南方醫(yī)大癌生物學講義13-3血管生成與腫瘤

第十三章（3）血管生成與腫瘤“通過上一講，我們知道了，多種間質(zhì)細胞的活化都可以促進腫瘤的進展。腫瘤相關成纖維細胞（CAF）和肌成纖維細胞既可以釋放間質(zhì)衍生因子-1（SDF-1），后者招募循環(huán)中的內(nèi)皮前體細胞（EPC）進入腫瘤間質(zhì)，也可以分泌VEGF，以誘導形成腫瘤的新血管系統(tǒng)；小鼠腺瘤或腺癌細胞可分泌趨化因子CCL9，后者能招募來源于骨髓的未成熟骨髓細胞（iMC），iMC聚集于腫瘤侵襲的前沿，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9，協(xié)助腫瘤細胞向下面的組織層侵襲。今天，我們討論內(nèi)皮細胞及血管新生在腫瘤發(fā)生進展中的作用?！?、內(nèi)皮細胞及其形成的血管確保腫瘤接近循環(huán)系統(tǒng)早在20世紀50年代中期，病理學家就注意到腫瘤優(yōu)先生長在血管周圍：距離血管0.2mm之外的腫瘤細胞不再生長，而再遠處的腫瘤則會死亡。在距離血管大約0.2mm的這一半徑范圍內(nèi)的細胞可依賴擴散保證它們的供氧，在這個距離之外的細胞則要經(jīng)受中度或嚴重的乏氧和低pH的影響，有壞死的危險。圖13-3-1：前列腺癌中的大規(guī)模壞死：中心生長的是腺癌癌巢（深紅色），其被大量的間質(zhì)（淺紅色）包圍，癌巢的中央是一大塊壞死的組織（淺紅色）。腺癌細胞因接近間質(zhì)和相關的血管系統(tǒng)而生長旺盛

乏氧不是細胞遠離循環(huán)系統(tǒng)所付出的唯一代價，除獲取氧氣之外，脈管系統(tǒng)對于所有類型組織（正常及腫瘤組織）的生長和存活均具有重要意義。細胞還需要與血管系統(tǒng)進行有效的相互作用以獲取營養(yǎng)，并排泄代謝廢物和二氧化碳。組織中所有細胞與最近的毛細血管的距離都不超過幾個細胞的直徑，在一些正常組織，尤其是具有高代謝活性的組織中，多數(shù)細胞都傾向于與至少一根毛細血管直接接觸。在胚胎發(fā)育過程中，一個器官或組織的結構和總體大小是由遺傳編程的，但單個細胞的精確定位并非如此。這同樣適用于脈管系統(tǒng)：基因組決定主要血管的總體布局，并將設計和裝配局部毛細血管網(wǎng)和稍大血管的任務委派給組織內(nèi)的單個細胞。短距離的異質(zhì)性相互作用決定了構建脈管系統(tǒng)的單個毛細血管的路徑。更加特別的是，組織中的毛細血管似乎可在任何需要它們的、無血管（即實質(zhì)）的細胞處形成。腫瘤發(fā)生過程與上述情況相似。一個生物體的基因組不能決定腫瘤的總體構造，因為每個腫瘤都是新創(chuàng)造的，而不是由基因組預先設定的。這暗示腫瘤血管生成也是如此。腫瘤不能依照遺傳信息配置它們的血液供給系統(tǒng)，而是必須根據(jù)腫瘤發(fā)展的不同階段，調(diào)整脈管系統(tǒng)的布局。特別是在組裝它們自己的供血系統(tǒng)時，腫瘤完全依賴瘤內(nèi)無脈管的細胞（包括腫瘤細胞和其他類型的起支持作用的基質(zhì)細胞）與脈管系統(tǒng)的細胞（包括內(nèi)皮細胞、周細胞和平滑肌細胞）間局部的異質(zhì)性相互作用。

將小塊腫瘤移植至實驗動物如兔子的角膜或耳中，揭示出血管生成因子的存在及其能力。幾天之內(nèi)，先前存在的毛細血管床中即形成密集的毛細血管網(wǎng)和較大的血管，這些毛細血管網(wǎng)及血管進而匯聚于移植的腫瘤塊中。

