火腿腸的檢測(cè)方法

1、火腿腸的檢測(cè)方法長(zhǎng)沙理工大學(xué)生物與食品工程學(xué)院 何應(yīng)洪 摘要：是人們經(jīng)常食用的一種食品，其質(zhì)量直接影響到消費(fèi)者的身體健康。據(jù)業(yè)內(nèi)人士講，由于肉灌腸工藝較簡(jiǎn)單，設(shè)備投入不大，因此，小作坊式生產(chǎn)的廠家較多，質(zhì)量難以保證。一些街頭攤點(diǎn)經(jīng)銷的肉腸由于進(jìn)貨渠道較亂，加之儲(chǔ)存、保鮮條件較差，質(zhì)量更令人擔(dān)憂。本文主要介紹火腿腸的檢測(cè)方法。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì) 脂肪 淀粉 亞硝酸鹽 山梨酸 微生物蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉國家有行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)，但絕大部分企業(yè)都執(zhí)行企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，而企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在一些項(xiàng)目上明顯低于國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1.1 蛋白質(zhì) 考馬斯亮蘭法（Bradford法）1.1.1 實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚

2、試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?？捡R斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比

3、。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。 （2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、

4、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是： （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。 （2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。 （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。 試劑與器材1. 試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BS

5、A)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮蘭G250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。2. 器材：（1）可見光分光光度計(jì) （2）旋渦混合器 （3）試管16支1.1.3 操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)方法（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬

6、斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。（2）加完試劑25分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2O加5.0mlG250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595

7、值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。2. 微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10100mg/ml）,可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G250試劑仍加5.0ml, 同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。1.2 脂肪 索氏抽提法1原理樣品用無水乙醚或石油醚等溶劑抽提后，蒸去溶劑所得的物質(zhì)，在食品分析上稱為脂肪或粗脂肪。因?yàn)槌就?，還含色素及揮發(fā)油、蠟、樹脂等物。抽提法所測(cè)得的脂肪為游離脂肪。2試劑

8、2.1無水乙醚或石油醚。2.2海砂：同GB 5009.385食品中水分的測(cè)定方法2.3。3儀器索氏提取器。4操作方法4.1樣品處理固體樣品：精密稱取25g(可取測(cè)定水分后的樣品)，必要時(shí)拌以海砂，全部移入濾紙筒內(nèi)。液體或半固體樣品：稱取5.010.0g，置于蒸發(fā)皿中，加入海砂約20g于沸水浴上蒸干后，再于95105干燥，研細(xì)，全部移入濾紙筒內(nèi)。蒸發(fā)皿及附有樣品的玻棒，均用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，并將棉花放入濾紙筒內(nèi)。4.2抽提：將濾紙筒放入脂肪抽提器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒量的接受瓶，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚至瓶?jī)?nèi)容積的2/3處，于水浴上加熱，使乙醚或石油醚不斷回流提取，一般抽提

9、612h。4.3稱量：取下接受瓶，回收乙醚或石油醚，待接受瓶?jī)?nèi)乙醚剩12ml時(shí)在水浴上蒸干，再于95105干燥2h，放干燥器內(nèi)冷卻0.5h后稱量。4.4計(jì)算1.3 淀粉 酸水解法原理：樣品經(jīng)除去脂肪及可溶性糖類后，其中淀粉用酸水解成具有還原性的葡萄糖，然后按還原糖測(cè)定，并折算成淀粉含量。換算系數(shù)為162/180=0.9。適用范圍：適用于淀粉含量較高，而其它能被水解為還原糖的多糖含量較少的樣品。因?yàn)樗崴夥ú粌H使淀粉水解，其他多糖如半纖維素和多縮戊糖等也會(huì)被水解為具有還原性的木糖、阿拉伯糖等，使得測(cè)定結(jié)果偏高。因此，對(duì)于淀粉含量較低而半纖維素、多縮戊糖和果膠含量較高的樣品不適宜用該法。特點(diǎn)：操作

10、簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛，但選擇性和準(zhǔn)確性不如酶法。試劑：堿性酒石酸銅甲、乙液；2%（W/V%）鹽酸溶液；6mol/L鹽酸；10及40%氫氧化鈉溶液；0.2標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液；甲基紅指示劑。儀器：冷凝器或lm以上長(zhǎng)玻璃管。1.3.2 測(cè)定步驟： 樣品處理：乙醚除去脂肪；乙醇除去可溶性糖類 水解：于盛有樣品處理液的250ml錐形瓶中，加入30毫升6N鹽酸，接好冷凝管，置沸水浴中回流2小時(shí)。回流完畢后，立即置流水中冷卻。待樣品水解液冷卻后，加入2滴甲基紅指示液，先以40氫氧化鈉溶液調(diào)至黃色，再以6N鹽酸校正至水解液剛變紅色為宜。若水解液顏色較深，可用精密PH試紙測(cè)試，使樣品水解液的PH約為7。然后加20毫升20

