。分為 （1）恒壓電源）恒壓電源 電泳過程中的電壓恒定不電泳過程中的電壓恒定不變。但電泳過程中的熱效應(yīng)，降低外周電路的變。但電泳過程中的熱效應(yīng)，降低外周電路的電阻，使電流慢慢增大。電阻，使電流慢慢增大。 （2）恒流電泳）恒流電泳 電泳過程中的電流恒定不電泳過程中的電流恒定不變。用這種電流的輸出電壓可隨外周阻力減少變。用這種電流的輸出電壓可隨外周阻力減少而減少，從而保持電流

46、恒定。而減少，從而保持電流恒定。 （3）恒功率電源）恒功率電源 電泳中輸出功率恒定不電泳中輸出功率恒定不變。主要用于等電聚焦電泳。變。主要用于等電聚焦電泳。 整理ppt 2.電泳槽電泳槽 盛裝緩沖液和進(jìn)行電泳分析的盛裝緩沖液和進(jìn)行電泳分析的場(chǎng)所，一般用塑料和有機(jī)玻璃制成，它包括電場(chǎng)所，一般用塑料和有機(jī)玻璃制成，它包括電極，緩沖液槽，電泳支架，透明蓋組成。電泳極，緩沖液槽，電泳支架，透明蓋組成。電泳槽的外形有水平式，垂直式，圓盤式等多種。槽的外形有水平式，垂直式，圓盤式等多種。 電極應(yīng)具有良好的導(dǎo)電性，抗腐蝕性和抗電極應(yīng)具有良好的導(dǎo)電性，抗腐蝕性和抗電解作用。以鉑金材料最為理想，最好貫穿整電解作

47、用。以鉑金材料最為理想，最好貫穿整個(gè)緩沖液槽。個(gè)緩沖液槽。整理ppt 三、影響電泳的因素三、影響電泳的因素 （一）緩沖液（一）緩沖液 維持電泳介質(zhì)維持電泳介質(zhì)pH恒定，并恒定，并起導(dǎo)電作用。起導(dǎo)電作用。 1.組成組成 由弱酸和弱酸鹽組成，常用的有由弱酸和弱酸鹽組成，常用的有磷酸鹽，硼酸鹽，巴比妥鹽和三羥甲基氨基甲磷酸鹽，硼酸鹽，巴比妥鹽和三羥甲基氨基甲烷（烷（Tris）等，其中巴比妥緩沖液用的最多，）等，其中巴比妥緩沖液用的最多，由巴比妥鈉和巴比妥組成。由巴比妥鈉和巴比妥組成。整理ppt 選擇緩沖液時(shí)應(yīng)考慮的因素：選擇緩沖液時(shí)應(yīng)考慮的因素： （1）化學(xué)性能穩(wěn)定，不易水解。）化學(xué)性能穩(wěn)定，不易水

48、解。 （2）緩沖液的）緩沖液的pH應(yīng)與弱酸的應(yīng)與弱酸的pK 值接近，有值接近，有較強(qiáng)緩沖能力。較強(qiáng)緩沖能力。 （3）緩沖液中正負(fù)離子應(yīng)有相近的遷移率，）緩沖液中正負(fù)離子應(yīng)有相近的遷移率，避免電暈出現(xiàn)正負(fù)離子分布不均。避免電暈出現(xiàn)正負(fù)離子分布不均。 （4）緩沖液的離子應(yīng)該是一價(jià)的，多價(jià)離子）緩沖液的離子應(yīng)該是一價(jià)的，多價(jià)離子有較厚的雙電層，移動(dòng)性差。有較厚的雙電層，移動(dòng)性差。 （5）緩沖液的電導(dǎo)率要低，）緩沖液的電導(dǎo)率要低， 避免通電時(shí)產(chǎn)生避免通電時(shí)產(chǎn)生較多的熱。較多的熱。整理ppt 2.pH 緩沖液緩沖液pH決定了蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，決定了蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，電泳時(shí)應(yīng)選擇一個(gè)合適電泳時(shí)應(yīng)選擇一個(gè)合

