激光共聚焦顯微鏡技術(shù)課件

1、生物醫(yī)學(xué)常用研究技術(shù)課程簡介生物醫(yī)學(xué)常用研究技術(shù)課程簡介研究方法的重要性現(xiàn)代科學(xué)研究以實證為基礎(chǔ)認識了解研究對象的工具揭示研究對象變化和相互關(guān)系的手段每項新的實驗技術(shù)都蘊涵尖端的科學(xué)理論和學(xué)術(shù)進步諾貝爾獎很大一部分授予了分析技術(shù)重大貢獻者。重視和熟悉實驗技術(shù)是科研工作必備的條件。熟悉實驗儀器和技術(shù)將促使做出創(chuàng)造性的工作“動口不動手”的“君子”是不可能在科學(xué)上做出重大成績的。研究方法的重要性現(xiàn)代科學(xué)研究以實證為基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)常用研究方法形態(tài)觀察分析方法顯微觀察技術(shù)：光學(xué)顯微鏡（正置，倒置，體視，熒光，偏光，金相，激光共聚焦），電子顯微鏡（TEM， SEM，ESEM），掃描探針顯微鏡（SPM），顯微

2、X斷層掃描儀（-CT）等形態(tài)測量與分析：各種分析測量軟件生物醫(yī)學(xué)常用研究方法形態(tài)觀察分析方法物理性質(zhì)分析方法硬度分析顆度分析機械性能測定與分析色彩分析物理性質(zhì)分析方法硬度分析化學(xué)性質(zhì)分析方法元素分析基團分析晶體分析分子結(jié)構(gòu)測量電位測量化學(xué)性質(zhì)分析方法元素分析分子生物學(xué)方法 組織勻漿制備DNA分離與提取PCR技術(shù)分子雜交與質(zhì)粒構(gòu)建雙向電泳技術(shù)DNA，蛋白質(zhì)測序分子生物學(xué)方法 組織勻漿制備細胞生物學(xué)方法細胞培養(yǎng)與觀察流式細胞技術(shù)顯微注射技術(shù)細胞活力分析細胞生物學(xué)方法細胞培養(yǎng)與觀察微生物學(xué)方法普通與厭氧培養(yǎng)技術(shù)微生物鑒定技術(shù)染色技術(shù)菌落計數(shù)儀螺旋接種儀微生物自動鑒定儀微生物學(xué)方法普通與厭氧培養(yǎng)技術(shù)樣

3、本制備方法樣本固定脫水、包埋組織切片技術(shù)染色技術(shù)其它樣本制備方法樣本固定目的通過講課和見習(xí)，希望能達到以下目的： 了解主要的生物醫(yī)學(xué)常用研究方法 了解各種研究方法的原理和使用目的 能根據(jù)研究目標選擇正確的研究方法目的通過講課和見習(xí)，希望能達到以下目的：重要性掌握常用生物醫(yī)學(xué)常用研究方法與技術(shù)，對在今后科學(xué)研究工作中作出高水平的創(chuàng)造性成果將會起到重要的作用。重要性掌握常用生物醫(yī)學(xué)常用研究方法與技術(shù)，對在今后科學(xué)研究工激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)口腔疾病研究國家重點實驗室激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)口腔疾病研究國家重點實驗室觀察目標尺寸觀察目標尺寸分辨率分辨率電子顯微鏡的缺點由于樣品需要固定,觀測活細胞十

4、分困難.樣品制備過程（固定、包埋、切片）造成的假象只能觀察標本超微形態(tài)和結(jié)構(gòu),無法對生理活動進行觀察電子顯微鏡的缺點由于樣品需要固定,觀測活細胞十分困難.熒光顯微鏡的缺點無法實現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實現(xiàn)多熒光的同時采集熒光散射光太強，造成實際分辨率大大下降。熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。無法對樣品進行斷層掃描,完成3維重建工作.對于信號較弱的樣本,無法提高觀察的靈敏度.可以觀查活細胞或組織但細胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊熒光顯微鏡的缺點無法實現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實現(xiàn)多激光光譜Red:HeNe 633nm，Orange:HeNe 594nm，Green: HeNe 543

5、nm，Blue: Ar 458nm; 476nm; 488nm 496nm, 514nm，Purple: Diode: 405 nm激光光譜Red:HeNe 633nm，Orange:HeNe偽彩色的概念偽彩色的概念共聚焦顯微鏡的原理 光學(xué)原理SampleLaserPrismPMTAOBS共聚焦顯微鏡的原理 光學(xué)原理SampleLaserPrisFluorescent MicroscopeArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitation Pinhol

