支鏈淀粉直連淀粉

1、直鏈淀粉和支鏈淀粉的測(cè)定（雙波長(zhǎng)法）一、目的 淀粉一般都是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物。直鏈淀粉和支鏈淀粉含量和比例因植物種類而 不同，決定著谷物種子的出飯率和食味品質(zhì)，并影響著谷物的貯藏加工。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)掌 握雙波長(zhǎng)測(cè)定谷物中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。二、原理 根據(jù)雙波長(zhǎng)比色原理，如果溶液中某溶質(zhì)在兩個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，則兩個(gè)波長(zhǎng)的吸收差值與 溶質(zhì)濃度成正比。直鏈淀粉與碘作用產(chǎn)生純藍(lán)色，支鏈淀粉與碘作用生成紫紅色。如果用兩種淀粉的標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別與碘反應(yīng)，然后在同一個(gè)坐標(biāo)系里進(jìn)行掃描（400 - 960 mm）或做吸收曲線，可以得到圖所示結(jié)果。圖作圖法選擇淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)圖作圖法選擇淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)

2、圖中1為直鏈淀粉的吸收曲線，2為支鏈淀粉的吸收曲線。對(duì)含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的 未知樣品，與碘顯色后，只要在選定的波艮1，入2，入3，入4，處作4次比色， 利用直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線即可分別求出樣品中兩類淀粉的含量。三、儀器、試劑和材料儀器（1）電子分析天平（2）索氏脂肪抽提器1套（3）分光光度計(jì)1臺(tái)（4 ） pH 計(jì)(5 )容量瓶 100ml X 2 ,50ml X 16(6 )吸管 0.5ml X 1, 2ml X 1, 5ml X 1試劑(1)乙醚或石油醚(沸程30-60 C)(2 )無(wú)水乙醇(3 ) 0.5 ml / L KOH 溶液(4 ) 0.1 mol / L HCl 溶液

3、碘試劑：稱取碘化鉀2.0g,溶于少量蒸餾水，再加碘0.2g,待溶解后用蒸餾水稀 釋定容至l00ml.直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：稱取直鏈淀粉純品0.1000g,放在100ml容量瓶中，加入0.5mol/ L KOH 10ml,在熱水中待溶解后，取出加蒸餾水定容至100ml,即為1mg/ml直鏈淀粉 標(biāo)準(zhǔn)溶液。 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：用0.1000g支鏈淀粉按(6)法制備成1mg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶 液。材料供試谷物粉。四、操作步驟.選擇直鏈、支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)。直鏈淀粉：取1mg/ml直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液1ml,放入50ml容量瓶中，加蒸餾水30ml,以 0.1 mol/ L HCl溶液調(diào)至pH 3.5左右，

4、加入碘試劑0.5ml,并以蒸餾水定容。靜置20min , 以蒸餾水為空白，用雙光束分光光度計(jì)進(jìn)行可見(jiàn)光全波段掃描或用普通比色法繪出直鏈淀粉 吸收曲線。支鏈淀粉：取1 mg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液1ml,放入50ml容量瓶中，以下操作同直鏈淀粉。 在同一坐標(biāo)內(nèi)獲得支鏈淀粉可見(jiàn)光波段吸收曲線。根據(jù)原理部分介紹的方法，確定直鏈淀粉和支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng) 2、入1、 入4和入3。,制作雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取1mg/ml直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3、0.5、0.7、 0.9、1.1、1.3 ml分別放入6只不同的50ml容量瓶中，加入蒸餾水30ml ,以0.1 mol/ L HCl溶液調(diào)至pH 3.

