第五章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)

1、主要內(nèi)容 第一節(jié) 食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性 第二節(jié) 毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的 第三節(jié) 實驗動物的選擇和處理實驗動物的選擇和處理 第四節(jié) 食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點 第五節(jié) 實驗動物的染毒和處置實驗動物的染毒和處置 第六節(jié) 體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用 食品毒理學(xué)作為一門實驗科學(xué)，以動物實驗為中心。 食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物實驗。 食品毒理學(xué)動物實驗的設(shè)計、實施、結(jié)果觀察和評價是毒理學(xué)研究的基本方法。 食品毒理學(xué)研究的主要手段是動物、實驗。 體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化

2、學(xué)物對實驗動物的毒性反應(yīng)，向人(原型)外推，以期評估外源化學(xué)物對人的危害及危險性。1.體外實驗主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究。 以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。實驗動物種類：常見包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、貓、猴、小型豬、雞、青蛙、蟾蜍、魚類等。 豚鼠豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強(qiáng)，繁殖性能好。廣泛用于藥物學(xué)、傳染病學(xué)、免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、耳科學(xué)等各項醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的研究中。 SD大鼠大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力強(qiáng)。自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，對性激素感受性高。 BALB/c小鼠小鼠：對致癌因子敏感，對放

3、射性照射極為敏感。生產(chǎn)性能良好，繁殖期長，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)和單克隆抗體等研究。 意義: 實驗動物是生命科學(xué)（生物、醫(yī)學(xué)、食品等）研究的重要基礎(chǔ)和支撐條件，在科研、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定、安全評價和成果評定中都離不開實驗動物，被稱為“活的儀器、活試劑”。 英國一位科學(xué)家曾這樣比喻：“在生命科學(xué)研究中使用實驗動物就象在分析化學(xué)中使用分析天平一樣重要”。 落戶武漢大學(xué)實驗動物中心的慰靈碑，旨在紀(jì)念在抗非典疫苗和藥物實驗中為人類健康獻(xiàn)身的38只恒河猴第一節(jié)第一節(jié) 食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性食品毒理學(xué)實驗的原則和局限性 食品毒理學(xué)實驗的原則 u 化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于

4、人 u 實驗動物必須暴露于高劑量 u 成年的健康實驗動物(雄性和雌性未孕)和人可能的暴露途徑是基本的選擇 代表性、可重復(fù)性 u化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人 l 人是最敏感的動物物種；l 人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝，與體重(或體表面積)相關(guān)。l這兩個假設(shè)也是全部實驗生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。 以單位體表面積計算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可能達(dá)10倍。因此可以利用安全系數(shù)來計算人的相對安全劑量。第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。 毒理學(xué)試驗中，一般要設(shè)3個或3個以上劑量組，以觀

5、察劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定受試化學(xué)物引起毒效應(yīng)及其毒性參數(shù)。 引起毒效應(yīng)的最低劑量(LOAEL)與人的暴露劑量接近時，說明該化學(xué)物不安全。當(dāng)該劑量與人的暴露劑量有很大的距離(幾十倍，幾百倍或以上)，才認(rèn)為具有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。 第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。 不能重復(fù)的實驗結(jié)果是沒有任何科學(xué)價值的。選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重復(fù)性。 以成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物作為一般人群的代表性實驗?zāi)Ｐ?，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實

6、驗對象的多樣性，減少實驗誤差。 食品毒理學(xué)實驗的局限性 用實驗動物的毒理學(xué)實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性 l 實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別 l 高劑量向低劑量外推的不確定性 l 小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性 l 成年健康動物與不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體之間的易感性不同 首先，實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別。 雖然在毒理學(xué)實驗中通過用兩種或兩種以上的動物，并盡可能選擇與人對毒物反應(yīng)相似的動物，但要完全避免物種差異是不可能的。而且在動物實驗中，可觀察到體征(sign)，而沒有癥

7、狀(symptom)。實驗動物不能述說涉及主觀感覺的毒效應(yīng)，如疼痛、腹脹、疲乏、頭暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應(yīng)就難以或不可能發(fā)現(xiàn)。第二，高劑量向低劑量外推的不確定性 在毒理學(xué)實驗中，為了尋求毒作用的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應(yīng)或劑量-效應(yīng)關(guān)系，往往選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實際接觸的劑量大得多。有些化學(xué)物在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現(xiàn)的反應(yīng)有可能是由于化學(xué)物在體內(nèi)超過了機(jī)體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不確定性。 第三，毒理學(xué)實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應(yīng)，在少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。而化學(xué)物一旦進(jìn)入市場，接觸人群

