溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的分離及其分類鑒定

1、溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的別離及其分類鑒定【摘要】目的對(duì)溫莪術(shù)不同部位內(nèi)生真菌進(jìn)別離和分類鑒定。方法采用內(nèi)生菌常規(guī)別離法對(duì)安康溫莪術(shù)根、莖和葉的內(nèi)生真菌進(jìn)展了別離和鑒定。結(jié)果從溫莪術(shù)中別離得到了99株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為21屬，其中根部42株涉及11屬，莖部12株涉及4屬，葉部45株涉及12屬。結(jié)論溫莪術(shù)的不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量、分布和種群存在差異?！娟P(guān)鍵詞】內(nèi)生真菌；別離；鑒定；溫莪術(shù)IslatinandIdentifiatinfEndphytiFungifruruaaratiaSalisbAbstrat：bjetiveTislateandidentifytheendphytifungifdiffere

2、ntpsitinsinuruaaratiaSalisb.ethdsEndphytifungiereislatedfrhealthyrts,stesandleavesfuruaaratialSalisbandidentifiedithnventinalethd.ResultsNinty-ninestrainsfendphytifungibelngt21genusereislatedandrhplgiallyidentifiedfruruaaratiaSalisb.Frty-tstrainsf11generaereislatedinrts,12strainsf4generainstes,and45

3、strainsf12generainleaves.nlusinThequantity,ppulatinanddistributinftheendphytifungiarevariusindifferentpsitinfuruaaratiaSalisb.Keyrds：Endphytifungi；Islatin；Identifiatin；uruaaratiaSalisb植物內(nèi)生真菌(EndphytiFungi)是存在于安康植物組織、器官內(nèi)，并不引起明顯病害病癥的一類真菌1。植物與真菌的共生現(xiàn)象在生物進(jìn)化過程中歷史悠久而又極其普遍。雖然人們很早就知道內(nèi)生真菌的存在，但直到1977年才對(duì)其重要性有所認(rèn)

4、識(shí)2。通過二十多年的研究，人們發(fā)現(xiàn)，作為地球上一類古老而又普遍的共生生物，植物內(nèi)生真菌不僅可以提供人類豐富的藥用性次生代謝產(chǎn)物3，而且有可能從整體上參與和協(xié)調(diào)植物與環(huán)境因子(包括病原微生物)的互作過程，從而對(duì)植物的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性產(chǎn)生積極的影響4。溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金uruaenyujinY.H.henet.Ling的枯燥根莖,其味辛、苦,性溫。具有行氣破血、消積止痛的作用5。含有莪術(shù)油、姜黃素、多糖、木脂素類、脂肪酸類及微量元素等多種不同生物活性的化學(xué)成分6?，F(xiàn)代藥理研究說明,溫莪術(shù)具有抗腫瘤、抗血栓、抗菌、抗病毒等作用,對(duì)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病和皮膚潰瘍都有較好

5、的療效7。由此，人們對(duì)它的關(guān)注也由來已久。但至今對(duì)溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的研究報(bào)道還很少，假如能在溫莪術(shù)內(nèi)生真菌中可以發(fā)現(xiàn)類似的活性物質(zhì)，無疑找到了一種可替代溫莪術(shù)植物的新型生物資源，為此本實(shí)驗(yàn)對(duì)溫莪術(shù)內(nèi)生真菌進(jìn)展了系統(tǒng)的研究。現(xiàn)將溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的別離鑒定結(jié)果及種群分布報(bào)道如下。1材料1.1材料別離所用植物材料為溫莪術(shù)根、莖、葉，采自溫州醫(yī)學(xué)院莪術(shù)種植基地不同生長時(shí)期的溫莪術(shù)，無病蟲害。1.2培養(yǎng)基內(nèi)生真菌別離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000l)和A抗生素培養(yǎng)基(瓊脂20g，氨芐青霉素200g，鏈霉素200g，水1000l)；純化鑒定培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和查氏

6、培養(yǎng)基蔗糖30g，NaN32g，Kl0.5g，gS47H20.5g，F(xiàn)eS40.01g，K2HP41g，瓊脂1520g，水1000l。2方法2.1內(nèi)生真菌的別離取溫莪術(shù)的根、莖、葉，用刀切成23的小塊，按以下步驟進(jìn)展外表消毒：自來水沖洗干凈，75%的酒精漂洗12in，無菌水沖洗3in，0.1%的升汞漂洗1020s，無菌水沖洗45次。上述處理過的樣品，在無菌狀態(tài)下切割成約0.50.5的小塊(片),分別置于已倒好的A抗生素平板培養(yǎng)基和PDA平板培養(yǎng)基上，放置在28條件下。2.2內(nèi)生真菌的純化接種物培養(yǎng)37d后，觀察皿中材料切口處長出菌絲(菌落)，挑取切口處菌絲尖端轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，待長成菌落

7、后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異及長出時(shí)間的不同，分別挑取其邊緣的菌絲進(jìn)展別離培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應(yīng)記錄。采用菌絲頂端純化法如此反復(fù)純化后，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基上，于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)57d后，對(duì)菌株進(jìn)展編號(hào)，并放入4冰箱保存。2.3菌種的鑒定采用直接挑取制片法和插片培養(yǎng)法，觀測(cè)菌種在培養(yǎng)過程中菌絲、個(gè)體發(fā)育、產(chǎn)孢構(gòu)造和孢子形態(tài)等特征，對(duì)別離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)展顯微形態(tài)觀察、分類鑒定811。3結(jié)果3.1別離方法的比擬本實(shí)驗(yàn)過程中嘗試了組織研磨涂平板和組織切片別離兩種方法。結(jié)果說明研磨法的優(yōu)點(diǎn)是能獲得較多菌株，但外表消毒驗(yàn)證效果不佳，且菌株不易純化；而組織切片培養(yǎng)的方法操作

