蛋白組學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)

1、蛋白質(zhì)組學(xué)1第四章 定量蛋白質(zhì)組學(xué)Quantitative proteomics定量蛋白質(zhì)組學(xué)，就是把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜混合體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定的一門學(xué)科。2蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目的是以大規(guī)模的尺度研究細(xì)胞蛋白質(zhì)的功能。依靠2-DE和質(zhì)譜技術(shù)，蛋白質(zhì)組的研究策略和方法在細(xì)胞蛋白質(zhì)的鑒定上已經(jīng)比較成熟。但是僅僅進(jìn)行鑒定并不能提供用以闡明蛋白質(zhì)的功能的全部信息，監(jiān)控蛋白質(zhì)的表達(dá)水平對(duì)闡明細(xì)胞體內(nèi)存在的各種生物進(jìn)程是非常重要的。因此，定量蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要一部分被提出來。 3常用研究方法以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)標(biāo)記定量方法 熒光差示雙向凝膠電泳技術(shù)（F2D

2、DIGE）4化學(xué)標(biāo)記定量對(duì)具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽，通過比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)弱，可以得到其相對(duì)量的數(shù)值。用一種質(zhì)量標(biāo)簽來標(biāo)記一種狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，與另一種狀態(tài)下沒有標(biāo)記的蛋白質(zhì)混合起來，進(jìn)行質(zhì)譜分析，然后比較某個(gè)蛋白質(zhì)沒有標(biāo)記的峰和標(biāo)記后峰的強(qiáng)弱，就可知道該蛋白質(zhì)在這種狀態(tài)下表達(dá)量的變化。常用的是在樣品中加入包含穩(wěn)定的重質(zhì)同位素(2H、13C、15N、18O、35S) 試劑, 與被分析物結(jié)合而被標(biāo)記，通過質(zhì)譜檢測(cè)以確定其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。5標(biāo)記方法體內(nèi)標(biāo)記 15N體內(nèi)代謝標(biāo)記 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸體內(nèi)標(biāo)記(SILAC法) 體外標(biāo)記-NH2氨基標(biāo)記 COOH羧基標(biāo)記 -SH巰基標(biāo)記ICAT

3、策略 6（一）體內(nèi)代謝標(biāo)記方法培養(yǎng)方法：將兩種細(xì)胞樣品分別置于正常培養(yǎng)介質(zhì)（14N）和富含某重質(zhì)同位素（15N）的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 蛋白質(zhì)提?。号囵B(yǎng)一定時(shí)期后，將兩者混合，然后破細(xì)胞，提取相關(guān)部位感興趣的蛋白質(zhì)，進(jìn)行消化酶解。 鑒定：通過選擇性親和分離、色譜分離等過程，最后進(jìn)行質(zhì)譜分析。每一對(duì)分析肽段與內(nèi)標(biāo)肽段在得到的質(zhì)譜圖中表現(xiàn)為一對(duì)峰，峰的間距等于肽段中所含的氮原子的個(gè)數(shù)。7釀酒酵母G1細(xì)胞周期蛋白Cln2的影響：cln2: 14NCLN2: 15NA: 翻譯延伸因子1a cln2 : CLN21：0.93B：磷酸丙糖異構(gòu)酶（Tpi1）代謝標(biāo)記典型質(zhì)譜圖8體內(nèi)代謝標(biāo)記法具有較好的穩(wěn)定性和

4、重復(fù)性915N體內(nèi)代謝標(biāo)記也可以定量位點(diǎn)特異的化學(xué)修飾磷酸化修飾定量：X：未被磷酸化的肽段Xp：被磷酸化的肽段X被磷酸化成Xp后分子量會(huì)增大，在MS圖譜上峰會(huì)遷移10特點(diǎn)代謝標(biāo)記方法比較準(zhǔn)確和穩(wěn)定,可以檢測(cè)蛋白質(zhì)在pmol濃度內(nèi)的20的量的變化。 不能直接用于組織樣品的分析。 同位素試劑需要量較大，成本高。相同肽段的不同同位素標(biāo)記形式之間的質(zhì)量變化依賴于氮原子數(shù)目，因此對(duì)未知的蛋白質(zhì)難以進(jìn)行定量。 11（二）穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸體內(nèi)標(biāo)記(SILAC法) 高等動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)中需要一些必需氨基酸的攝入，如賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，這些氨基酸細(xì)胞自身無法合成，需