8、往往會很大。這就存在小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性。 四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，反應(yīng)較單一，而接觸人群可以是不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體，在對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)的易感性上存在很大差異。第二節(jié)第二節(jié) 毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的毒理學(xué)毒性評價試驗的基本目的 包括以下幾點： 受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì) 劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究，可以得到該受試物的多種毒性參數(shù) 確定毒作用的靶器官 確定損害的可逆性 1. 受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機(jī)體的有害作用，對有害作用的觀察應(yīng)該是對每個實驗動物進(jìn)行全面的逐項的觀察和記錄。

9、發(fā)現(xiàn)有害作用是進(jìn)行劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究的前提。2. 2. 劑量劑量- -反應(yīng)反應(yīng)( (效應(yīng)效應(yīng)) )研究。劑量研究。劑量- -反應(yīng)反應(yīng)( (效應(yīng)效應(yīng)) )研究是研究是毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)。 在急性在急性( (致死性致死性) )毒性試驗中，應(yīng)該得到毒性試驗中，應(yīng)該得到LD50LD50（半數(shù)致死（半數(shù)致死劑量劑量/ /濃度），也可以得到濃度），也可以得到LD01LD01（最小致死劑量或濃度（最小致死劑量或濃度）和）和MTDMTD（最大耐受劑量或濃度）。（最大耐受劑量或濃度）。 在急性非致死性毒性試驗中，可應(yīng)該得到急性可觀察到在急性非致死性毒性試驗中，可應(yīng)該得到急

10、性可觀察到有害作用的最低劑量有害作用的最低劑量(LOAEL)(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑和未觀察到有害作用的劑量量(NOAEL)(NOAEL)。 在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗中，可得到相應(yīng)的在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗中，可得到相應(yīng)的LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL。 在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗中，劑量在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗中，劑量- -反應(yīng)反應(yīng)( (效應(yīng)效應(yīng)) )研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據(jù)。在致畸試驗也可得到依據(jù)。在致畸試驗也可得到LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL；在致突變、

11、；在致突變、致癌試驗中，盡管認(rèn)為是無閾值的，但也可得到表觀的致癌試驗中，盡管認(rèn)為是無閾值的，但也可得到表觀的LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL。3. 確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學(xué)研究的重要目的，以闡明受試物毒作用的特點，并為進(jìn)一步的機(jī)制研究和毒性防治提供線索。4. 確定損害的可逆性。 一旦確認(rèn)有害作用存在，就應(yīng)研究停止接觸后該損害是否可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復(fù)，還是像化學(xué)致癌作用那樣停止接觸后損害繼續(xù)發(fā)展？ 毒性的可逆性關(guān)系到對人的危害評價，如果受損的器官組織能夠修復(fù)并恢復(fù)正常功能，則可能接受較高危險性的接觸水平。描述性動物毒性實驗 1、急性致死

12、性毒性實驗 2、皮膚和眼刺激試驗 3、致敏試驗 4、亞急性（重復(fù)劑量）毒性試驗 5、亞慢性毒性試驗 6、慢性毒性試驗 7、發(fā)育和生殖毒性試驗 8、致突變試驗 急性致死性毒性實驗對新化合物首先進(jìn)行的第一個試驗，是使用一種或一種以上的動物，通過一種或一種以上的途徑（其中一種途徑為經(jīng)口途徑，或其他有意攝入的途徑）測定LD50和其他毒效應(yīng)的試驗。最常使用的動物是小鼠和大鼠，但有時也用家兔和狗。受試動物包括雌雄兩性成年動物，染毒前往往隔夜禁食。記錄一次染毒后14天內(nèi)動物死亡的數(shù)目。除死亡和體重改變外，每天還要觀察受試動物的中毒癥狀、活動狀況、行為改變、患病情況、食物利用率等。 亞慢性毒性試驗染毒期限有時

