化學酶工程專業(yè)知識市公開課獲獎課件

1、酶工程Enzyme Engineering第五章 化學酶工程第1頁第1頁第一節(jié) 酶分子化學修飾第二節(jié) 模擬酶第三節(jié) 抗體酶第四節(jié) 印跡酶第五章 化學酶工程第2頁第2頁第一節(jié) 酶分子化學修飾游離酶缺點：抗原性；穩(wěn)定性差；活性不夠高。第五章 化學酶工程第3頁第3頁廣義：但凡通過化學辦法和手段或是通過化學反應使酶分子結構發(fā)生改變技術或過程，都可稱為酶化學修飾。狹義：酶化學修飾則主要是指在較溫和條件下，以可控方式使酶同一些化學試劑發(fā)生特異反應，從而引起單個氨基酸殘基或其功效基團發(fā)生共價化學改變過程。定義第一節(jié) 酶分子化學修飾第4頁第4頁酶化學修飾目的：人為地改變天然酶一些性質，創(chuàng)造天然酶所不具備一些優(yōu)

2、良特性甚至創(chuàng)造出新特性，擴大酶應用領域。酶化學修飾后改變：改變活性部位構象。提升生物活性。增強酶穩(wěn)定性。減少酶類藥物抗原性。改變酶學性質。第一節(jié) 酶分子化學修飾第5頁第5頁酶化學修飾原理利用化學修飾劑所含有各種基團特性，直接或間接地通過一定活化過程與酶分子某種氨基酸殘基發(fā)生化學反應，從而使酶分子結構發(fā)生改變。被修飾酶。修飾劑選擇。修飾反應條件選擇。第一節(jié) 酶分子化學修飾考慮原因第6頁第6頁 酶分子側鏈基團化學修飾 酶分子表面化學修飾辦法及修飾劑第一節(jié) 酶分子化學修飾第7頁第7頁采用一些可溶性大分子物質通過共價鍵將其連接到酶分子表面，使之在酶表面形成覆蓋層，從而使酶性質發(fā)生改變，以滿足人們需要。

3、慣用大分子修飾劑：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常見修飾辦法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面化學修飾第一節(jié) 酶分子化學修飾第8頁第8頁酶分子側鏈基團化學修飾酶蛋白側鏈主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象改變，從而改變酶特性和功效。第一節(jié) 酶分子化學修飾第9頁第9頁氨基化學修飾 （賴氨酸）乙酸酐2,4,6三硝基苯磺酸第10頁第10頁2,4二硝基氟苯碘乙酸氨基化學修飾 （賴氨酸）酶分子側鏈基團化學修飾第11頁第11頁丹璜酰氯氨基化學修飾 （賴氨酸）酶分子側鏈基團化學修飾第12頁第12頁羧基化學修飾 （

4、谷氨酸、天冬氨酸）碳二亞胺硼氟化三甲烊鹽第13頁第13頁巰基化學修飾 （半胱氨酸）5,5/ - 二硫代 雙（2-硝基苯甲酸）4,4/ - 二硫二吡啶對氯汞苯甲酸第14頁第14頁N - 乙基 馬來酰亞胺2 - 氯汞 - 4 - 硝基苯酚巰基化學修飾 （半胱氨酸）第15頁第15頁組氨酸咪唑基化學修飾碘乙酸焦碳酸二乙酯酶分子側鏈基團化學修飾第16頁第16頁精氨酸胍基化學修飾丁二酮1,2-環(huán)己二酮丁二酮1,2-環(huán)己二酮第17頁第17頁苯乙二醛精氨酸胍基化學修飾酶分子側鏈基團化學修飾第18頁第18頁色氨酸吲哚基化學修飾2 羥基 5 - 硝基芐溴4 - 硝基苯硫氯第19頁第19頁酪氨酸殘基和脂肪族氨基酸殘