5、5左右，加入碘試劑0.5 ml,并用蒸餾水定容。靜置20min,以蒸 餾水為空白，用1cm比色杯在入1、入2兩波長(zhǎng)下分別測(cè)定A入1, A入2即得 A 直=A入1 - A入2以 A直為縱坐標(biāo)，直鏈淀粉含量(mg )為橫坐標(biāo)，制備雙波長(zhǎng) 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。.制作雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取1mg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0, 2.5、3.0、3.5、 4.0、4.5分別放入6只不同的50ml容量瓶中。以下操作同直鏈淀粉。以蒸餾水為空白， 用1cm比色杯在入3，入4兩波長(zhǎng)下分別測(cè)定其A入3, A入4即得 A支=A入4- A入3。以左A支為縱坐標(biāo)，支鏈淀粉含量（mg ）為橫坐標(biāo)，制備雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)

6、準(zhǔn)曲線。樣品中一直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉的測(cè)定：樣品粉碎過(guò)60目篩，用乙醚脫脂，稱 取脫脂樣品0.1g左右（精確至1mg），置于50ml容量瓶中。加0.5 mol/ L KOH溶液 10ml，在沸水浴中加熱10min，取出，以蒸餾水定容至50ml若有泡沫采用乙醇消除）， 靜置。吸取樣品液 2.5ml兩份（即樣品測(cè)定液和空白液），均加蒸餾水30ml，以 0.1mol/LHCI溶液調(diào)至pH 3.5左右，樣品中加入碘試劑0.5ml，空白液不加碘試劑，然后 均定容至50ml。靜置20min，以樣品空白液為對(duì)照，用1cm比色杯，分別測(cè)定入2，入1，入4，入3的吸收值A(chǔ)入2， A入1， A入4， A入3

7、。得到 A直=A入2 - A入1， A支=A入4-A入3。分別查兩類淀粉的雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算 出脫脂樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。二者之和等于總淀粉含量。五、結(jié)果處理直鏈淀粉場(chǎng)、=2.5 X，m X 1000支鏈淀粉（%）=式中，X1 一查雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中直鏈淀粉含量（mg）X2 一查雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中支鏈淀粉含量（mg）m 一樣品質(zhì)量 （g）總淀粉（%）=直鏈淀粉（）+支鏈淀粉（）六、注意事項(xiàng)因蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)支鏈淀粉碘復(fù)合物顏色差異較大，在制備雙波長(zhǎng)支鏈淀粉曲線時(shí)，應(yīng)根據(jù)測(cè) 定的谷物類型選擇不同支鏈淀粉純品（蠟質(zhì)或非蠟質(zhì)型）。七、思考題雙波長(zhǎng)法測(cè)定谷物中直鏈

8、、支鏈淀粉的原理是什么？除了雙波長(zhǎng)法外，比色法（620nm）和安培滴定法也能分別測(cè)定直鏈和支鏈淀粉。了解 其原理，比較不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)。直鏈淀粉，支鏈淀粉測(cè)定試劑盒(doc 11)的資料簡(jiǎn)介：淀粉測(cè)定試劑盒用于測(cè)定淀粉中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量AMYL 11/99簡(jiǎn)介：決定谷物淀粉最終的特殊用途取決于淀粉眾多特性中的直鏈淀粉/支鏈淀粉比 率，因此，對(duì)于淀粉加工企業(yè)，淀粉中直鏈淀粉含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)。測(cè)定谷物淀粉中的直鏈淀粉通常采用電位測(cè)定法、糊化染色法或旋光分析法，即 通過(guò)測(cè)定碘與直鏈淀粉結(jié)合生成直鏈淀粉-碘復(fù)合物的方法來(lái)評(píng)估直鏈淀粉含 量，然而由于支鏈淀粉-碘復(fù)合物在此過(guò)程中同樣會(huì)形成

9、，因此這些方法的準(zhǔn)確 性常遭到質(zhì)疑。利用非比色方法測(cè)定游離碘離子的減少和通過(guò)比色測(cè)定直鏈淀粉 -碘復(fù)合物的方法會(huì)導(dǎo)致高估直鏈淀粉的含量，是用此方法可能出現(xiàn)的更多問(wèn)題 請(qǐng)參考 Gibson et alll。目前，國(guó)際上普遍采用結(jié)果更加準(zhǔn)確的利用伴刀豆凝集素A(Con A)沉降支鏈淀 粉，然后測(cè)定直鏈淀粉含量的方法，在特定的溫度、pH和離子強(qiáng)度下，Con A 可以特定的連接含毗喃葡萄糖基a-D-glucosepyranosyl或毗喃甘露基 a-D-mannopyranosyl的支鏈多聚糖，因此會(huì)優(yōu)先于直鏈淀粉與支鏈淀粉形成沉 淀復(fù)合物。原理：加入二甲基亞砜(DMSO)的淀粉樣品通過(guò)加熱被完全溶解，