13、不同，最常采納的實驗期限是90天。最主要目的是確定“無可觀察到作用劑量（NOAEL）”，并進(jìn)一步確認(rèn)重復(fù)染毒情況下，受試物毒作用的特異靶器官。除受試物種的NOAEL外，還可獲得“觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL）”。亞慢性毒性試驗一般選擇2種動物（大鼠和狗），采用與預(yù)定實際接觸相一致的染毒途徑（常為經(jīng)口途徑）。 慢性毒性試驗除了實驗期限超過3個月以外，長期或慢性毒性試驗的進(jìn)行在其他方面都類似于亞慢性實驗。慢性毒性試驗染毒期間對嚙齒類一般為6個月至2年的時間，對非嚙齒類通常為1年甚至更長。染毒持續(xù)時間在某種程度上取決于人類實際接觸時間。目的是評價化學(xué)物的蓄積毒性。 致突變試驗 致突變作用是化

14、學(xué)物引起細(xì)胞核遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力。這種改變是可以通過細(xì)胞分裂傳遞給下一代細(xì)胞的。突變可以發(fā)生于兩種類型的細(xì)胞，產(chǎn)生本質(zhì)上不同的后果。 生殖細(xì)胞突變：引起精細(xì)胞和卵細(xì)胞的DNA損傷，并可通過減數(shù)分裂將突變遺傳到子代細(xì)胞。 體細(xì)胞突變是指發(fā)生在精、卵細(xì)胞以外所有其他種類細(xì)胞的突變。體細(xì)胞突變是不遺傳的，但可以通過有絲分裂將遺傳缺陷傳遞給同一組織的其他細(xì)胞，也可能引起細(xì)胞死亡。第三節(jié)第三節(jié) 實驗動物的選擇和處理實驗動物的選擇和處理 1、 實驗動物物種的選擇 u 基本原則l 選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種l 自然壽命不太長的物種l 易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種l 經(jīng)濟(jì)并易于獲

15、得的物種u 目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。l 系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。l豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗。l兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗。l遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔。l遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)2、實驗動物品系的選擇 品系品系(strain) 指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。 實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為： 近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白I、津白、615，DBA1和DBA

16、2，BALB/C，C3H，C57B6J，A和AHe等。 雜交群動物(雜交1代，F(xiàn)1)，指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。 封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。 根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。雜交群次之、封閉群較低。 不同品系實驗動物對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別不同品系實驗動物對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇

17、適宜的品系，對某種外，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(或二級以上)的動物 。I級：級：CV (conventional animal) 開放系統(tǒng)，普通飼養(yǎng)，大批生產(chǎn)，成本低，是最低級別的實驗動物。 CV廣泛應(yīng)用于教學(xué)、預(yù)試驗及一些要求不嚴(yán)的短期試驗，生物制品生產(chǎn)。 嚴(yán)格意義上講，CV不適合于科學(xué)研究。盡管如此，CV祖先來自于無特定病原體動物(SPF)，剖腹產(chǎn)后普通化，即開放飼養(yǎng)。 CV在飼料配方，飲水，室內(nèi)

18、溫、濕度、光照、噪聲仍應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。 市售和來歷不明的動物為“無證動物”，試驗結(jié)果不予承認(rèn)。II級：CL（Clean animal） 親代是SPF或GF，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。質(zhì)量控制要求介于CV與SPF之間。 國外無此級別，國外一般均采用SPF或GF。 國內(nèi)由于發(fā)展水平條件所限，作為一種過渡，暫可作為標(biāo)準(zhǔn)實驗動物用于一般的科學(xué)研究。 屏障系統(tǒng)：空氣經(jīng)過一定的過濾凈化，飼養(yǎng)環(huán)境保持正壓，進(jìn)入系統(tǒng)的一切物品：飼料、飲水、用具等均需經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理。工作人員進(jìn)出消毒，衣、帽、手套、口罩均需消毒。飲水除高壓消毒外，還應(yīng)酸化和過濾凈化。III級：SPF (specific pathogen free anim

19、al) 屬健康無病動物，動物質(zhì)量高，適合長期慢性實驗，并能取得可靠實驗結(jié)果。 廣泛應(yīng)用于藥學(xué)、毒理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、傳染病學(xué)、多種診斷和疫苗生產(chǎn)，以及生物制品鑒定中。 IV級：GF ( germfree animal) GF: 無菌剖腹產(chǎn)，在絕對隔離器中養(yǎng)育。（塑料薄膜無菌隔離器） 應(yīng)用：應(yīng)用： 在實驗動物領(lǐng)域應(yīng)用； 在免疫學(xué)方面應(yīng)用：是研究免疫發(fā)生機(jī)理與生產(chǎn)高效優(yōu)質(zhì)疫苗的最理想動物。 用于微生物學(xué)研究：研究微生態(tài)學(xué)的最理想的動物模型。 腫瘤學(xué)研究：是研究致癌機(jī)理，防癌、抗癌藥物篩選的理想動物。 營養(yǎng)學(xué)研究：是研究營養(yǎng)學(xué)的良好模型。GF動物不僅用來觀察腸道內(nèi)細(xì)菌對代謝的影響，還用于研究限制采