5、基羥基化學修飾N-乙酰咪唑酶分子側鏈基團化學修飾第20頁第20頁絲氨酸殘基-二異丙基氟磷酸酯四硝基甲烷酪氨酸殘基和脂肪族氨基酸殘基羥基化學修飾第21頁第21頁甲硫氨酸殘基化學修飾甲硫氨酸亞砜過甲酸碘乙酰胺第22頁第22頁第23頁第23頁采用一些可溶性大分子物質通過共價鍵將其連接到酶分子表面，使之在酶表面形成覆蓋層，從而使酶性質發(fā)生改變，以滿足人們需要。慣用大分子修飾劑：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常見修飾辦法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面化學修飾第一節(jié) 酶分子化學修飾第24頁第24頁聚乙二醇對酶修飾 （單甲氧基聚乙二醇MPEG）MP

6、EG均三嗪類衍生物MPEG1MPEG2第25頁第25頁聚乙二醇對酶修飾 （單甲氧基聚乙二醇MPEG）第26頁第26頁MPEG氨基類衍生物蜂巢型MPEG聚乙二醇對酶修飾 （單甲氧基聚乙二醇MPEG）第一節(jié) 酶分子化學修飾第27頁第27頁右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯對酶修飾右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖鏈上羥基經(jīng)活化后可與酶分子上氨基結合。（右旋糖酐）第28頁第28頁羥基活化-溴化氰法第29頁第29頁羥基活化-高碘酸氧化法第30頁第30頁糖肽對酶修飾異氰酸法戊二醛法第31頁第31頁含有生物活性大分子對酶修飾肝素是一個含硫酸酯黏多糖，由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸構成，平均分子量0左右。肝素增長酶穩(wěn)定性，

7、由于肝素在體內還含有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，極適合用來修飾血栓溶解酶而增長其療效。第32頁第32頁碳二亞胺法第33頁第33頁三氯均嗪法第34頁第34頁蛋白質或其它大分子對酶修飾修飾劑：人血清白蛋白修飾辦法：戊二醛法、羰二亞胺法、活化酯法活化酯法琥珀酸酐第35頁第35頁影響酶化學修飾原因反應時間影響分子量影響pH對化學修飾影響修飾劑與酶用量之比對修飾效果影響溫度影響第一節(jié) 酶分子化學修飾第36頁第36頁修飾酶性質修飾酶穩(wěn)定性得到提升-熱穩(wěn)定性、耐蛋白水解酶穩(wěn)定性。修飾酶抗原性得到減少-PEG和人血清白蛋白效果明顯。修飾酶半衰期得到延長-保持藥用酶體內療效修飾酶最適pH改變-在生理和臨床應用

8、上含有主要意義。修飾酶動力學性質-Vmax沒有改變，有些Km會增大。第一節(jié) 酶分子化學修飾第37頁第37頁概述模擬天然酶（生物酶）結構、特性、作用原理及其在生物體內化學反應過程，人工合成含有分子辨認和催化能力化合物質，稱為模擬酶天然酶缺點：很容易受到各種物理、化學及生物影響而失活。第二節(jié) 模擬酶第38頁第38頁當前模擬酶研究方向：模擬酶金屬輔基。模擬酶活性功效基。模擬酶高分子作用方式。模擬酶與底物作用。模擬酶性狀。第二節(jié) 模擬酶第39頁第39頁酶學基礎：Pauling穩(wěn)定過渡態(tài)理論酶先結合底物，進而選擇性地讓底物穩(wěn)定處于某一特定反應過渡態(tài)，減少反應活化能，從而加速反應速度。模擬酶理論基礎：第二

9、節(jié) 模擬酶第40頁第40頁超分子化學基礎-Pederson、Cram、Lehn提出：超分子形成源于底物和受體結合，這種結合基于非共價鍵互相作用，如靜電作用、氫鍵和范德華力等。模擬酶理論基礎：第二節(jié) 模擬酶第41頁第41頁模擬酶分類主-客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物 分子印跡酶 抗體酶膠束酶模型肽酶半合成酶。依據(jù)模擬酶屬性可分為：第二節(jié) 模擬酶第42頁第42頁環(huán)糊精是直鏈淀粉在芽孢桿菌產(chǎn)生環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成一系列環(huán)狀低聚糖總稱，通常含有612個D-吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精中各葡萄糖單元均以1,4糖苷鍵結合成環(huán)，空間結構呈錐形圓環(huán)。環(huán)糊精外緣親水而內腔疏水，因此能像酶