圖13-3-2：通過插在小鼠皮膚腫瘤上的窗觀察皮下移植瘤的血管生長

在正常組織中可見毛細血管被周細胞系統(tǒng)地覆蓋，與之形成反差的是它們在腫瘤相關毛細血管附近的雜亂分布。腫瘤中典型的毛細血管直徑是正常的3倍。而且，腫瘤內(nèi)部及腫瘤周圍血管的整體布局相當混亂。腫瘤中毛細血管和較的血管建造得如此隨意的確切原因還不清楚。一種可能的原因是兩種互相桔抗的生長因子（促血管生成素-1和促血管生成素-2)之間的平衡被打破。VEGF通過吸引和刺激內(nèi)皮細胞啟動毛細血管生長，而促血管生成素-1和促血管生成素-2的混合物誘導內(nèi)皮細胞招募周細胞和平滑肌細胞，使得新形成的毛細血管成熟為由3種細胞類型（即內(nèi)皮細胞、周細胞和平滑肌細胞）以適當比例構建起的血管。這兩種拮抗的促血管生成素的不平衡及腫瘤內(nèi)過高的VEGF,可能是大多數(shù)腫瘤中脈管系統(tǒng)構件缺陷的原因。實際上，一些實驗表明在正常的皮膚中僅通過表達VEGF-A即可模擬腫瘤相關微血管的異常組織形態(tài)。

圖13-3-3：活體組織血管成像技術顯示腫瘤相關血管的組織紊亂

在亞顯微水平，腫瘤塊中的毛細血管是隨意組裝的。因為相鄰內(nèi)皮細胞的質(zhì)膜并沒有相互接觸形成圍繞毛細血管腔的無縫隙內(nèi)層，相反經(jīng)常保留著幾微米寬的缺口，導致毛細血管周圍的細胞直接接觸血漿，由此導致的滲漏可能是腫瘤實質(zhì)中血纖維蛋白沉積的原因。定量測量顯示腫瘤中毛細血管壁的通透性比正常毛細血管高10倍。有些滲漏可能是由于毛細血管壁組裝缺陷。但是，多數(shù)滲漏可能是由腫瘤細胞和腫瘤相關間質(zhì)中的巨噬細胞和成纖維細胞分泌VEGF失調(diào)所致。當給荷瘤小鼠注射VEGF中和抗體后，腫瘤相關毛細血管的滲透性顯著降低。然而，VEGF造成血管滲透性增加的機制尚不清楚。圖13-3-4：VEGF引起毛細血管滲漏：用包裝有VEGF-A表達載體的腺病毒感染小鼠的耳朵，此后將伊凡思藍染料注入小鼠循環(huán)系統(tǒng)，30分鐘后成像顯示，VEGF-A表達的時間越長，微血管的滲漏程度越嚴重

腫瘤相關毛細血管的滲漏導致腫瘤實質(zhì)間隙中大量體液的累積。在正常組織中，這些體液可由淋巴管引流最終進入靜脈循環(huán)。而在實體瘤中，癌細胞群的擴張使淋巴管外部壓力增大，使僅存的淋巴管坍塌。在實體瘤核心區(qū)域中，由此導致的淋巴排泄系統(tǒng)缺陷進一步加劇了由毛細血管滲漏造成的體液積累，在腫瘤的無脈管部分產(chǎn)生相對較高的液壓。

2、血管生成開關的開放對腫瘤擴張是必需的Rip-Tag轉(zhuǎn)基因小鼠實驗研究了腫瘤發(fā)生血管生成的機制，該小鼠攜帶一個胚系轉(zhuǎn)基因-胰島素基因啟動子驅(qū)動SV40大T抗原和小T抗原的表達，確保病毒癌蛋白在胰腺中形成胰島的β細胞中表達。10周齡時，Rip-Tag小鼠約一半的胰島形成增生結節(jié)；12-14周時，最初形成的增生性胰島中約3%最終進展成為癌。圖13-3-5：胰島細胞腫瘤進展的

Rip-Tag模型

在Rip-Tag小鼠小的腫瘤細胞巢中，細胞因被轉(zhuǎn)入的致癌基因驅(qū)動而持續(xù)不停地分裂，但每個胰島中腫瘤細胞群體的總體大小保持恒定，因為細胞會通過凋亡進行代償消耗。該模型提示，人類中小腫瘤細胞巢在很多年里保待這種不斷分裂但體積不變的狀態(tài)，無法突破限制它們的屏障。且這種屏障并非是物理性的，而是因為這些細胞還沒有開始形成血管，缺乏脈管系統(tǒng)，由此導致的乏氧觸發(fā)了p53依賴的凋亡。然而在某些時間點上，一小群癌前胰島細胞突然獲得了引起新血管生成的能力，限制它們及其后代增殖的因素被解除。這種小腫瘤塊行為上的瞬間顯著改變稱為“血管生成開關”。血管生成開關無疑是腫瘤進展中的一個重要步驟，代表癌細胞成功突破了這一防御屏障并且獲得隨意誘導血管生成的能力。