20、食，對壽命，免疫力的影響，無菌動物對諸多營養(yǎng)機(jī)理的分析將起到更重要的作用。 毒理與藥理學(xué)研究：最適合于進(jìn)行慢性毒性實驗，適合于新藥毒性及安全性評估。在微生態(tài)制劑、生物制品、抗菌素試驗研究方面具有明顯優(yōu)勢。 老年醫(yī)學(xué)：無菌動物是最理想的衰老模型，無菌動物壽命明顯延長。 其次：在放射醫(yī)學(xué)、口腔醫(yī)學(xué)、軍事、航天、環(huán)境醫(yī)學(xué)等方面都有廣泛應(yīng)用。4、個體選擇 u 性別 如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動物的實驗結(jié)果分別統(tǒng)計分析。 u 年齡和體重 在幼年期和老年期，對外源化學(xué)物的生物轉(zhuǎn)運和生物轉(zhuǎn)化，

21、靶器官和受體的敏感性均與成年期不同。毒理學(xué)試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。 u 生理狀態(tài) 妊娠影響體重及其他指標(biāo)的檢測結(jié)果，且性激素對外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響，應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。u 健康狀況 應(yīng)選用健康動物：發(fā)育正常、體形健壯，無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂，行動靈活、反應(yīng)敏捷，眼睛明亮有神，表皮無潰瘍和結(jié)癡，天然孔道干凈無分泌物等。u 為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察57天。對于大鼠和狗的亞慢性和慢性試驗，可在實驗前采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查，異常的動物應(yīng)剔除；對狗應(yīng)常規(guī)驅(qū)除腸道寄生蟲。五、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境 實驗動物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在（223），家兔可控制

22、在（203），相對濕度30%70%，無對流風(fēng)。 人工晝夜周期，即使動物處于人工調(diào)控的12小時白晝(早6點至晚6點)及12小時黑夜(晚6點至次日早6點)，以穩(wěn)定其生物時間節(jié)律。 第四節(jié)第四節(jié) 食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點食品毒理學(xué)試驗設(shè)計要點一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計u 1. 劑量分組 一般至少要設(shè)3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組) 。 高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用，低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用(即相當(dāng)于NOAEL)，但低劑量組劑量應(yīng)當(dāng)高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應(yīng)出現(xiàn)輕微的毒性效應(yīng)(即相當(dāng)于LOAEL)。 1）急性毒性實驗

23、 查閱文獻(xiàn)，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)其毒性中值；但應(yīng)注意，一定是相同動物種系和相同接觸途徑。以此預(yù)期毒性中值為待測化合物的中間劑量組，再上下各推一到兩個劑量組做預(yù)試驗。每個劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化合物的致死劑量范圍。 初起組距可用劑量間的4倍差，即以log4(log40.6)來劃分各組劑量。 一般設(shè)置57個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只，若設(shè)計采用霍恩氏法計算LD50時，動物數(shù)可減少。每組動物應(yīng)雌雄各半；如化合物毒性有

24、性別差異，則應(yīng)分別求雌、雄性動物各自的LD50(LC50)。 2）亞慢性毒性實驗 亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應(yīng)，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。此劑量的確定可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物L(fēng)D50的1/201/5為最高劑量。 化合物亞慢性毒性試驗應(yīng)求出其劑量反應(yīng)關(guān)系，為此，亞慢性試驗至少應(yīng)設(shè)計三個染毒劑量組及一個正常動物對照組，必要時再加一個受試化合物的溶劑對照組。最低劑量組的劑量應(yīng)相當(dāng)于亞慢性的閾劑量水平或未觀察到作用水平，中間劑量組動物以出現(xiàn)輕微中毒效應(yīng)為度。 3）慢性

