生物化學(xué)的分離純化課件

1、生物分子的分離純化醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 第七章溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖復(fù)合物等）生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。包括小分子（如脂類、激素、維生素等）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5）能人工合成與改造。生物分子是生物所特有的有機(jī)化合物，具有如下主要特征：1）結(jié)構(gòu)復(fù)雜有序、具有特殊的層次；2）行使專一的功能；3）代謝是其存在的條件；4）生物分

2、子體系具有自我復(fù)制的能力；Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、生物大分子的制備 生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（1）分離純化方法千差萬別，沒有一種標(biāo)準(zhǔn)方法可通用于各種生物大分子的分離制備；（2）制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，難以準(zhǔn)確估計(jì)和判斷pH值、溫度度等各種參數(shù)對溶液中各種組份的綜合影響 生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)：Zhejiang Prov

3、incial Key Lab of Medical Genetics生物大分子制備的一般步驟： 確定制備的目的和要求文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法材料的破碎和預(yù)處理分離純化方案的選擇和探索產(chǎn)物純度的鑒定產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。科研、開發(fā)或發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)制備的關(guān)鍵要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰最困難的過程掌握目的產(chǎn)物的理化性質(zhì)特異性強(qiáng)準(zhǔn)確度高靈敏度高使用快捷方便 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間理化性質(zhì)的差異。根據(jù)作用原

4、理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：（1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics影響提取效果的因素（1）pH值 （2）鹽濃度（即離子強(qiáng)度） （3）溫度 （4）水解酶 （5）攪拌與氧化 （6）有機(jī)溶劑 Zhejiang Provincial K

5、ey Lab of Medical Genetics 生物大分子的分離純化 （1）鹽析法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（2）有機(jī)溶劑沉淀法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics二、核酸的分離純化 核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)(包括DNA與RNA)。 無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。 DNA與RNA理化性質(zhì)及細(xì)胞定位上的差異決定了兩者的最適分離與純化條件的不同Zh

6、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分離純化的原則 一是保持核酸堿基序列的完整性。二是盡量清除其它分子的污染，保證核酸制品的純度。 意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics保持核酸的完整性 在整個(gè)操作過程中應(yīng)盡量避免各種有害因素對核酸的破壞。 1）溫度不要過高(04)；(高溫破壞氫鍵) 2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破壞磷酸二酯鍵) 3）保持一定離子強(qiáng)度; 4）減少

7、物理因素對核酸的機(jī)械剪切力.Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸制備的技術(shù)路線Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的濃縮、沉淀與洗滌隨著提取試劑的逐步加入，去除雜質(zhì)時(shí)的丟失，樣品中核酸的濃度會逐步下降，當(dāng)不能滿足后續(xù)研究與診斷所需時(shí)應(yīng)對樣品進(jìn)行濃縮。沉淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法，優(yōu)點(diǎn)： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的鑒定與保

8、存（一）核酸的鑒定1. 濃度鑒定 核酸濃度的測定可通過紫外分光光度法與熒光光度法進(jìn)行。 紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm，這一物理特性。前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25 g/mlZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics熒光光度法：核酸在熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。Zhejiang Provi

9、ncial Key Lab of Medical Genetics 純度鑒定 紫外分光光度法或熒光光度法皆可用于核酸制品的純度鑒定。紫外分光光度法：該法主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280為1.8，純RNA的比值為2.0。比值升高與降低均提示不純。熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。DNA分子較RNA大得多，電泳遷移率低。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(1) 對DNA DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；在-70可保存數(shù)

10、年 長期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2) 對RNA RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。（二）核酸的保存Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics盡管基因組DNA因來源、性質(zhì)以及制備的目的不同，其分離純化的方法不盡相同，但有關(guān)分離純化的原則、主要步驟、主要技術(shù)、主要試劑及其作用原理是一樣的?；蚪MDNA分離純化的一般程序見圖7-4。真核基因組DNA的分離純化Zh

11、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、酚抽提法本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改良，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics裂解液中：EDTA：離子螯合劑，抑制DNase活性，降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性SDS：溶解細(xì)胞膜、核膜，乳化脂質(zhì)、蛋白，并使其變性沉淀，同時(shí)變性DNase無