10、乙醇洗脫樣品中的油 脂，回收洗滌后的淀粉樣品，并用醋酸/鈉鹽溶液溶解，加入Con A后支鏈淀粉 被特異性的沉降，離心分離支鏈淀粉，保存于懸浮液中的直鏈淀粉被酶水解生成 葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶測(cè)定葡萄糖的含量。溶解于醋酸/鈉鹽溶 液中的總淀粉同樣可以被水解成葡萄糖，并利用萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶測(cè)定葡 萄糖。在510nm測(cè)定利用Con A沉降后懸浮液中GOPOD吸光度的比率變化來(lái)計(jì)算 直鏈淀粉的濃度，同樣道理可計(jì)算出總淀粉濃度。此方法適用于所有的純凈淀粉樣品和谷物面粉。精確性：對(duì)于純凈淀粉和10%的谷物面粉，批內(nèi)偏差5%試劑盒：試劑盒內(nèi)提供有足夠50-100次試驗(yàn)用的試劑分析方法凍干

11、 Con A (200mg)淀粉葡萄糖苷酶/真菌a-淀粉酶懸浮液葡萄糖測(cè)定液葡萄糖反應(yīng)緩沖液葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液淀粉參考標(biāo)樣(含有特定的直鏈淀粉)安全手冊(cè)：1.水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測(cè)定法GB 7648871適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉含量的測(cè)定。2參考標(biāo)準(zhǔn)GB 500685谷物籽粒粗淀粉測(cè)定法GB 352383谷類、油料作物種子水分測(cè)定法3測(cè)定原理淀粉與碘形成碘-淀粉復(fù)合物，并具有特殊的顏色反應(yīng)。支鏈淀粉與碘生成 棕紅色復(fù)合物，直鏈淀粉與碘生成深藍(lán)色復(fù)合物。在淀粉總量不變條件下，將這 兩種淀粉分散液按不同比例混合，在一定的波長(zhǎng)和酸度條件下與碘作用，生成由 紫紅到深藍(lán)一系列顏

12、色，代表其不同直鏈淀粉與支鏈淀粉含量比例，根據(jù)吸光度 與直鏈淀粉濃度呈線性關(guān)系，可用分光光度計(jì)測(cè)定。4儀器、設(shè)備4.1粉碎機(jī)(實(shí)驗(yàn)室用旋風(fēng)磨)。4.2分光光度計(jì)：721型或具有相同性能的其他型號(hào)。4.3分析天平：感量0.0001g。4.4玻璃儀器：50ml具塞刻度試管，100ml容量瓶。5試劑配制除注明者外均為分析純，水為蒸餾水。5.1氫氧化鈉(GB 62981)，1molL-i、0.09molL-i水溶液，準(zhǔn)確標(biāo)定。5.2冰乙酸(GB 67678)，1molL-1水溶液，準(zhǔn)確標(biāo)定。5.3碘貯備溶液及碘試劑：稱2g碘和20g碘化鉀(GB 127277)用蒸餾水溶 解并稀釋至100ml，即為碘貯

13、備液。取10ml碘貯備液稀釋至100ml，即為碘試劑。5.4馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液：1mg/ml,取烘干（5556C真空干燥）的馬鈴 薯直鏈淀粉純品，稱取重量相當(dāng)于含0.1000g淀粉，放入100ml容量瓶中，加入 1ml無(wú)水乙醇濕潤(rùn)樣品，再加9ml1molL-i氫氧化鈉溶液，于沸水浴分散10min, 迅速冷卻后，用水定容。5.5支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液：1mg/ml，選擇與待測(cè)谷物樣品相應(yīng)的蠟質(zhì)谷物標(biāo)準(zhǔn)品， 稱取重量相當(dāng)于含0.1000g粗淀粉，放入100ml容量瓶中，加1ml無(wú)水乙醇，再加9ml1molL-1氫 氧化鈉溶液，于沸水浴加熱10min，迅速冷卻后，用水定容。5.6 石油醚（HG 310