6、ePMTExcitation FilterConfocal MicroscopeFluorescent MicroscopeArc Lamp掃描成像原理掃描成像原理三維重建原理三維重建原理棱鏡分光技術(shù)棱鏡分光技術(shù)光譜掃描技術(shù)適用于所有染料，發(fā)射光譜位置及寬度可任意調(diào)節(jié)適合對自發(fā)熒光進行檢測最大程度降低對樣品的光損害同時檢測5個真正的共聚焦通道直觀的操作界面光譜掃描技術(shù)適用于所有染料，發(fā)射光譜位置及寬度可任意調(diào)節(jié)激光掃描頭結(jié)構(gòu)激光掃描頭結(jié)構(gòu)激光掃描共聚焦顯微鏡 構(gòu)成顯微鏡掃描頭激光器電腦激光器電 腦掃描頭顯微鏡電腦顯示屏激光掃描共聚焦顯微鏡 構(gòu)成顯微鏡激光器電 腦掃描頭顯微鏡電激光掃描共聚焦顯微

7、鏡 特點激光掃描共聚焦顯微鏡 特點激光掃描共聚焦顯微鏡 優(yōu)點排除焦點外光信號干擾激光掃描共聚焦顯微鏡 優(yōu)點排除焦點外光信號干擾提高分辨率提高分辨率改善視野廣度和深度改善視野廣度和深度多重染色與適時多通道掃描多重染色與適時多通道掃描一維到四維觀察一維到四維觀察靜態(tài)和動態(tài)觀察靜態(tài)和動態(tài)觀察活細胞分子變化觀察活細胞分子變化觀察定性定量定位分析定性定量定位分析激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用光學(xué)切片觀察(細胞CT):激光掃描共聚焦顯微鏡可對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的系列光學(xué)切片。這一功能又被簡稱為“細胞CT”。激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用光學(xué)切片觀察(細胞CT):影像三維重建通過薄層光學(xué)切片功能，可獲

8、得標本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機圖像處理及三維重建軟件，可產(chǎn)生生動逼真的三維效果，從而能靈活、直觀地進行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。影像三維重建通過薄層光學(xué)切片功能，可獲得標本真正意義上的三維影像三維重建影像三維重建影像三維重建影像三維重建影像三維重建影像三維重建熒光的定量定位分析激光掃描共聚焦顯微鏡可對單、雙或三標的細胞及組織標本的熒光進行定量、定位分析，也非常適合于高靈敏度的快速免疫熒光測定，可以準確監(jiān)測抗原表達、熒光原位雜交及細胞的形態(tài)學(xué)特性并進行定量分析。熒光的定量定位分析激光掃描共聚焦顯微鏡可對單、雙或三標的細胞細胞物理化學(xué)測定激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞周長、面積、

9、平均熒光強度等參數(shù)進行測。能對細胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞骨、結(jié)構(gòu)性蛋白,DNA,RNA,酶和受體分子等細胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定量、定性、定時及定位測定。細胞物理化學(xué)測定激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞周長、面積、平均細胞理化測定細胞理化測定pH、細胞內(nèi)離子分析利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞內(nèi)各種離子的含量及動態(tài)變化作毫秒級定時定量分析，較多的是對細胞內(nèi)鈣離子濃度及濃度變化的測量。利用BCECF等探針可對細胞內(nèi)pH進行測定。也就是說利用激光掃描共聚焦顯微鏡能進行細胞生理信號的動態(tài)監(jiān)測。pH、細胞內(nèi)離子分析利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可對細熒光漂白恢復(fù)(FRAP

10、) 技術(shù)借助于高強度脈沖式激光照射細胞的某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴散，用激光掃描共聚焦顯微鏡可直接對此擴散速率進行檢測，由此可以研究細胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)和大分子自組裝等。熒光漂白恢復(fù)(FRAP) 技術(shù)借助于高強度脈沖式激光照射細胞FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)FRAP技術(shù)細胞間通訊研究多細胞生物體中，細胞間相互影響和控制的生物學(xué)過程稱為細胞間通訊，它被認為在細胞增殖和分化中起著非常重要的作用，激光掃描共聚焦顯微鏡可測量傳遞細胞調(diào)控信息的離子及分子。細胞間通訊研究多細胞生物體中，細胞間相互影響和控制

11、的生物學(xué)過細胞間通訊研究Recovery of fluorescence10 seconds30 secondsZero timeTimeIntense laser BeamBleaches Fluorescence細胞間通訊研究Recovery of fluorescenc熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量轉(zhuǎn)移是能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量轉(zhuǎn)移是能

