引物探針設(shè)計(jì)培訓(xùn)資料

1、TaqmanTaqman法熒光PCR引物探針設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR TaqManPCR TaqMan法法TaqMan-水解型雜交探針v 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)v 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分開，發(fā)熒光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針TaqManTaqMan法工作原理法工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光TaqManTaqMan 法法 PCRPCR反應(yīng)的建立反應(yīng)的建立1、引物、探針的

2、設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，2030 bp, 5不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為58-60 2、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ，45 S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同總體原則總體原則 查閱參考文獻(xiàn)，以選取 待檢病原體的靶基因。目的基因序列大量查找，利用DNAstar等軟件完成目的DNA或者RNA比對(duì)，確定種內(nèi)高保守，種

3、間高特異的區(qū)域?yàn)樵O(shè)計(jì)引物探針的靶序列先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。 所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，而且還會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。 擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過(guò)400bp，理想的最好能在100-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。 保持GC含量在20和80之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號(hào)。 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能

4、有4個(gè)連續(xù)的G） 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。 探針設(shè)計(jì)原則探針設(shè)計(jì)原則 探針位置盡可能地靠近上游引物 探針長(zhǎng)度應(yīng)在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結(jié)合特異性 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu) Tm值在65-70，通常比引物TM值高5-10（至少要5），GC含量在40%70% 探針的5端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤因?yàn)?G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用。 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針。 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性

5、互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。 引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu) 典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。 Tm值在5565（因?yàn)?0核酸外切酶活性最高），GC含量在40%60% 引物之間的TM相差避免超過(guò)2 引物的3端避免使用堿基A，引物的3端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基 為避免基因組的擴(kuò)

6、增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。 Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp150bp 引物末端（最后5個(gè)核苷酸）不能有超過(guò)2個(gè)的G和C。 TaqManTaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)法優(yōu)缺點(diǎn)q 對(duì)目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定q 設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)q重復(fù)性比較好優(yōu) 點(diǎn)q 只適合一個(gè)特定的目標(biāo)q 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高q 不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)TMA檢測(cè)技術(shù)示意圖TMA擴(kuò)增反應(yīng)原理圖技術(shù)原理 同一溫度下，首先通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸（RNA）的一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（1001000個(gè)）RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)

7、錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況。 分子信標(biāo)探針結(jié)構(gòu)自由能控制在 35之間Non-T7引物 CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTTT7引物 TAATACGACTCACTATAGGGAGA acctatcctatttgtacatccattcaTMA 檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì) 領(lǐng)先的領(lǐng)先的 RNA 檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù) TMA 技術(shù)檢測(cè)病原體 RNA。一個(gè)病原體細(xì)胞內(nèi)含有多達(dá) 個(gè) RNA 拷貝，大大提高了檢測(cè)靈敏度。 先進(jìn)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)先進(jìn)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 核酸擴(kuò)增在一個(gè)溫度下進(jìn)行（42），不

8、需要熱循環(huán)。更高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性更高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性 TMA 技術(shù)的擴(kuò)增效率極高，1530分鐘即可將模板擴(kuò)增 倍，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于其他核酸檢測(cè)技術(shù) 。有效的解決了核酸檢測(cè)的污染問(wèn)題有效的解決了核酸檢測(cè)的污染問(wèn)題 污染是核酸檢測(cè)的最大問(wèn)題。TMA 技術(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA ，環(huán)境中自然降解，污染少，更進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。高效率的自動(dòng)化檢測(cè)高效率的自動(dòng)化檢測(cè) TMA技術(shù)采用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，儀器自動(dòng)化程度較高，解放了操作人員，并且能夠得到標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定的結(jié)果。 TMA VS REAL-TIME PCRn都采用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)nTMA與PCR檢測(cè)相比較靈敏度更高；特別是加入內(nèi)標(biāo)后，PCR檢測(cè)靈敏度下降很大nTMA檢測(cè)產(chǎn)生的放大終產(chǎn)物是RNA，而PCR產(chǎn)生的是DNA；RNA很容易自然降解，而DNA則較為穩(wěn)定，即TMA檢測(cè)在污染控制方面更為容易nTMA操作不需要復(fù)雜的熱循環(huán)儀，普通水溶即可；而PCR檢測(cè)需要熱循環(huán)儀nTMA放大效率高達(dá)1000拷貝/循環(huán)，而PCR僅為2拷貝/循環(huán) 免疫學(xué)診斷（抗原抗體檢測(cè)，Elisa）PCRRT-PCR（Real Time PCR）轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（TMA，NASBA，TMA）直接培養(yǎng)全球診斷技術(shù)發(fā)展的四個(gè)階段全球診斷技術(shù)發(fā)展的四個(gè)階段n靈敏度低導(dǎo)致漏檢誤檢等缺陷n檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)n由于成本低，在發(fā)展中國(guó)