14、0376），沸程 6090C。6樣品的選取和制備6.1將樣品挑選干凈（谷子脫殼、稻谷制成精米），按四分法取樣20g。6.2用粉碎機(jī)將樣品粉碎，全部通過(guò)0.177mm孔徑篩（80號(hào)），混勻裝入磨 口瓶備用。7測(cè)定步驟7.1混合校準(zhǔn)曲線繪制取6個(gè)100ml容量瓶，分別加入1mg/ml馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.25、 0.50、1.00、1.50、2.00ml，再依次加入1mg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液5、4.75、 4.50、4.00、3.50、3.00ml，總量為 5ml。另取 1 個(gè) 100ml 容量瓶，加入 0.09molL-1 氫氧化鈉溶液5ml作空白。然后于各瓶中依次加入約50ml水、1

15、ml1molL-1乙 酸及1ml碘試劑。用水定容后顯色10min，在620nm處讀取吸光度。以直鏈淀粉毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線或建立回歸方 程。7.2樣品測(cè)定7.2.1按GB 500685谷物籽粒粗淀粉測(cè)定法和GB 352383谷類、油 料作物種子水分測(cè)定法測(cè)定樣品的粗淀粉含量和水分。7.2.2樣品分散：稱取相當(dāng)于0.1000g粗淀粉的樣品（如按樣品干重計(jì)算直鏈 淀粉百分含量時(shí)，稱取樣品100mg）于100ml容量瓶中，加1ml無(wú)水乙醇，充分 濕潤(rùn)樣品，再加入9ml1molL-1氫氧化鈉溶液，于沸水浴中分散10min，迅速冷 卻，用水定容。7.2.3脫脂：取20ml分散液于

16、50ml具塞刻度試管中，加入710ml石油醚， 間歇搖動(dòng)10min，靜止15min，分層后用連接在水泵上的吸管抽吸，吸去上部石 油醚層。重復(fù)以上操作23次（精米脫脂二次，玉米、谷子須脫脂三次）。7.2.4測(cè)定：吸取脫脂后的堿分散液5.00ml于100ml容量瓶中，加水50ml, 再加入1molL-i乙酸溶液1ml及碘試劑1ml，用水定容。顯色10min后，在620nm 處讀取吸光度。注：測(cè)定樣品與繪制校準(zhǔn)曲線時(shí)的溫度相差不能超過(guò)土 1C。8結(jié)果計(jì)算8.1計(jì)算公式直鏈淀粉（，占淀粉總量）按式（1）計(jì)算：直鏈淀粉（，占淀粉總量）=（GX100/（m1X5）X1001-（1）直鏈淀粉（，占樣品干重）

17、按式（2）計(jì)算：直鏈淀粉（，占樣品干重）二GX100/m2X5X（1-H）X1002 （2）式中：G從相應(yīng)的混合校準(zhǔn)曲線或回歸方程求出的直鏈淀粉質(zhì)量，mg；m1稱取樣品中所含粗淀粉的質(zhì)量，100mg；m2稱取樣品的質(zhì)量，100mg；H水分百分率。8.2結(jié)果表示兩個(gè)平行測(cè)定的結(jié)果，用算術(shù)平均值表示。保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。第三位數(shù)的 舍入見(jiàn)GB 1.181標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則編寫標(biāo)準(zhǔn)的一般規(guī)定附錄C。8.3結(jié)果的允許誤差兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)誤差，不得超過(guò)2%。附錄A馬鈴薯直鏈淀粉純品制備方法（參考件）A.1儀器、設(shè)備A.1.1 離心機(jī)（4000r/min）。A.1.2電動(dòng)攪拌器。A.1.3冰箱。A.1.4真