25、毒性實驗 為制定外來化合物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行慢性毒性試驗時，一般設(shè)3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設(shè)一個溶劑對照組，即無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生比較輕微毒性效應(yīng)的劑量組(此為最高劑量組)。以求出明確的劑量反應(yīng)關(guān)系。 染毒組劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。一是以亞慢性閾劑量為出發(fā)點，即以亞慢性閾劑量或其1/5 1/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗的預(yù)計閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計的慢性無作用劑量組；一是以急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50 的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計慢性閾劑量，以LD50 的1/1000為

26、預(yù)計的無作用劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應(yīng)當(dāng)大些，有利于求出劑量-反應(yīng)關(guān)系，也有助于排除實驗動物個體敏感性差異。組間劑量差一般以510倍為宜，最低不小于兩倍。毒理學(xué)試驗常用的對照有4種： l 未處理對照組 不施加任何處理因素。 l 陰性(溶劑賦形劑)對照 不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑賦形劑)，以排除此實驗因素(溶劑賦形劑)的影響， l 陽性對照 用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。陽性對照組最好與受試物用相同的溶劑、染毒途徑及采樣時間。 l 歷史性對照 由本實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成，上述三種對照都可構(gòu)成相應(yīng)的歷史對照。 u 各組動物數(shù) 應(yīng)考慮到統(tǒng)計學(xué)的要

27、求。u 試驗期限 某些試驗(如致畸試驗和多代生殖試驗)的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。 急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天。一般要求計算兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率，有些速殺性化合物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別。但應(yīng)注明是多少時間的LD50值，以便于在進(jìn)行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)。 亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10，對大鼠和小鼠為90天，對狗應(yīng)為1年。一般認(rèn)為在環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)中所要求的連續(xù)接觸為36個月，而在工業(yè)毒理學(xué)中認(rèn)為13月

28、即可。 慢性毒性試驗致癌試驗一般規(guī)定為持續(xù)至實驗動物壽命的大部分。又可分為兩類，即規(guī)定試驗期限的試驗，或直到最敏感的組死亡率達(dá)到某一水平(通常為80)的試驗。 一般認(rèn)為工業(yè)毒理學(xué)慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；而環(huán)境毒理學(xué)與食品毒理學(xué)則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學(xué)者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應(yīng)，以及求出閾劑量或無作用劑量。二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計 u 測定受試物溶解性 u 試驗最高劑量的推薦 大多數(shù)情況下，可溶性受試物的試驗上限應(yīng)該是：(1)對哺乳動物細(xì)胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對細(xì)菌試驗為5mg/平板。 u 代謝活化 常規(guī)使用Aro

29、clor 1254（多氯聯(lián)苯1254）預(yù)處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應(yīng)的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。 u 陽性對照 陽性對照的劑量應(yīng)選擇其劑量-反應(yīng)的直線部分。u 重復(fù) 可疑結(jié)果則應(yīng)重復(fù)實驗，最好改變劑量范圍劑量間隔、改變S9濃度或改變實驗方法進(jìn)行重復(fù)。 第五節(jié)第五節(jié) 實驗動物的染毒和處置實驗動物的染毒和處置 一、動物實驗前的準(zhǔn)備u 購進(jìn)之后，應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng) u 進(jìn)行57天的檢疫 u 實驗動物的標(biāo)記 l 嚙齒動物 染色法 苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色l 嚙齒動物 剪耳法 l 狗等大動物 掛牌法 u 分組 按性別、體重順序編號，隨機(jī)

30、分組 二、受試物和樣品的準(zhǔn)備u 了解受試物的純度、雜質(zhì)成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)u 檢索相似化合物的毒性資料，以作參考u 受試物應(yīng)一次備齊全部實驗的用量 所需受試物總量(ABCD)1.2 式中：A為每組動物數(shù)；B為各處理組的劑量之和(如0.1+0.3+1.0mg/kg1.4mg/kg)；C為染毒次數(shù)(通常為天)；D為動物的平均體重；1.2為安全因子，防止損耗。u 將受試物制備成一定的劑型 常制備成水溶液、油溶液或混懸液。溶劑或助溶劑應(yīng)該是無毒的，與受試物不起反應(yīng)，受試物在溶液中應(yīng)穩(wěn)定。l 水溶性受試物 水、等滲鹽水 l 水不溶性受試物 溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中 u 各種染毒途徑的最大容積，以