49、適pH，使各種蛋白質(zhì)在這一，使各種蛋白質(zhì)在這一pH時(shí)凈電荷差別最大以利于分離。血清蛋白醋酸時(shí)凈電荷差別最大以利于分離。血清蛋白醋酸纖維薄膜電暈常用纖維薄膜電暈常用pH8.6的巴比妥緩沖液。各種蛋的巴比妥緩沖液。各種蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。白質(zhì)均帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。 緩沖液緩沖液pH的計(jì)算的計(jì)算 pH=pKa +lg(鹽鹽/酸酸) 電泳過程水會(huì)發(fā)生電離。電泳過程水會(huì)發(fā)生電離。 正極：正極：2OH H2O 1/2O22e pH 負(fù)極：負(fù)極：2H2eH2 pH 故電泳故電泳24次后應(yīng)將緩沖液正極交換，減少次后應(yīng)將緩沖液正極交換，減少這種影響。這種影響。整理ppt 3.離子強(qiáng)度離子

50、強(qiáng)度 是指溶液中各種離子的摩爾濃是指溶液中各種離子的摩爾濃度（度（Ci）與其電荷數(shù)平方（）與其電荷數(shù)平方（Zi 2）乘積總和的）乘積總和的1/2。即即 I=1/2CiZi 2 I的單位是的單位是mol/L。 如如0.1mol/L NaCL I=0.1mol/L 0.2mol/LMgCL2 I=0.6mol/L 對(duì)于緩沖液對(duì)于緩沖液I計(jì)算，由于弱酸的電離度很低，計(jì)算，由于弱酸的電離度很低，一般只計(jì)算鹽的。一般只計(jì)算鹽的。整理ppt I愈大，緩沖能力越大，愈大，緩沖能力越大，pH越穩(wěn)定越穩(wěn)定，但緩，但緩沖液所載分電流增加，樣品所栽的電流減少，沖液所載分電流增加，樣品所栽的電流減少，電泳速度減慢，導(dǎo)

51、電能力增加，產(chǎn)熱增加。電泳速度減慢，導(dǎo)電能力增加，產(chǎn)熱增加。 I過小，緩沖能力小，過小，緩沖能力小，pH不穩(wěn)定不穩(wěn)定，緩沖液，緩沖液所載分電流減少，樣品所載分電流增加，緩沖所載分電流減少，樣品所載分電流增加，緩沖液粘度系數(shù)降低，電泳速度加快。但樣品在支液粘度系數(shù)降低，電泳速度加快。但樣品在支持物上擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率降低。持物上擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率降低。 兼顧兩方面的影響，兼顧兩方面的影響，一般在一般在0.050.1 mol/L。整理ppt （二）支持介質(zhì)（二）支持介質(zhì) 對(duì)支持介質(zhì)的基本要求是對(duì)支持介質(zhì)的基本要求是具有化學(xué)惰性，不與被分離的樣品或緩沖液起具有化學(xué)惰性，不與被分離的樣品或緩沖液起化學(xué)反應(yīng)

52、，并具有一定的堅(jiān)韌度。化學(xué)反應(yīng)，并具有一定的堅(jiān)韌度。 1.吸附吸附 使被分離樣品滯留，而降低電泳使被分離樣品滯留，而降低電泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。速度，造成拖尾而使分辨率降低。 2.電滲電滲 電泳過程中液體對(duì)固體支持物的電泳過程中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。 實(shí)際上是電泳材料表面的實(shí)際上是電泳材料表面的電荷引起水的定向移動(dòng)。電荷引起水的定向移動(dòng)。 當(dāng)電滲作用方向與電泳方向一致，電泳速當(dāng)電滲作用方向與電泳方向一致，電泳速度加快，順?biāo)兄?。度加快，順?biāo)兄邸?當(dāng)電滲作用方向與電泳方向相反，電泳速當(dāng)電滲作用方向與電泳方向相反，電泳速度減慢，逆水行舟。度減慢，逆水行舟

