稀土熒光探針檢測多巴胺及類似物課件

1、稀土熒光探針檢測多巴胺及類似物答辯人：袁潔導(dǎo)師：趙美萍 副教授2003年6月18日選題背景已有檢測方法綜述實驗部分總結(jié)致謝兒茶酚胺的結(jié)構(gòu) 及生理意義兒茶酚胺（catecholamine, CA）的種類、結(jié)構(gòu)和生理意義神經(jīng)遞質(zhì)在單細(xì)胞檢測中的意義Dopamine（DA）瑞典神經(jīng)藥理學(xué)家Carlsson于1958年首次提出腦內(nèi)多巴胺(DA)是獨(dú)立的神經(jīng)遞質(zhì) 正常值范圍為血漿：888pmol/L； 尿：424-2612nmo1/24h。增高會引起嗜鉻細(xì)胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮癥酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低會引起植物神經(jīng)病變，帕金森病等。 Epinephrine（E）& nor epinephr

2、ine （NE） 在人體內(nèi)的正常值 范圍為 血漿：480pmo1/L； 尿：0-80nmo1/24h在人體內(nèi)的正常值范圍為血漿：615-3240pmol/L； 尿：0-590 nmol/24h稀土熒光探針檢測兒茶酚類化合物的原理 單純的TbCl3，Tb-DCTA體系和DOPAC在實驗用的波長條件下(298nm,546.8nm)都沒有熒光信號，可見體系發(fā)光是由于形成了Tb-DCTADOPAC三重絡(luò)合物并發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移得結(jié)果。DOPAC的熒光圖紅：激發(fā)波長為279nm藍(lán)：激發(fā)波長為298nmTbCl3的熒光圖紅：激發(fā)波長為298nm藍(lán)：激發(fā)波長為240nm1.三元絡(luò)合物的形成 三元絡(luò)合物體系：1.

3、離子締合三元絡(luò)合物 2.金屬離子先后結(jié)合兩種配體形成三元絡(luò)合物 TbDCTACAs體系：Tb與DCTA先行絡(luò)合，然后Tb余下的空位再與CAs絡(luò)合，形成三重絡(luò)合體系 2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(1) 配體受激后,單重態(tài)（S1）有三種方式退激： a. 產(chǎn)生熒光的輻射躍遷(S1-S0) b. 系間竄躍(S1-T1) c. 無輻射躍遷回基態(tài)(ISC) 三重態(tài)（T 1）也有三種退激方式： a. 產(chǎn)生磷光的輻射躍遷(T1-S0) b. 通過無輻射轉(zhuǎn)移躍遷到Tb3的激發(fā)態(tài)(ET)，c. 無輻射躍遷回基態(tài)(T1S0)。2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(2) 分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)換效率的影響因素：1.配體最低的激發(fā)三重態(tài)（T1）能量

4、高于Tb的5D4能級的能量2.能量轉(zhuǎn)移的速率大于三重態(tài)無輻射退激的速率3.從配體激發(fā)單重態(tài)向三重態(tài)系間竄躍的速率和幾率相當(dāng)高實驗條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇： 1. Eu3 + EDTA體系 ； 2. Eu3phen體系； 小結(jié)： 最終棄用這兩個體系的原因，是其適用的pH范圍太低，難以使DA的羥基充分解離形成三元絡(luò)合物。實驗條件的優(yōu)化 稀土離子與第一配體的選擇： 3. Tb3 + EDTA體系（1）： Tb:EDTA1:1（濃度均為2 mmol/L）, pH11, ex300 nm，em545 nm,加入甲醇（分析純）、CsCl、TOPO等嘗試敏化,無法得到滿意 檢測限，DA為105 m

5、ol/L 小結(jié)： 目前研究最多的體系，適用的pH相對于前兩個體系有了很大提高，但是仍然未能達(dá)到文獻(xiàn)報道的結(jié)果 ACDOPACFluro圖 BCDA-Fluro圖 實驗條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇： 4. Tb3 + DCTA體系 ： 20C 時， Tb3與EDTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為17.93，而與DCTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為20.20* 因此本體系可以在更高pH下存在，更利于三重絡(luò)合物形成pH影響0.4 mmol/L Tb3DCTA，2105 mol/L DOPAC，橫坐標(biāo)為pH 0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液（色譜純甲醇：重蒸水9：1），橫

6、坐標(biāo)為5 ml樣品中10 mol/L NaOH的體積 表面活性劑的影響由于水分子對熒光有相當(dāng)?shù)拟缱饔?，體系又是在水相中，因此嘗試加入表面活性劑進(jìn)行改進(jìn)。期望熒光體系能夠被包裹在表面活性劑形成的膠束中得到保護(hù)，起到敏化作用。共嘗試加入了陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉，陽離子表面活性劑溴代十二烷基三甲胺和非離子表面活性劑TOPO。都未起到期望的對體系的改善作用。甲醇含量影響0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液 ，NaOH fixed重原子影響 重原子對于熒光體系有時也可起到敏化作用。實驗嘗試向體系加入了SrCl2，BaCl2，以及CsCl，其中CsCl的加入

7、對體系的熒光有明顯得增強(qiáng)作用 ，最后選擇CsCl濃度為0.1 mol/L。 實驗操作 向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色譜純甲醇4.5 ml，混勻。在檢測前再加入待測物，用重蒸水定容至5 ml，在激發(fā)波長為298 nm，發(fā)射波長546.8 nm處用0.5 cm比色池測定熒光強(qiáng)度。 實驗結(jié)果 a. CDA Fluro圖 b. CDOPAC- Fluro圖 實驗結(jié)果 被測物指標(biāo)多巴胺（DA）3,4二羥基苯乙酸（DOPAC）鄰二酚（兒茶酚）3,4二羥基苯甲酸線性范圍8108 8106mol/L8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 線性相關(guān)系數(shù)0.99880.99920.99670.9982檢測限5.2108 mol/L3.6108 mol/L5.7108 mol/L2.97108 mol/L 1.證明了CAs 能夠與Tb 和另一配體形成三重絡(luò)合物并發(fā)出熒光。2. 建立了一個新的用稀土熒光探針檢測兒茶酚類化合物的體系，并對實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化。3. 確定了新方法檢測四種物質(zhì)的線性范圍和最低檢