11、乙酸鉛溶液，搖勻，放置10分鐘，以沉淀蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、果膠等。再加20毫升10硫酸鈉溶液，以除去過多的鉛。搖勻后將全部溶液及殘?jiān)D(zhuǎn)入500毫升容量瓶中，用水洗滌錐形瓶，洗液合并于容量瓶中，加水稀釋至刻度。過濾，棄去初濾液20毫升，濾液供測(cè)定用。標(biāo)定：同“還原糖的測(cè)定”中的“直接滴定法”樣液的測(cè)定：同“還原糖的測(cè)定”中的“直接滴定法”同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)：取100mL水和30mL6mol/L鹽酸于錐形瓶中，按上述方法操作。 計(jì)算：式中： F-10ml斐林試劑相當(dāng)?shù)钠咸烟橇?V0-滴定時(shí)空白溶液消耗量 V-滴定時(shí)樣品水解液消耗量 m-試樣稱取量（g） 0.9-葡萄糖轉(zhuǎn)換為淀粉的系數(shù) 100-換算為1

12、00g試樣 500樣液總體積1.4 亞硝酸鹽 單掃描示波極譜法測(cè)定香腸中的亞硝酸鹽 量取一定量的NO2標(biāo)準(zhǔn)溶液于電解池中，加入0.2ml品紅溶液，3ml0.1mol/L鹽酸，直到混合液的顏色變?yōu)榱良t色，然后加入0.2ml8-羥基喹啉溶液，4ml3.0mol/L的氨水。這時(shí)溶液呈橙色。再向其中加入用蒸餾水稀釋到10mol。開始進(jìn)行極譜分析。初始掃描電壓0.5V（對(duì)飽和氯化亞汞電極）。峰的高度在0.7V時(shí)被記錄下來。（與分光光度測(cè)定法相對(duì)比）。（圖1）: 亞硝酸鹽樣品的檢測(cè)稱取5.000g香腸，在50ml燒杯中研磨。依據(jù)中華人民共和國的國家標(biāo)準(zhǔn)處理樣品。通過蛋白質(zhì)沉淀，脫脂后，量取2-3.00ml

13、到10ml容量瓶中。然后依據(jù)隨后的操作程序在極譜記錄儀上測(cè)定，根據(jù)工作曲線計(jì)算含量。分光光度測(cè)定法是依據(jù)美國國家標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果是一致的。1.5 山梨酸通過對(duì)液態(tài)、固液混合態(tài)食品前處理方法的改進(jìn),用氣相色譜法快速測(cè)定山梨酸、苯甲酸的含量。樣品酸化后用乙醚提取,直接取上清液進(jìn)樣分析,使用美國安捷倫公司6890型氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)和DB-FFAP123-3233色譜柱(30m320m)1h內(nèi)可測(cè)得兩種防腐劑的平均回收率為99.82%(n=6),平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.265%,檢測(cè)限為1 mg/kg。 方法氣相色譜分析條件美國安捷倫公司6890型氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測(cè)器(FID

14、);DB-FFAP123-3233色譜柱(30m320m0.5m);進(jìn)樣口溫度250;升溫程序:初始柱溫180,保持15min;升溫速率30/min,最終溫度220,保持5min。FID檢測(cè)器溫度250,載氣為高純氮?dú)?流量25mL/min,氫氣流量40mL/min,空氣流量450mL/min,尾氣流量44.9mL/min,分流比81,進(jìn)樣體積為1L。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取山梨酸0.2575g,苯甲酸0.2508g,混合,用乙醚定容至100mL容量瓶,作為儲(chǔ)備液。再稀釋儲(chǔ)備液,即依次吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL儲(chǔ)備液,分別用乙醚定容于50mL容量瓶作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,用此五種標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)

15、定有關(guān)防腐劑的檢測(cè)限、線性范圍并分析精密度。樣品的前處理與測(cè)定方法前處理:稱取23g混合均勻的樣品,置于100mL的燒杯中,加適量去離子水,超聲提取30min,過濾于50mL的比色管中,加鹽酸(1+1)0.5mL酸化,準(zhǔn)確加入10mL乙醚,振搖1min,靜置備用。測(cè)定方法:直接吸取樣品上層澄清液進(jìn)樣,測(cè)定峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。用本法處理樣品,能夠快速測(cè)定液態(tài)、固液混合態(tài)食品中的山梨酸、苯甲酸含量,且平均回收率為99.82%(n=6),平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.265%,檢出限為1mg/kg,因此本方法完全符合防腐劑檢測(cè)要求,具有推廣價(jià)值。1.6 沙門氏菌快速檢測(cè)法 Transia沙門氏菌平板檢

16、測(cè)法與耗時(shí)、昂貴的傳統(tǒng)方法相比，此法快12天，且每次檢測(cè)所需的操作時(shí)間縮短。該法建立在夾心ELISA法的基礎(chǔ)上，利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門氏菌血清型。反應(yīng)的固相載體是一種有可見或不可見條紋的微量反應(yīng)板。其小孔內(nèi)包被有沙門氏菌的特異性單克隆抗體。第一階段，在小孔內(nèi)加入樣品和抗體聯(lián)合物(沙門氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物)。孵育期間，沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種復(fù)合物：包被單克隆抗體-沙門氏菌抗原-抗體聯(lián)合物。洗滌后，通過每孔加入基質(zhì)溶液(過氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)來顯示上述復(fù)合物；酶催化色素原的氧化，結(jié)果產(chǎn)生藍(lán)色。加入反應(yīng)終止液終止催化反應(yīng)，并使反應(yīng)混合物酸化，顏色由藍(lán)變黃。這種ELISA方法可對(duì)經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后，釋放了特異性沙門氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進(jìn)行檢測(cè)。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間；此法可在沒有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，從這點(diǎn)來說，Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法比黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更適應(yīng)于一般的