流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件

1、總覽總覽l 流式細(xì)胞術(shù)基本知識(shí)l 流式細(xì)胞儀的組成l 數(shù)據(jù)采集與分析流式細(xì)胞技術(shù)是什么？流式細(xì)胞技術(shù)是什么？l流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的各項(xiàng)特性在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的各項(xiàng)特性特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析可檢測(cè)的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫可檢測(cè)的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞，微生物液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞，微生物Flow CytometryFlow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣

2、本0.4um40um流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo)l流式細(xì)胞術(shù)提供的信息：流式細(xì)胞術(shù)提供的信息： - 相對(duì)細(xì)胞大小相對(duì)細(xì)胞大小 - 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 - 染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=DNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量=染色體分析染色體分析 細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面/胞漿胞漿/核的特核的特異性抗原異性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)=細(xì)胞受體細(xì)胞受體=細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡在上

3、述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞儀組成流式細(xì)胞儀組成l液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細(xì)胞l光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生和收集光學(xué)信號(hào)l電子系統(tǒng)：光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，進(jìn)行信號(hào)處理Fluidics DiagramFluidics DiagramSheath FlowSample Flow液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)l激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:- 激光器- 透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測(cè)區(qū)域l收集光學(xué)系統(tǒng)包括:-濾光片，將產(chǎn)生的光信號(hào)引導(dǎo)到對(duì)應(yīng)的光學(xué)接收器光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)- -濾光片濾光片460 500 540460 500 540460 500

4、540LongpassShortpassBandpass電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)TimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)Reviewl懸浮狀態(tài)的細(xì)胞懸浮狀態(tài)的細(xì)胞l單個(gè)流過流動(dòng)室單個(gè)流過流動(dòng)室l細(xì)胞被激發(fā)細(xì)胞被激發(fā)l產(chǎn)生散射光和熒光產(chǎn)生散射光和熒光 信號(hào)信號(hào)l信號(hào)被采集信號(hào)被采集l轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)l存儲(chǔ)于電腦上存儲(chǔ)于電腦上回顧回顧流式細(xì)胞儀的三大組成部分？流式細(xì)胞儀的三大組成部分？濾光片濾光片LP600代表什么意思？代表什么意思？BP400/40呢？呢？數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集l三種數(shù)據(jù)：三種數(shù)據(jù)： - 前向散射光FSC - 側(cè)向散射光SS

5、C - 各種熒光散射光FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4l當(dāng)使用激光光源時(shí)，在前向方向（和激光行進(jìn)的方向相同）上可用前向散射光接收通道前向散射光接收通道接收到一定量的散射光l前向散射光的強(qiáng)度是和細(xì)胞或其他檢測(cè)顆粒的大小、形狀密切相關(guān)的數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集- -前向散射光前向散射光l當(dāng)激光光源被使用時(shí)，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生， 可以用9090o o 角的側(cè)向散射光檢測(cè)通道角的側(cè)向散射光檢測(cè)通道來采集l側(cè)向散射光的強(qiáng)度和細(xì)胞或其他檢測(cè)顆粒的顆粒密度、內(nèi)部復(fù)雜程度密切相關(guān)數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集- -側(cè)向散射光側(cè)向散射光外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖圖 顆粒雜質(zhì)、氣泡顆粒雜質(zhì)、氣泡對(duì)檢測(cè)

6、的影響對(duì)檢測(cè)的影響l細(xì)胞標(biāo)記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長(zhǎng)的激發(fā)光來激發(fā)，同時(shí)發(fā)出特定波長(zhǎng)的光l熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收l特定檢測(cè)是通過光學(xué)濾片和透鏡來控制的數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集- -熒光信號(hào)熒光信號(hào)l熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān)熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān)數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集電壓電壓l 信號(hào)放大方式：log、linl 信號(hào)類型：A,W,Hl 電壓的調(diào)節(jié):根據(jù)陰性對(duì)照管來調(diào)節(jié)閾值閾值l可以以任意參數(shù)及多個(gè)參數(shù)的組合作為閾值l大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSCl閾值以下的信號(hào)不存儲(chǔ)l根據(jù)陰性對(duì)照管來調(diào)節(jié)l目的是將不需要的雜質(zhì)信號(hào)，噪音

7、信號(hào)，無用的細(xì)胞信號(hào)等扣除，使收集到的都是有用信號(hào)補(bǔ)償補(bǔ)償l 補(bǔ)償方式：任意兩個(gè)通道之間，可以采用手動(dòng)或自動(dòng)補(bǔ)償。l 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié):根據(jù)單染對(duì)照管來調(diào)節(jié)1.) Compensation - Too Little; Too Much0.111010010000.11101001000A B C D EABCDE21.322.020.220.521.4FL2 - %FL1FractionFL2FL1 (FITC)Fraction% Compensation is independent of fluorescence intensity2.) Basic Principles of Compensa

8、tion - % Compensation is independent of fluorescence intensity3.) Compensation- Too Dim, Too Bright Compensation ControlsSmall errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C).數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析l 流式數(shù)據(jù)流式數(shù)據(jù) 直方圖直方圖 散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖 等高線圖等高線圖 密度圖密度圖 三維圖三維圖 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)直方圖直方圖l 直方圖直方圖(Distribution Histogram) 橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是對(duì)數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)。對(duì)數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)。 縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)?？v坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖l 散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖(Dot Plot) X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量，坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開。參數(shù)的含