18、空干燥箱。A.1.5磁力攪拌器。A.1.6 232型甘汞電極或具有相同性能的其他型號(hào)。A.1.7 213型鉑電極或具有相同性能的其他型號(hào)。A.1.8 01.000V 毫伏表。A.2試劑除注明者外，均為分析純，水為蒸餾水。A.2.1 氫氧化鈉（GB 62981）,0.5molL-1 水溶液。A.2.2 鹽酸（GB 62277）,1molL-1、1.5molL-1、2molL-1 水溶液。A.2.3 正丁醇（皿 3101276）。A.2.4 異戊醇（HG 399676）。A.2.5碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.1784g碘酸鉀（GB 65177，優(yōu)級(jí)純）用水溶 解后，轉(zhuǎn)入1000ml容量瓶中用水定容，即

19、8.34X10-4molL-1。A.2.6碘化鉀溶液：稱取66.40g碘化鉀（GB 127277）用水稀釋至1000ml， 即 0.4molL-1。A.3制備方法稱取馬鈴薯淀粉10g，加少量無(wú)水乙醇使樣品濕潤(rùn)，再加入350ml0.5molL-1 氫氧化鈉，放入沸水浴中加熱攪拌20min至完全分散，冷卻，以4000r/min離 心20min，取上清液用1.5molL-1鹽酸調(diào)至pH6.5 （用pH精密試紙），然后加 入1 ：1（V/V） 丁醇-異戊醇80ml，在沸水浴中加熱攪拌10min，冷卻至室溫。 移入冰箱內(nèi)（24C ）靜置24h去掉上層污物層，以4000r/min離心15min，棄 掉上清

20、液，沉淀物即為粗直鏈淀粉。用飽和正丁醇水溶液洗滌沉淀物（粗直鏈淀粉），4000r/min離心15min， 將沉淀物轉(zhuǎn)入200ml飽和正丁醇水溶液中，在沸水浴中加熱溶解（1015min）， 冷卻至室溫，放入冰箱內(nèi)（24C） 24h，棄去上層污物層，以4000r/min離心 15min，沉淀物再加200ml飽和正丁醇水溶液加熱溶解，反復(fù)純化三次。最后沉 淀物用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌 離心34次，在真空干燥箱中（5556C）干燥。即 得直鏈淀粉純品。A.4純品質(zhì)量鑒定A.4. 1淀粉含量測(cè)定稱0.1000g純品加入10ml0.5mol-L-i氫氧化鈉在沸水浴中加熱分散，再加 入21.5ml2molL-i鹽

21、酸，在沸水浴回流水解2h，用費(fèi)林氏液法（GB 551385 糧食、油料檢驗(yàn)還原糖和非還原糖測(cè)定法）測(cè)定還原糖，乘以0.9即得淀 粉量，計(jì)算純品含量。A.4.2碘-淀粉復(fù)合物吸收光譜測(cè)定取5.4溶液2ml （1mg/ml直鏈淀粉）及0.09mol L-1氫氧化鈉溶液3ml加 50ml水稀釋后，再加入1molL-1乙酸溶液1ml和碘試劑1ml，用水定容至100ml， 顯色10min，于分光光度計(jì)測(cè)定500800nm的吸收譜。A.4.3碘結(jié)合量測(cè)定A.4.3.1 測(cè)定稱取重量相當(dāng)于含0.1000g淀粉的烘干馬鈴薯直鏈淀粉純品于100ml容量 瓶中，加幾滴無(wú)水乙醇濕潤(rùn)后再加入0.5molL-1氫氧化鈉溶液10ml，置沸水浴 完全分散，冷卻、加水定容。吸5ml （含直鏈淀粉5mg）分散液放入200ml燒杯 中，加入85ml水，5ml1molL-1鹽酸及5ml0.4molL-1碘化鉀溶液，按電位滴 定裝置要求，把燒杯置于電磁攪拌器上，將伯電極及甘汞電極