8、簡單，外表消毒驗(yàn)證效果可靠，菌株易純化。為此本研究最終選擇了外表消毒后組織別離培養(yǎng)的方法。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.2溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的別離及分類鑒定結(jié)果從溫莪術(shù)根、莖、葉組織別離中,共獲得內(nèi)生真菌99株。結(jié)果見表1。表1溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的別離鑒定結(jié)果略從表1可看出，植物組織的部位不同,別離獲得的內(nèi)生真菌種類不同。從分布上來看，99株內(nèi)生真菌中，根局部布42株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的42%，11個(gè)屬，占21個(gè)屬的52%；莖局部布12株0內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的12%，4個(gè)屬，占21個(gè)屬的19%；葉局部布45株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的45%，12個(gè)屬，占21個(gè)屬的57%。由此可見，溫莪術(shù)內(nèi)生真菌主要存在于

9、植株的根和葉中，莖部相對(duì)較少。3.3溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的種群組成從溫莪術(shù)不同組織中別離得到的99株內(nèi)生真菌，經(jīng)顯微形態(tài)觀察，初步鑒定為5目、6科、21屬，另外，還有9株不產(chǎn)孢，為無孢菌群見表2。表2溫莪術(shù)內(nèi)生真菌的種群組成略由表2可知，溫莪術(shù)內(nèi)生真菌以鐮孢霉屬為優(yōu)勢(shì)種群，約占總數(shù)的13%；其次為曲霉屬和青霉屬，約占總數(shù)的10%；此外，無孢菌群在其內(nèi)生真菌中也占有較大的比例。從表中可見溫莪術(shù)內(nèi)生真菌最明顯的特征是在種類組成上具有多樣性。4討論在內(nèi)生菌的別離過程中，進(jìn)展外表消毒時(shí),0.1%升汞的漂洗時(shí)間不能長,尤其是對(duì)于幼嫩的葉片消毒時(shí)間要比根莖更短,否那么別離到的菌落少,甚至?xí)褍?nèi)生菌全部殺死。所別

10、離的真菌在查氏培養(yǎng)基上一般生長較緩慢,在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)上生長較快,許多真菌在PDA上有色素產(chǎn)生,而在查氏培養(yǎng)基上無色素產(chǎn)生。PDA營養(yǎng)比擬齊全,所以培養(yǎng)效果好,生長快,這主要是營養(yǎng)條件決定的,因此，我們培養(yǎng)真菌一般用營養(yǎng)條件好的PDA,而在鑒定時(shí)一般用查氏培養(yǎng)基,因查氏培養(yǎng)基成分清楚,干擾小,在其上生長時(shí)真菌的各種鑒定的特性更易顯現(xiàn)出來。從溫莪術(shù)根、根狀莖、莖、葉等部位別離到99株內(nèi)生真菌,說明該植物體內(nèi)伴生微生物的多樣性比擬豐富,植物內(nèi)生真菌一方面表現(xiàn)出能與植物互相協(xié)調(diào)生活與植物形成共生關(guān)系,另一方面有些真菌也為植物病原菌,平時(shí)不引起植物發(fā)病,但它們對(duì)于無病癥寄主而言仍存在一定

11、威脅性,不同的微生物能互相作用,并建立一種平衡,在植物體內(nèi)形成一種相對(duì)穩(wěn)定的真菌菌群,其中一些是別離頻率高,數(shù)量大的優(yōu)勢(shì)菌種,而另一些屬于稀有菌種。通過對(duì)溫莪術(shù)不同部位的內(nèi)生真菌的別離,發(fā)現(xiàn)植物組織和部位不同,別離獲得的內(nèi)生真菌種類不同。溫莪術(shù)不同組織別離內(nèi)生真菌的頻率順序?yàn)槿~片根莖,說明內(nèi)生真菌在溫莪術(shù)不同部位的分布不同。研究結(jié)果說明,對(duì)于別離率較高的鐮孢霉屬和曲霉屬在根莖葉中都可以別離出，顯示它們可以系統(tǒng)性分布于宿主中，而頂毛單胞霉屬和星刺殼孢屬僅分布在莖部，其余各屬均分布在根和葉部。這一結(jié)果說明一些內(nèi)生真菌可能具有一定的組織專一性。植物內(nèi)生真菌和其宿主之間存在復(fù)雜的生物化學(xué)互相作用,植物

12、形成的某些次生代謝產(chǎn)物可能就是內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化宿主組織中的前體物質(zhì)所形成,本研究為進(jìn)一步討論植物與內(nèi)生真菌的互相關(guān)系提供了重要的資料。【參考文獻(xiàn)】1尹建雯，陳有為，李治瀅，等.蘆薈植物內(nèi)生真菌的研究抗菌活性初探J.微生物學(xué)雜志，2022，24(2)：30.2陳暉奇，徐焰平，謝麗華,等.茶樹內(nèi)生真菌的別離及其在寄主組織中的分布特征J.萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2022，23(4)：250.3鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生真菌研究新進(jìn)展J.植物學(xué)報(bào)，2001，43(9)：881.4RdriguezRJ,RedanRSandHensnJTherleffungalsybisesintheadaptatinfplantsthighstressenvirnentsJ.itigatinandAdaptatinStrategiesfrGlbalhange，2022，9：2615國家藥典委員會(huì)中國藥典,部S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2022：194.6胡潤淮,邵清松.溫郁金化學(xué)成分研究進(jìn)展J.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2022，187：1773.7李國棟，許付，沈愛軍.莪