31、受試的實驗動物物種或制劑來確定。 一般規(guī)定，染毒最大容積為：經(jīng)口20ml/kg (對空腹動物)；經(jīng)皮2ml/kg(根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準(zhǔn)確性)；靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；肌肉注射0.5ml/kg(一個部位)；每眼0.01ml；直腸0.5ml/kg；陰道：大鼠0.2m1，兔1ml；吸入2mg/L；鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。 三、染毒途徑 最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。u經(jīng)口(胃腸道)染毒 常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。 l 灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。 l 吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下。

32、 l 喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。 u 經(jīng)呼吸道染毒 經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。l 靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。l 動式吸入染毒：由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。l 氣管內(nèi)注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。 u經(jīng)皮膚染毒 l 經(jīng)皮染毒毒性試驗 l 皮膚刺激和致敏試驗 試驗前用機(jī)械法(剃毛)或化學(xué)法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。不應(yīng)損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動物體表面積的1015。 u 注射染毒 注射用藥品，應(yīng)以注

33、射途徑染毒，對大小鼠可用靜脈注射，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑。 應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)58，最好是等滲溶液。 靜脈注射應(yīng)控制速度。 四、癥狀觀察u 急性毒性試驗 應(yīng)詳細(xì)地觀察動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點、死亡時間等等。 化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)毒物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)u 亞慢性試驗觀察指標(biāo) 1、一般性指標(biāo) 1）.一般綜合性觀察指標(biāo) 動物體重 食物利用率 癥狀 臟器系數(shù) 2）.一般化驗指標(biāo) 主要指血象和肝、腎功能的檢測，在亞慢性試驗中研究外來化合物對實驗動物的毒性作用。 2、病理學(xué)檢查 u慢性試驗 其中包括體重、食物攝取、臨床癥狀、行為、血象和血液化學(xué)、尿

34、的性狀及生化成分以及重點觀察在亞慢性毒性試驗中已經(jīng)顯現(xiàn)的陽性指標(biāo)。五、實驗動物處死及生物標(biāo)本采集u 實驗動物處死方法 大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死。u 血液采集 不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10。u 尿液采集 大小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器。 狗可用接尿法或?qū)蚍ā?u 病理解剖和標(biāo)本留取 毒性病理學(xué)檢查是毒理學(xué)試驗重要的組成部分，病理學(xué)研究有助于確定有害作用和靶器官。l 大體解剖：在實驗動物處死后半小時內(nèi)進(jìn)行。觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。對指定的臟器稱重，并計算臟器系數(shù)。 l

35、組織病理學(xué)檢查：對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。 第六節(jié)第六節(jié) 體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用體外試驗在毒理學(xué)中的應(yīng)用 體外試驗?zāi)Ｐ?in vitro test)在判斷外源化學(xué)物及其制品和混合物等對人類健康是否具有損害作用過程中也起著重要的作用。 原因： 量大 全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進(jìn)入人類的環(huán)境。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒有進(jìn)行必要的毒理學(xué)評價。 節(jié)省時間和經(jīng)費 動物保護(hù)主義運動的興起 生物技術(shù)為毒性試驗和研究提供

36、的新方法和工具 一、概述 (一) 分類 依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類： 篩選試驗 僅提供決策過程的最初的資料 附加試驗 為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料 替代試驗 在大量實驗的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗?zāi)芴娲w動物試驗 (二) 基本原理 體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。 基于上述原理，體外試驗?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐挕?(三) 體外試驗的優(yōu)缺點 體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點u能控制環(huán)境因素u可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響u每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞

37、器等u試驗間的誤差較少u可同時和或反復(fù)多次取樣u可做成復(fù)雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)等u較為快速和經(jīng)濟(jì)u需要較小量的受試化合物u產(chǎn)生較小量的有毒廢物u可以利用人體細(xì)胞u減少整體動物的使用 其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細(xì)胞。 體外毒性試驗結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學(xué)物毒理學(xué)資料所需的時間，最終可以縮短從新化學(xué)物的合成到產(chǎn)品進(jìn)人市場的時間過程。此外，對鑒定毒理學(xué)資料有問題的新化學(xué)物，可及時終止開發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。 在毒理學(xué)整體試驗中禁止直接進(jìn)行人體試驗。目前主要是將動物試驗結(jié)果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。在體外試驗中，利用人體細(xì)胞組織進(jìn)行試驗，可較好地解決物種差異的問題。 不足之處：u 體外到