10、同樣提供一個疏水結合部位。環(huán)糊精模擬酶第二節(jié) 模擬酶第43頁第43頁環(huán)糊精葡萄糖單元數(shù)量不同可分為(6個)，(7個)及(8個)環(huán)糊精三種 ，每個葡萄糖殘基均呈現(xiàn)無扭曲變形椅式構象，葡萄糖單元均以1,4糖苷鍵結合成環(huán)，內有空穴，疏水。外緣親水第44頁第44頁環(huán)糊精模擬酶所含有催化作用（活性）： 水解酶活性 核酸酶活性 轉氨酶活性 橋聯(lián)歡糊精仿酶氧化和水解酶活性 環(huán)糊精模擬酶第二節(jié) 模擬酶第45頁第45頁大環(huán)聚醚按結構可分為：冠醚、穴醚、球醚。冠醚是指含雜原子單環(huán)化合物，穴醚是指含雜原子雙環(huán)化合物，球醚是指含有雜原子球狀大環(huán)醚。大環(huán)聚醚模擬酶活性：水解酶活性肽合成酶活性大環(huán)聚醚及其模擬酶第二節(jié) 模

11、擬酶Lehn第46頁第46頁杯芳烴是由苯酚及其衍生物與甲醛縮合而成，分子上緣由苯環(huán)對位取代基構成，下緣緊密排列著酚羥基，中間是苯環(huán)構成富含電子疏水空腔，其上緣親油，下緣親水，可與中性分子和極性離子等各種物質結合。模擬水解酶活性。杯芳烴及其模擬酶第二節(jié) 模擬酶第47頁第47頁金屬卟啉能夠模擬以金屬離子為輔基或輔酶天然酶。卟啉是含有四個吡咯分子大環(huán)聚合物，主要骨架是卟吩。金屬卟啉分子含有以共軛大電子體系，金屬原子價改變?yōu)榛A氧化還原性質，因而可作為與分子氧相關氧化還原酶模擬酶。金屬卟啉及其模擬酶第二節(jié) 模擬酶第48頁第48頁肽酶是模擬天然酶活性部位，人工合成含有催化活性多肽。環(huán)肽在分子辨認方面更含

12、有優(yōu)勢。肽酶1977年人工合成八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe含有溶菌酶(lysozyme)活性，其活力可達到天然酶50%。第二節(jié) 模擬酶第49頁第49頁抗體酶催化特性含有催化化學反應能力單克隆抗體，稱為抗體酶，又稱為催化性抗體?？贵w酶理論基礎及研究背景酶催化機制：過渡態(tài)理論。（1946，Pauling）免疫誘導產(chǎn)生底物過渡態(tài)抗體，抗體含有催化性能（1969，Jencks）單克隆抗體技術發(fā)展。（1975，Kohler, Milstein）第一個催化酯水解抗體酶。（1986，Lerner, Schultz）第三節(jié) 抗體酶第50頁第50頁抗體酶特點能催化一些天然酶

13、不能催化反應有更高專一性和穩(wěn)定性催化作用機制不同。抗體酶和非催化抗體作用比較反應特異性反應可逆性反應量效關系反應過程。第三節(jié) 抗體酶第51頁第51頁抗體酶催化作用機制過渡態(tài)理論抗體酶催化反應類型轉?；磻姿狨ニ夥磻撬狨ラ]環(huán)反應Claisen重排反應脫羧反應金屬螯合反應第三節(jié) 抗體酶第52頁第52頁抗體酶制備原則利用某一反應過渡態(tài)類似物作為免疫原，則可誘導得到催化該反應抗體酶。過渡態(tài)類似物結構穩(wěn)定，可化學合成。當前制備抗體酶主要環(huán)節(jié)：依據(jù)催化目的，通過化學反應合成模型化合物（過渡態(tài)類似物），并與載體蛋白偶聯(lián)成人工抗原，制備含有催化活性單克隆抗體?？乖O計是制備抗體酶關鍵。策略：利用抗體穩(wěn)定