5、要從外界攝入補(bǔ)充。 在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，可以在培養(yǎng)介質(zhì)中特異的加入用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的某一種必需氨基酸，在經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間后，細(xì)胞中合成的含有這類氨基酸的蛋白質(zhì)幾乎都摻入了標(biāo)記的氨基酸 。收獲不同同位素標(biāo)記的不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞，混合裂解，再做質(zhì)譜，就可以從質(zhì)譜圖上得到蛋白質(zhì)差異表達(dá)量的信息。 這種蛋白質(zhì)定量策略稱為SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，細(xì)胞培養(yǎng)物中含有穩(wěn)定同位素的氨基酸標(biāo)記) 12SILAC法: 鼠肌肉細(xì)胞分化過程中蛋白表達(dá)量變化 Leu-d0 Leu-d3 (L-leucine-5,5,5-D3

6、)Leu被標(biāo)記：豐度最高氨基酸13Leu-d3可被細(xì)胞吸收肽段：VAPEEHPVLLTEAPLNPK，帶3個(gè)電荷143-磷酸-甘油醛-脫氫酶表達(dá)變化15用Lys來標(biāo)記明顯好于其他的必需氨基酸，因?yàn)楫?dāng)用胰蛋白酶(Trypsin)酶切時(shí)，保證了含有Lys殘基的每個(gè)肽段都只含有一個(gè)標(biāo)記物避免了未知肽段用15N標(biāo)記所帶來的質(zhì)量變化不清的類似問題有利于蛋白質(zhì)做MS/MS鑒定時(shí)質(zhì)譜圖的解析16體內(nèi)標(biāo)記和體外標(biāo)記比較總的來說，體內(nèi)標(biāo)記相對(duì)于體外標(biāo)記方法來說具有一些自身的優(yōu)勢(shì) 省去了標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)和分離純化等步驟，因而減少了樣品的損失 有利于低豐度蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測(cè) 體內(nèi)標(biāo)記也存在一些缺點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞在富含穩(wěn)定

7、同位素的介質(zhì)中生長(zhǎng)，這些介質(zhì)可能會(huì)影響細(xì)胞的繁殖和其他生物進(jìn)程，由此改變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 這種方法受到同位素材料成本的限制，不可能整個(gè)動(dòng)物體進(jìn)行標(biāo)記 對(duì)于未知序列肽段，大多數(shù)的體內(nèi)標(biāo)記都無法確定標(biāo)記物與肽段之間量的關(guān)系，從而使得我們難以確認(rèn)同一肽段在質(zhì)譜圖上成對(duì)出現(xiàn)的不同同位素標(biāo)記形式 17體外標(biāo)記常用方法-NH2氨基標(biāo)記COOH羧基標(biāo)記 -SH巰基標(biāo)記ICAT策略18NH2標(biāo)記（d0/d3 、d0/d4 法）多肽的N末端和Lys殘基側(cè)鏈上是-NH2基團(tuán)，容易跟含有酰氧基的小分子如琥珀酸酐、N-乙酰氧琥珀酰亞胺等發(fā)生?；磻?yīng)，從而對(duì)肽段進(jìn)行標(biāo)記。采用一種正常的?；噭┡c分別含3個(gè)（d0/d

8、3）、4個(gè)氘原子（d0/d4）的氘代?；噭?biāo)記酶解后的多肽體系。該類試劑可與肽的N-端氨基發(fā)生穩(wěn)定的?；磻?yīng)，還可與肽中賴氨酸的-氨基反應(yīng)。當(dāng)某肽段中不含賴氨酸時(shí)，分析物與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜峰對(duì)分別相差3和4個(gè)質(zhì)量單位，被分析肽段中每增加一個(gè)賴氨酸殘基，該質(zhì)譜峰對(duì)的差距就分別增加3和4個(gè)質(zhì)量單位。19d0/d3標(biāo)記蛋白質(zhì)N末端原理N-乙酰氧基琥珀酰亞胺(N-Acetoxysuccinimide )三氘代 N-乙酰氧基琥珀酰亞胺(N-acetoxy-D3succinimide )20MALDI-TOF /MS 分析 N末端乙酰化肽段1195.61261198.641821MALDI -TOF/M

9、S 分析 N末端和Arg的NH2乙?；亩?574.76101580.762422E.coli 半乳糖苷酶蛋白水平半乳糖苷酶蛋白表達(dá)量可被誘導(dǎo)表達(dá)提高到2.5倍誘導(dǎo)表達(dá)：1H3標(biāo)記未誘導(dǎo)表達(dá)：2H3標(biāo)記23d0/d4標(biāo)記蛋白質(zhì)N末端原理H4-Nic-NHS1-(H4-煙酰氧基)琥珀酰亞胺四氘代 H4-Nic-NHS1-(H4-煙酰氧基)琥珀酰亞胺24MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labeled with succinic anhydride and deuterated succinic anhydride25d0/d4修飾N末端NH2或-NH2依賴