12、DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白質(zhì)酚：變性沉淀蛋白，抑制DNase活性pH 8.0的Tris溶液保證抽提時(shí)DNA進(jìn)入水相，防止DNA變性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2、 甲酰胺解聚法該法操作步驟少，但耗時(shí)，所得DNA濃度低，適用于制備大片段DNA1987年Kupiec等報(bào)道了甲酰胺（formamide）解聚法，該法的細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶K和

13、有機(jī)溶劑。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3、玻棒纏繞法用該法收集高分子量DNA的沉淀始于20世紀(jì)30年代，現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改進(jìn)而來。本法有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀在細(xì)胞裂解液和乙醇的交界面；二是將DNA沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無水乙醇中轉(zhuǎn)移至pH8.0的TE緩沖液中。該法以鹽酸胍裂解細(xì)胞，制備的DNA片段約有80kb，適用于同時(shí)從不同細(xì)胞或組織標(biāo)本中提取DNAZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics基因組D

14、NA片段的純化純化的原則與要求純化的方法有透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。無論采用何種方法從何種支持介質(zhì)中純化與回收所需要的DNA片段都要注意兩個(gè)原則：一是提高片段的回收率；二要清除回收的DNA樣品中的污染。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics回收率 為提高DNA片段的回收率，可通過提高DNA樣品的上樣量和選擇適宜的方法與材料而實(shí)現(xiàn)。2. 純度 常用的純化方法包括有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法（column chromatography）。柱層析法采用的是陰離子交換層析的原理Zhejiang Provincial Key Lab of

15、 Medical Genetics從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段的方法主要有二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纖維素（cellulose）膜插片電泳法電泳洗脫法（透析袋及非透析袋電泳洗脫法）冷凍擠壓法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。它是將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來。該方法能很好地回收小于1 kb的

16、ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。回收的DNA純度極高，無酶抑制劑，也無對轉(zhuǎn)染細(xì)胞或微注射細(xì)胞有毒的污染物，雖費(fèi)時(shí)但操作簡單，是小片段DNA回收的較好方法。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質(zhì)粒DNA的提取與純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質(zhì)粒DNA的提取與純化的經(jīng)典方法包括： 堿裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等這些方法主要由質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增、質(zhì)粒DNA的釋放、質(zhì)粒DNA的分離純化三個(gè)步驟組成Zhejiang Provincial

17、 Key Lab of Medical Genetics1、堿裂解法在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用強(qiáng)陽離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics盡管堿溶液能破壞DNA中的堿基配對，但CCC質(zhì)粒DNA因纏繞緊密而不易解鏈，只要不在堿性條件下變性太久，當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，CCC質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋。該法操作簡單、重復(fù)性好且成本低，制備的質(zhì)粒純度能滿足DNA測序與PCR等實(shí)驗(yàn)要求，是使用最廣泛的方法Zh

18、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2、SDS裂解法SDS裂解法是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA 由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3、煮沸裂解法該法條件劇烈，只能用于小質(zhì)粒DNA的制備煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮于含Triton

19、 X-100和溶菌酶的緩沖液中，Triton X-100和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時(shí)可破壞DNA鏈的堿基配對，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質(zhì)粒DNA的純化1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的連續(xù)密度梯度，在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。2、聚乙二醇沉淀法 （一種分級沉淀法）3、柱層析

20、法 （樹脂）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsRNA極易被RNase水解，除胞內(nèi)的RNase外，它還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中；RNase分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能使其完全滅活，而且去除變性劑（denaturant）后，RNase的活性又可恢復(fù)。因此，在RNA的制備過程中，排除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵真核細(xì)胞RNA的分離純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 為獲得完整的R

21、NA分子，必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）。蛋白酶K和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉，并聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。此外，在變性液中加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics由Chomczynski和Sacchi 于1987年提

22、出。它以含4mmol/L的(異)硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞，然后在pH4.0的酸性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來制備RNA。 。本法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效及提取的RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，能在3小時(shí)內(nèi)迅速處理多個(gè)標(biāo)本 酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分離總RNAZhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsmRNA的分離純化與序列明確的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在細(xì)胞中含量少，種類多且分子量大小不一。除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外，絕大多

23、數(shù)mRNA在其3末端帶有長短不同的poly（A）尾巴。依據(jù)mRNA的結(jié)構(gòu)特征，利用堿基配對原則，通過oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總RNA制品中分離純化mRNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、oligo（dT）-纖維素柱層析法2、oligo（dT）-纖維素柱離心法3、oligo（dT）-纖維素液相結(jié)合離心法4、磁性球珠分離法 該法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）的互補(bǔ)配對、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分離原理，可對