14、帶電過渡態(tài)抗體作為熵阱抗體靜電互補效應第三節(jié) 抗體酶第53頁第53頁當前制備抗體酶主要辦法：依據(jù)催化目的，通過化學反應合成模型化合物（過渡態(tài)類似物），并與載體蛋白偶聯(lián)成人工抗原，制備含有催化活性單克隆抗體?？截惙ɑ瘜W誘變法。蛋白質工程技術。相同分子誘導法。共價抗原免疫法?？贵w酶制備辦法第三節(jié) 抗體酶第54頁第54頁利用過渡態(tài)類似物制備抗體酶抗體酶制備辦法第三節(jié) 抗體酶第55頁第55頁使不也許發(fā)生化學反應稱為也許。使苛刻條件下化學反應在溫和條件下實現(xiàn)。選擇性催化平行反應中某一反應。制備蛋白質氨基酸序列快速分析抗體酶。制備水解病毒蛋白抗體酶。指導未知酶尋找。為化學反應機理研究提供依據(jù)?？贵w酶應用前

15、景第三節(jié) 抗體酶第56頁第56頁分子印跡原理以一個分子作為模板，在其周圍用聚合物交聯(lián)，當除去該分子時，聚合物中間留下與該分子形狀相同空穴，這種空穴就有也許對該分子含有選擇性辨認結合能力 。該化合物分子叫印跡分子，也叫模板分子。聚合物稱為分子印跡聚合物。制備對某一化合物分子含有選擇性辨認結合聚合物過程稱為分子印跡（技術）第四節(jié) 印跡酶第57頁第57頁分子印跡原理第四節(jié) 印跡酶第58頁第58頁選定印跡分子和功效性單體，使兩者發(fā)生互補反應；在印跡分子功效性單體復合物周圍發(fā)生交聯(lián)聚合；用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。分子印跡技術普通過程：第四節(jié) 印跡酶第59頁第59頁分子印跡技術分類預組織法又稱共價法

16、。印跡分子先通過共價鍵與功效性單體結合，聚合后再將共價鍵斷裂除去印跡分子。功效單體：含有乙烯基硼酸、醛、胺、酚、醇等。共價化合物：硼酸酯、亞胺、希夫堿、縮醛酮等。特點：結合基團定位準確，對印跡分子選擇性高；共價鍵結合較牢固，對印跡分子辨認和解離較慢。第四節(jié) 印跡酶第60頁第60頁又稱非共價法。印跡分子與功效性單體自組織排列，以非共價鍵自發(fā)形成含有多個作用位點復合物。功效單體：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基苯甲酸、苯乙酸、咪唑和吡啶類化合物。甲基丙烯酸特點：操作簡樸易行，印跡分子易除去，分子辨認過程更靠近天然分子辨認系統(tǒng)，可同時采用各種功效單體，增長印跡效果；功效單體過量，選擇性下降。分子印跡技術

17、分類自組裝法第四節(jié) 印跡酶第61頁第61頁聚合時，印跡分子與功效基團共價結合。辨認時，印跡分子與功效基團非共價結合。金屬離子配位辦法印跡分子-金屬離子-功效單體三維復合物進行交聯(lián)聚合。金屬配位作用強度可通過EDTA簡樸變換金屬離子種類實現(xiàn)對印跡分子聚合物親和能力靈活調整。分子印跡技術分類自組裝和預組織相結合辦法第四節(jié) 印跡酶第62頁第62頁分子印跡聚合物制備功效性單體：羧酸類化合物（甲基丙烯酸、丙烯酸、乙烯基苯甲酸）、磺酸及雜環(huán)弱堿類（乙烯基吡啶、乙烯基咪唑），最慣用體系為聚丙烯酸和聚丙烯酰胺體系。交聯(lián)劑：丙烯酸類交聯(lián)劑（二亞乙基丙烯酸）溶劑：溶劑極性越大，產(chǎn)生辨認效果越弱（甲苯，二氯甲烷）低溫聚合：可提升分子印跡聚合物分辨力。分子印跡聚合物形態(tài)：快、珠、薄膜、表面印跡、固定容器內就地聚合。第四節(jié) 印跡酶第63頁第63頁分子印跡酶含有催化能力（作用）