53、。 整理ppt 四、常用電泳技術(shù)四、常用電泳技術(shù) 區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的一種電泳區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的一種電泳技術(shù)，區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)常用的有濾紙，技術(shù)，區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)常用的有濾紙，醋酸纖維薄膜，凝膠等。醋酸纖維薄膜，凝膠等。 （一）（一） 濾紙電泳（濾紙電泳（PE） 是應(yīng)用最早的支持介質(zhì)。是應(yīng)用最早的支持介質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：材料價(jià)材料價(jià)廉易得，有一定機(jī)械強(qiáng)度。廉易得，有一定機(jī)械強(qiáng)度。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：電泳時(shí)間電泳時(shí)間長(zhǎng)，長(zhǎng)，810h，吸附作用大，造成拖尾而降低，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。了分辨率，目前已淘汰。 整理ppt （二）（二） 醋酸纖維薄膜電泳（醋酸纖維薄膜

54、電泳（CAE） 1957年年Kohn首先采用，醋酸纖維素是將首先采用，醋酸纖維素是將纖維素分子中葡萄糖單體上的羥基乙?；卫w維素分子中葡萄糖單體上的羥基乙?；纬衫w維素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶劑成纖維素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶劑溶解，涂成均勻薄膜。溶解，涂成均勻薄膜。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)蛋白質(zhì)吸附作用很小，分辨率高，對(duì)蛋白質(zhì)吸附作用很小，分辨率高，區(qū)帶清晰，不吸附燃料，區(qū)帶周圍燃料可完全區(qū)帶清晰，不吸附燃料，區(qū)帶周圍燃料可完全清掉，檢測(cè)靈敏度較高，樣品用量少清掉，檢測(cè)靈敏度較高，樣品用量少0.32l，電泳時(shí)間短電泳時(shí)間短20min1小時(shí)，可透明，便于用光小時(shí)，可透明，便于用光密度掃

55、描儀定量。密度掃描儀定量。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：有輕度電滲作用，吸水性較差，較有輕度電滲作用，吸水性較差，較脆。脆。整理ppt （三）瓊脂糖凝膠電泳（三）瓊脂糖凝膠電泳（AGE） 瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖。瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖。主要由半乳糖和主要由半乳糖和L-3，6-脫水半乳糖構(gòu)成。常用脫水半乳糖構(gòu)成。常用濃度濃度0.51.0% 。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：吸附作用，電滲作用很小，故分辨吸附作用，電滲作用很小，故分辨率重現(xiàn)性好，應(yīng)用廣，同工酶，脂蛋白，免疫率重現(xiàn)性好，應(yīng)用廣，同工酶，脂蛋白，免疫電泳，樣品用量少電泳，樣品用量少0.63.0l，電泳時(shí)間短，電泳時(shí)間短30min1h。透明度好，

56、電泳后可直接掃描定量，。透明度好，電泳后可直接掃描定量，也可烘干制成薄膜。也可烘干制成薄膜。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：電泳完畢后區(qū)帶易擴(kuò)散，可及時(shí)固電泳完畢后區(qū)帶易擴(kuò)散，可及時(shí)固定。點(diǎn)樣方法，挖孔法，濾紙插入法。定。點(diǎn)樣方法，挖孔法，濾紙插入法。整理ppt （四）（四） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 是一種人工合成的高分子材料，是一種人工合成的高分子材料，60年代新年代新用于電泳分析，能將血清蛋白分為用于電泳分析，能將血清蛋白分為20多種組成。多種組成。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1.具有分子篩作用，分離效果好。具有分子篩作用，分離效果好。 2.化學(xué)穩(wěn)定性高，是一種穩(wěn)定的親水膠體?；瘜W(xué)穩(wěn)定性高，