這些β細胞在血管生成開關出現(xiàn)之前很久就已制造了大量的VEG，但這些VEGF分子被周圍的細胞外基質(zhì)（ECM）有效隔離，不能刺激血管生成。而在Rip-Tag胰島中的血管生成開關伴隨著突然出現(xiàn)大量的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9），MMP-9以靶向作用的方式裂解ECM的特定成分，從而釋放VEGF。MMP-9是由被招募了癌變前胰島的炎性細胞（肥大細胞和巨噬細胞）合成并釋放的。因此，在此特定的組織中，血管生成開關的開放在根本上是依賴于招募炎性分子的能力的。圖13-3-6：血管生成開關及炎性細胞的招募用基因工程技術選擇性地使胰島細胞中編碼VEGF的基因缺失，胰島存活并且腫瘤的早期步驟仍然可以正常地進行，但不會出現(xiàn)血管生成開關。這更加說明了胰島細胞來源的VEGF分子在觸發(fā)血管形成中起關鍵作用，而且招募的基質(zhì)細胞不能通過其自身帶來的VEGF補償這種VEGF的缺乏。需要注意的是，Rip-Tag模型不能代表所有類型腫瘤形成過程中發(fā)生的血管形成機制。例如，在一些腫瘤中，血管形成似乎是逐漸增多的，這與Rip-Tag胰島的行為形成反差。此外，其他腫瘤可能依賴不同的血管生成因子引發(fā)血管形成。3、血管生成開關啟動一個高度復雜的過程腫瘤早期血管生成是受限制的，只有當腫瘤細胞變得有侵襲性、穿透基底膜，并獲得與間質(zhì)細胞直接而密切的接觸時，才開始大量生成血管，這表明腫瘤的侵襲和血管大量生成是緊密相連的兩個過程。在許多類型的人類腫瘤中，顯微鏡下平均每個視野中的毛細血管密度會隨著腫瘤的惡性程度而增加，且大量表達VEGF（除HER2外）的乳腺癌患者在初次診斷后的治療效果就很差，這些表明血管生成開關僅是使腫瘤逐漸發(fā)生血管生成并加速脈管系統(tǒng)形成的諸多階段中的第一步。圖13-3-7：腫瘤獲得侵襲性前/后的毛細血管（褐色）：(A)良性前列腺上皮內(nèi)瘤變中的毛細血管遠少于浸潤型前列腺癌（B)乳腺導管原位癌中的毛細血管遠少于浸潤型導管癌

血管生成開關可能使少量腫瘤細胞在血管生成開啟后可以增殖并最終占據(jù)腫瘤大部分體積，從而使得腫瘤整體上均有血管生成表型。實際上，通過分析從人移植瘤中分離出來的細胞，發(fā)現(xiàn)不同亞群的腫瘤細胞在血管生成能力方面有很大的異質(zhì)性，一些腫瘤細胞血管生成能力很強，而另一些則很弱。即使在腫瘤細胞系中，單個亞克隆細胞群在體內(nèi)移植時也顯示不同的血管生成和腫瘤形成能力。這提示血管生成開關開啟很久以后，腫瘤塊中血管生成能力較弱的腫瘤細胞依賴于鄰近血管生成能力較強的細胞，獲得充足的脈管系統(tǒng)。4、血管生成通常被生理抑制劑抑制原發(fā)腫瘤可釋放一些類型的抑制物，通過體液循環(huán)抑制遠端轉(zhuǎn)移細胞的增殖。這些抑制因子無論其本質(zhì)是什么，似乎都能在次級生長中阻止血管生成，使其不能擴張至多于1/10mm。一旦原發(fā)腫瘤被切除，假定的抑制因子就會在循環(huán)系統(tǒng)中消失，去除了對已經(jīng)種植的轉(zhuǎn)移灶生長的抑制。圖13-3-8：血管生成開關平衡