10、反應(yīng)條件262728d0/d4標(biāo)記用于分析蛋白質(zhì)表達(dá)相對(duì)量29E.coli 在完全培養(yǎng)基和條件限制培養(yǎng)基中的蛋白表達(dá)比較30d0/d4標(biāo)記37點(diǎn)，進(jìn)行MS分析37點(diǎn)：兩個(gè)蛋白一個(gè)蛋白量上沒有變化（*）一個(gè)蛋白在條件限制培養(yǎng)基中表達(dá)增加，1:331Lys上-NH2特異標(biāo)記方法：MCATO-甲基異脲(O-methylisourea)可以選擇性地胍基化Lys殘基上的-NH2 。不標(biāo)記N末端的NH2和其它殘基側(cè)鏈?！百|(zhì)量標(biāo)記的豐度標(biāo)簽”(Mass-Coded Abundance Tagging，MCAT)的標(biāo)記策略。每標(biāo)記上一個(gè)胍基，片段分子量增加42Da。32MCAT策略流程：定性Lys只在Tryp

11、sin酶切后的末端，所以產(chǎn)生的b離子都沒有被修飾；所有的y離子帶Lys，因此被修飾。在MS/MS圖譜上，所有的b離子是單一條帶出現(xiàn)，所有的y離子是成對(duì)出現(xiàn)，豐度比例一樣，且相差同樣的m/z。容易區(qū)分b離子和y離子，容易讀出氨基酸序列。33MCAT策略流程：定量將來源不同樣品的裂解物進(jìn)行標(biāo)記或不標(biāo)記，然后等量混合，經(jīng)LC分離，在MS圖譜上就可分析不同蛋白量的變化34酵母細(xì)胞提取物的離子層析和LC/MS圖譜：定性分析肽段胍基化后分子量增大，在層析圖上較晚出現(xiàn)。35肽段的定量分析肽段被胍基后，分子量增加42Da，但是帶2個(gè)電荷，m/z相差21個(gè)單位通過離子交換層析圖譜上峰的面積，可以計(jì)算兩種肽段的相

12、對(duì)量 0.88 : 136MCAT優(yōu)點(diǎn)O-甲基異脲(O-methylisourea)對(duì)Lys殘基-NH2的胍基化程度可以進(jìn)行量上的控制增加的質(zhì)量（每個(gè)胍基42 Da）可以很容易在MS上檢測(cè)到-NH2的胍基化修飾并不影響肽段的離子化和帶電荷程度37COOH羧基標(biāo)記通過對(duì)羧基酯化進(jìn)行標(biāo)記 用H和D標(biāo)記的甲醇酯化標(biāo)記，來定量研究蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異 38羧基酯化標(biāo)記進(jìn)行蛋白定量研究比例2 : 139缺點(diǎn)：特異性不是很好，在C末端和Asp和Glu殘基上都有標(biāo)記，且效率不均 采用的標(biāo)記條件容易引起天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺 40COOH羧基標(biāo)記在H218O的溶液中進(jìn)行蛋白酶切，從而特異

13、性的只在C末端引入穩(wěn)定的同位素標(biāo)記這類蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入一個(gè)18O41這類蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入二個(gè)18O42標(biāo)記后的肽段在質(zhì)譜上的分離4318O進(jìn)行蛋白質(zhì)組的標(biāo)記和定量44-SH在標(biāo)記反應(yīng)中的作用Cys殘基上的-SH基團(tuán)更具有標(biāo)記反應(yīng)的特異性 ，如烷基化試劑如碘乙酸等能專一的對(duì)Cys的巰基進(jìn)行烷基化 。如果將穩(wěn)定同位素引入這些烷基化試劑，那么就可以通過比較質(zhì)譜圖譜上成對(duì)出現(xiàn)的質(zhì)譜峰信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量了。Cys是一種特殊的氨基酸，在蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生的多肽片段不一定含有Cys殘基。E.coli和酵母細(xì)胞中含有Cys殘基的蛋白質(zhì)分別占到蛋白質(zhì)總量的85.7%和91

14、.6%，而在trypsin酶切產(chǎn)生的肽段中，含有Cys殘基的多肽分離僅占9.4%和9.3% 。如果能將這些烷基化標(biāo)記的肽段給分離出來鑒定和定量，既能檢測(cè)到足夠多的蛋白質(zhì)，又大大減少了工作量，更適宜大規(guī)模操作。45d0/d8法（ICAT方法）同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽方法(Isotope Code Affinity Tag)ICAT試劑是一種人工合成的有機(jī)分子，包括三個(gè)部分：反應(yīng)基團(tuán)，可特異的與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的Cys殘基的巰基(-SH)進(jìn)行反應(yīng)，使試劑共價(jià)結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈上。同位素標(biāo)記的接頭，含有穩(wěn)定同位素(H和D)的標(biāo)記。親和標(biāo)記的生物素，用于分離標(biāo)記的蛋白質(zhì)或多肽。46reactive groupb