24、poly（A）+RNA進(jìn)行高效、靈敏及快捷的分離。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5、其它方法Poly(U)-凝膠層析法: 利用 Poly(U)與 Poly(A)的互補(bǔ)配對原理Poly(U)-濾紙法: 將總RNA加到共價(jià)交聯(lián)有Poly(U)的濾紙上,經(jīng)洗滌后加熱洗脫Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics三、蛋白質(zhì)的分離與純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能、新蛋白

25、質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和疾病分子診斷的基礎(chǔ)；分子克隆中，下游的處理和分析鑒定，基因工程產(chǎn)品的制備，也需要蛋白質(zhì)的分離和純化。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo)是增加制品的純度（purity）或比活（specific activity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中靶蛋白的含量或生物學(xué)活性（比活常以活力單位數(shù)/毫克蛋白質(zhì)表示），即從蛋白混合物中設(shè)法去除不要的雜蛋白和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最高值。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)分離純化的一般技術(shù)路線 Zhej

26、iang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分離純化的總體原則 純化蛋白質(zhì)總是希望純度和產(chǎn)率均高，例如純化某種酶，理想的結(jié)果是比活力和總回收率均高，但實(shí)際工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力盡可能高，而犧牲一些回收率，在工業(yè)生產(chǎn)和分子診斷中則正相反。一是保證靶蛋白結(jié)構(gòu)的完整，防止降解和活性蛋白質(zhì)的變性；二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度的要求。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)分離純化的條件蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有生物活性的生物大分子，離開天然的存在體系，其結(jié)構(gòu)與活性變得極不穩(wěn)定

27、，因此從生物材料中提純各種靶蛋白均需要特定的條件。應(yīng)注意各種因素對靶蛋白的影響。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics緩沖液 鹽、金屬離子和螯合劑.3. 還原劑 4. 去垢劑5. 增溶劑 6. 蛋白酶抑制劑（pronase inhibitor）7. 蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 表面效應(yīng)的影響溫度的影響儲存Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化是依據(jù)其溶解性、分子質(zhì)量大小及形狀、電離性質(zhì)和生物學(xué)功能的差異而進(jìn)行的。分離純化的方法可分類如下：以溶解度的差異為依

28、據(jù)的方法：鹽析、分配層析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀和結(jié)晶等；以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等；Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics以電離性質(zhì)差異為依據(jù)的方法：電泳、離子交換層析等；以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics鹽析法：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 等電點(diǎn)沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉

29、淀。該法適用于在等電點(diǎn)pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics凝膠過濾層析(gel filtration)凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。 凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一

30、種方法。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics電 泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 。電泳(elctrophoresis)Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics幾種重要的蛋白質(zhì)電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分 子量的測定。每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)

31、合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF） 通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genet

32、ics 雙向凝膠電泳two-dimensional electrophoresis Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凝膠層析分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高、不會引起變性凝膠介質(zhì)昂貴、處理量有限離子交換層析各組份與離子交換劑親和力不同分辨力高、處理量較大需酸堿處理樹脂、操作耗時(shí)電泳法等電點(diǎn)、分子量、電荷的差異分辨力很高、可連續(xù)制備儀器試劑昂貴鹽析法破壞水化膜和中和表面電荷操作簡便、成本低、重復(fù)性好、對蛋白有保護(hù)作用分辨率差、純化倍數(shù)低、沉淀中混雜鹽分選擇性沉淀等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等沉淀作用選擇性較強(qiáng)、方法簡便、種類較多應(yīng)

33、用范圍較窄有機(jī)溶劑沉淀脫水作用和降低介電常數(shù)操作簡便、分辨較強(qiáng)對蛋白質(zhì)或酶有變性作用親和層析蛋白質(zhì)與配體之間特殊的親和力分辨力很高局限性大高速與超速離心沉降系數(shù)或密度差異操作方便、容量大設(shè)備昂貴制備HPLC凝膠過濾、離子交換、反向色譜等分辯力很高、步驟少，儀器昂貴常用的蛋白質(zhì)分離純化方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的分離純化往往要采取多種方法聯(lián)合使用，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化，逐步地制備高純度或高比活的靶蛋白，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離純化的目標(biāo) Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)樣品的純度鑒定蛋白質(zhì)的純度（purity）一般指是否含有其它雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內(nèi)，一定條件下的相對均一性。目前常用的