血管抑素和內(nèi)皮抑素分子最初是從罹患腫瘤的動物的尿中分離得到的，對這兩個氨基酸序列進行測序發(fā)現(xiàn)，它們來源于細胞外基質(zhì)(ECM)或者血漿中已知蛋白的切割產(chǎn)物。近年來，仍有其他抗血管生成物質(zhì)被分離，許多是通過水解細胞外基質(zhì)蛋白形成的。這些發(fā)現(xiàn)表明，血管生成在正常組織發(fā)育和傷口愈合中進行，該過程最終由胞外空間的抗血管生成蛋白片段聚集所終止。其他重要的天然抗血管生成蛋白發(fā)揮基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑的功能。VEGF刺激局部產(chǎn)生MMP-1-MMP-4,促使毛細血管延伸侵襲到細胞外基質(zhì)。稱為組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP)的一系列分泌蛋白可以通過阻止這些或者其他的MMP發(fā)揮作用而阻止毛細血管的延伸。在這些血管生成的生理調(diào)節(jié)中觀察到的現(xiàn)象表明，血管生成不是一個二元的狀態(tài)。相反，不同類型的腫瘤細胞獲得或多或少血管生成能力，甚至在特定的腫瘤中，不同的腫瘤細胞也很可能顯示出不同吸引脈管系統(tǒng)的能力。這樣的行為可以被解釋為促血管生成和抗血管生成因子之間的平衡決定了新生血管生成是否會繼續(xù)，以及腫瘤內(nèi)多大的區(qū)域?qū)幻}管覆蓋。5、特定的抗血管生成可用于治療腫瘤原則上講，既然腫瘤完全依賴于血管生成才長成特定大?。ㄖ睆郊s0.2mm),那么任何可以成功阻止血管生成或清除血管生成的產(chǎn)物的方法應該代表治療腫瘤的高效策略。一旦其血管供給被中斷，微小腫瘤將不會再長大，較大腫瘤將會衰竭。且腫瘤中內(nèi)皮細胞不斷地形成和丟失，半衰期僅有一周。而機體其他正常血管的相應內(nèi)皮細胞幾乎不分裂，且半衰期達到數(shù)百天。循環(huán)細胞（如進入活躍的細胞周期的細胞）對藥物誘導殺傷的敏感性幾乎總是遠遠高于那些靜止的細胞，所以針對內(nèi)皮細胞的細胞毒性治療應當對腫瘤相關的脈管系統(tǒng)有強烈的殺傷作用，而體內(nèi)正常的血管則完好無損。天然抗血管生成抑制劑（如血管抑素和內(nèi)皮抑素）是體內(nèi)天然存在的，它們有被耐受而不產(chǎn)生毒性作用的優(yōu)勢。血管抑素和內(nèi)皮抑素阻止Rip-Tag胰腺小鼠的血管生成開啟的作用是非常有限的，但是當應用到已具有血管的小腫瘤時，內(nèi)皮抑素對生長的抑制超過了80%，血管抑素抑制了50%。當用這些試劑治療那些大的、發(fā)育良好的腫瘤時，幾乎沒有觀察到任何效果，但是將二者同時導入可使這樣的腫瘤體積減小75%。長時期的內(nèi)皮抑素治療可使肺癌細胞系誘導小鼠腫瘤消退。這表明內(nèi)皮抑素可能成為腫瘤臨床治療的高效的治療方案。干擾素是另一類天然血管生成拈抗劑，常常被用于研究如何調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)不同細胞類型的活性。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和白介素-8（IL-8）是強的血管生成劑，干擾素-α和干擾素-β已被證明是合成bFGF和IL-8的強效抑制劑。使用干擾素-α在引起一些內(nèi)皮細胞起源的腫瘤如血管瘤及Kaposi's肉瘤等的消退中被證明是有用的。一種單克隆抗體，有Avastin和bevacizumab兩種名稱，結合并中和VEGF-A，這種抗體在大規(guī)模臨床試驗中顯示出顯著的有效性。例如，使用這種抗體聯(lián)合化療(5-氟尿嘧啶）治療轉(zhuǎn)移性結腸癌的患者，在平均水平上比單純化療的患者存活期長4個月，Avastin聯(lián)合目前的化學治療將非小細胞肺癌(NSCLC)患者的存活時間延長了兩個月。類似地，Avastin可以延緩腎細胞癌患者的腫瘤進展，但是對于延長生存期無效。一些合成的低分子量抗血管生成化合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)或者開發(fā)，其直接針對血管生成過程中不同的分子靶點。第一種是煙曲霉素，一種真菌來源的抗血管生成化合物，其臨床衍生物是TNP-470，可以抑制體外和體內(nèi)內(nèi)皮細胞的增殖，表明其體內(nèi)抗血管生成能力來自其阻止依賴內(nèi)皮細胞的新毛細血管的生長。第二種類型的藥物主要抗PDGF受體酪氨酸激酶，如SU6668。血管生成的起始步驟可以在無PDGF受體功能的條件下順利進行，但是在后續(xù)的腫瘤進展過中，PDGF對血管生成和腫瘤體積的增加越來越重要。SU6668在處理晚期高級別腫瘤時，遠比抗VEGF-R藥物更有效，可將這些腫瘤人小減少一半并減少血管分布。13-3-9：PDGF受體抑制劑SU6668聯(lián)合VEGF-R抑制劑SU5416治療Rip-Tag轉(zhuǎn)基因小鼠胰島細胞癌：小鼠胰島細胞腫瘤（左