15、iotin taglinker (heavy or light)SHNNHONHOOOHHHHNHIOHHHHLight Reagent (D0)Heavy Reagent (D8)Isotope Coded Affinity Tag Reagents (ICAT)reactive groupbiotin taglinker (heavy or light)SHNNHONHOOODDDDNHIODDDD47X = Hydrogen (light) or Deuterium (heavy)SHcys+Protein (reduced)ICAT Reagent (D0 or D8)ICAT lab

16、eled Protein1) Label Proteins with D0/D8 ICAT Reagent, Digest SHNNHONHOOOXXXXNHIOXXXXScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXXTrypsin(or other enzyme)48ICAT labeled peptide+ other peptides+Wash off other peptides then Elute from AvidinAvidinEluteWashICAT labeled peptide2) Purify ICAT Labeled PeptidesScysSHNNHONHOO

17、OXXXXNHOXXXXScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXXScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXX49ICAT labeled peptideQuantifyMWIntensityMSMS/MSIdentifySequence3) Analyze ICAT Labeled Peptides8 DaT S V QScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXX50Mix &DenatureMiniPrep CellMolecular WeightSeparationInto SDSBufferFractionproteolyzeAffinityPurificat

18、ionFlow-throughICAT Reagent-Cys PeptidesFinger Printing: Protein IDQuantitation: Protein Expression1366.01465.81565.61665.41765.20501001566.01576.81587.6050100Finger Printing: Protein IDICAT-SDS Prep Gel Method51 ICAT方法操作步驟 525354ICAT策略優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用ICAT策略對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量若一種蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生至少有一個(gè)Cys殘基的肽段的話，就可以對(duì)其鑒別和定量。含有Cys殘

19、基的肽段越多，結(jié)果對(duì)照得出的結(jié)論越準(zhǔn)確。鑒定的肽段中肯定都含有至少一個(gè)Cys，因此在進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索時(shí)就增加了一個(gè)有效的約束條件。肽段根據(jù)標(biāo)記情況有選擇性的得到了富集，從而減少了下游質(zhì)譜分析的復(fù)雜程度。例如Gygi等用ICAT處理酵母蛋白混合物時(shí)，從344,855個(gè)肽段中富集了30,619個(gè)標(biāo)記肽段，大大減少了后期的工作量。分離出來的標(biāo)記多肽可直接與后面的RP-LC-MS分析系統(tǒng)在線偶聯(lián)操作。55ICAT方法的缺點(diǎn)從相互比較的樣品處理到最后的質(zhì)譜定量分析經(jīng)過的步驟較多；ICAT試劑修飾的得率等微小差異都可能干擾兩種差異表達(dá)蛋白質(zhì)的精確定量；只能分析含有Cys殘基的多肽，對(duì)于那些在功能上有重要作用

20、的但不含Cys殘基的蛋白質(zhì)將會(huì)被遺漏。56二、熒光差示雙向凝膠電泳技術(shù)(F-2D-DIGE)Fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis57蛋白質(zhì)染色要求對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)混合物，首先用2D進(jìn)行分離，然后對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行染色，再通過比較單個(gè)蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度，對(duì)其進(jìn)行分析。理想的染色方法滿足：良好的線性范圍，染色強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度成正比好的通用性，不同蛋白質(zhì)具有相同的染色能力高的靈敏度，檢測(cè)出低拷貝蛋白質(zhì)不影響后續(xù)鑒定過程考馬斯亮藍(lán)染色：靈敏度低銀染：影響后續(xù)鑒定，線性范圍窄58F2DDIGE技術(shù)是在傳統(tǒng)雙向凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來

21、的定量分析凝膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的新方法。運(yùn)用不同的熒光染料分別標(biāo)記不同的蛋白質(zhì)，然后將它們等量混合，在單一的2D膠上進(jìn)行分離和鑒定，按照它們所發(fā)出的熒光強(qiáng)度差異，來比較蛋白質(zhì)量的變化。其優(yōu)點(diǎn)是可以在同一塊凝膠上比較兩種不同來源或不同處理的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，能比較精確地在較寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對(duì)研究者感興趣的蛋白質(zhì)定量，因此成為一種有較好應(yīng)用前景的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。59原理將待比較的兩種樣品提取的總蛋白質(zhì)分別與兩種不同的熒光標(biāo)記試劑（Cy3或Cy2，Cy5）進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記；然后將不同熒光染料標(biāo)記的兩種待比較的蛋白質(zhì)樣品等量混合，上樣進(jìn)行雙向電泳；2D凝膠在成像儀上用兩種不同波長(zhǎng)激發(fā)，并將兩種樣品的熒光圖譜顯示成像，用2D軟件進(jìn)行定量分析；將定量顯示有明顯差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下后進(jìn)行鑒定分析，從而確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。60Introduction of 2D-DIGECyDyeTM DIGE