12、量從分子的一個部位向熒光能量共振轉(zhuǎn)移以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移時，只檢測到 FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時，就可檢測出FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強。DAr 2R0Dr 2R0A熒光能量共振轉(zhuǎn)移以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移熒光能量共振轉(zhuǎn)移生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究蛋白質(zhì)間相互作用研究,如蛋白分子構(gòu)象改變、大分子(亞基)的結(jié)合與分離、受體與配體的結(jié)合等核酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型、核酸雜交分析脂質(zhì)的分布和傳輸、膜電位傳感和膜融合分析自動DNA測序熒光能量共振轉(zhuǎn)移生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究熒光染料熒光染料是能吸收光并能在較短時間內(nèi)發(fā)射熒光的分子通常具有芳香

13、環(huán)結(jié)構(gòu).熒光染料熒光染料是能吸收光并能在較短時間內(nèi)發(fā)射熒光的分子通常熒光染料的選擇研究目的可選探針范圍染料的性質(zhì)激光熒光染料的選擇熒光染料的性質(zhì)光譜特性良好熒光壽命長且穩(wěn)定量子產(chǎn)率高分子小，易于與生物分子結(jié)合不影響被結(jié)合生物分子的結(jié)構(gòu)和特性多重?zé)晒庵g盡量不發(fā)生相互影響熒光染料的性質(zhì)光譜特性良好檢測核酸共聚焦顯微鏡可定位、定性及定量檢測核酸。常用于細胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測細胞內(nèi)DNA狀況及染色體定位觀察等。常用探針： PI (碘化丙啶)、Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)檢測核酸共聚焦顯微鏡可定位、定性及定量檢測核酸。常用于細胞

14、核檢測蛋白質(zhì)、抗原或受體染料可與抗體、配體、肽、人工合成的寡核苷酸等耦聯(lián)?？捎糜诿庖呓M化、熒光原位雜交、受體標記，檢測細胞表面抗原、胞內(nèi)蛋白，細胞膜表面受體等。常用探針：FITC (異硫氰酸熒光素)、TRITC (四甲基異 硫氰酸羅丹明)、XRITC (異硫氰酸羅丹明X)、Texas Red (德州紅)、PE (藻紅蛋白)、Cy5檢測蛋白質(zhì)、抗原或受體染料可與抗體、配體、肽、人工合成的寡核檢測細胞器部分探針可直接進入死細胞(包括固定細胞) 或活細胞的胞膜，選擇性地與特定細胞器結(jié)合。此外，利用免疫熒光技術(shù)可以標記細胞中任何細胞器。常用探針：線粒體：JC-1、Rhodamine 123溶酶體：Ne

15、utral Red (中性紅)、AO (吖啶橙)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：DiOC6高爾基體：NBD C6-ceramide、Bodipy FL C5-ceramide、Bodipy TR C5-ceramide檢測細胞器部分探針可直接進入死細胞(包括固定細胞) 或活細胞實時動態(tài)監(jiān)測活體細胞或組織功能共聚焦顯微鏡可觀察特異熒光探針標記的單個細胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺激后的整個變化過程，常用于對單個細胞內(nèi)各種離子(Ca2+、pH等)、膜電位、活性氧的比例及動態(tài)變化作毫秒級實時定量分析。也可通過熒光漂白恢復(fù)實驗檢測細胞內(nèi)、細胞間分子流動情況。常用探針：Ca2+ ：Fluo-3、Indo-1、Fura-2pH：

16、BCECF、SNARF-1實時動態(tài)監(jiān)測活體細胞或組織功能共聚焦顯微鏡可觀察特異熒光探針染料負載方法樣品為細胞還是組織需負載的是所有細胞還是部分細胞樣品細胞的大小染料分子的大小負載對細胞活性和功能的影響染料定量及定位的精確度孵育法，損傷導(dǎo)入法，轉(zhuǎn)基因法染料負載方法樣品為細胞還是組織熒光淬滅 淬滅指熒光分子的不可逆破壞。其主要原因是：光照促使處于激發(fā)態(tài)的熒光分子與其他分子相互作用引起碰撞淬滅；熒光分子與外部分子或離子形成非熒光復(fù)合物；共振能量轉(zhuǎn)移；pH值、溫度等環(huán)境條件的影響。熒光淬滅 淬滅指熒光分子的不可逆破壞。其主要原因是：防止淬滅的方法降低激光強度適當(dāng)減少掃描時間適當(dāng)降低染料濃度降低氧含量使用防淬滅劑(不適用于活細胞觀察)防止淬滅的方法降低激光強度串色的解決方法在兩種或以上熒光探針之間，如果熒光發(fā)射峰很近，那么熒光光譜彼此會有部分重疊，檢測時可能出現(xiàn)一種熒光探針的信號擴散到另一熒光通道的情況。這種現(xiàn)象稱為串色。串色的解決方法在兩種或以上熒光探針之間，如果熒光發(fā)射峰很近，串色的解決方法光譜檢測器序列掃描專業(yè)軟件Dye Finder串色的解決方法光譜檢測