57、是一種穩(wěn)定的親水膠體。 3.幾乎沒有吸附和電滲作用。幾乎沒有吸附和電滲作用。 4.機(jī)械強(qiáng)度好，無(wú)色透明，可直接光密度掃機(jī)械強(qiáng)度好，無(wú)色透明，可直接光密度掃描。描。 5.可調(diào)節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離。可調(diào)節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離。 整理ppt 1. 聚合聚合 丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 （Acr）單體）單體 （Bis）交聯(lián)劑）交聯(lián)劑 化學(xué)摧化化學(xué)摧化 過硫酸銨過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）系統(tǒng)系統(tǒng) 加速劑加速劑TEMED促使引發(fā)劑過硫酸銨形成自由促使引發(fā)劑過硫酸銨形成自由基，自由基與基，自由基與Acr接能，使接能，使Acr

58、單體形成自由基而活單體形成自由基而活化，從而引發(fā)聚合，聚合速度與化，從而引發(fā)聚合，聚合速度與pH，單體濃度，溫，單體濃度，溫度有關(guān)。度有關(guān)。催化系統(tǒng)催化系統(tǒng)引發(fā)劑引發(fā)劑 加速劑加速劑整理ppt 光催化光催化 核黃素核黃素-TEMED系統(tǒng)，核黃系統(tǒng)，核黃素經(jīng)光照被還原成無(wú)色核黃素，在和痕量素經(jīng)光照被還原成無(wú)色核黃素，在和痕量氧的條件下，無(wú)色核黃素又被氧化成核黃氧的條件下，無(wú)色核黃素又被氧化成核黃素自由基，使素自由基，使Acr活化，從而引發(fā)聚合。活化，從而引發(fā)聚合。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：核黃素用量少（核黃素用量少（10mg/L），對(duì)），對(duì)樣品分析無(wú)影響，聚合時(shí)間可通過調(diào)節(jié)光樣品分析無(wú)影響，聚合時(shí)間可通過調(diào)

59、節(jié)光照時(shí)間，強(qiáng)度來(lái)控制。照時(shí)間，強(qiáng)度來(lái)控制。整理ppt 2.孔徑與機(jī)械強(qiáng)度孔徑與機(jī)械強(qiáng)度 凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定。凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定。凝膠總濃度凝膠總濃度T（g/dl）表示）表示100ml凝膠中凝膠中Acr和和Bis的總克數(shù)，的總克數(shù)，T值越大，孔徑越小。值越大，孔徑越小。 交聯(lián)度交聯(lián)度C（%）表示交聯(lián)劑）表示交聯(lián)劑Bis占凝膠占凝膠總濃度總濃度T的百分比的百分比，C值越大，孔徑越小。值越大，孔徑越小。 T值固定不變時(shí)，值固定不變時(shí)，C值在值在5%時(shí)，凝膠孔時(shí)，凝膠孔徑最小，大于或小于徑最小，大于或小于5%，孔徑都會(huì)增大。，孔徑都會(huì)增大。整理ppt 常用標(biāo)準(zhǔn)膠常用標(biāo)準(zhǔn)膠

60、T=7.5g/dl，孔徑約，孔徑約5nm。 凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度全要取凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度全要取決于決于T及及Acr與與Bis的比值。的比值。 通常要求通常要求 ： T為為2%5% Acr/ Bis=20 5%10% Acr/ Bis=40 15%20 % Acr/ Bis=125200整理ppt 3.分類分類 圓柱型圓柱型根據(jù)凝膠的形狀根據(jù)凝膠的形狀 水平式水平式 平板型平板型 垂直式垂直式根據(jù)凝膠系統(tǒng)和緩沖液組成根據(jù)凝膠系統(tǒng)和緩沖液組成 ： 連續(xù)（均相），操作方便。連續(xù)（均相），操作方便。 不連續(xù)（多相），分離效果好。不連續(xù)（多相），分離效果好。 整理ppt 4.分離原理分