傳染病檢測(cè)SOP工作手冊(cè)

霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SOP手冊(cè)標(biāo)本的采集和送檢標(biāo)本的采集：采集標(biāo)本的好壞，對(duì)檢驗(yàn)工作的質(zhì)量影響很大。為盡快獲得細(xì)檢查結(jié)果，應(yīng)在發(fā)病早期、在服用抗菌藥物之前盡快采集標(biāo)本和及時(shí)送到檢驗(yàn)室。標(biāo)本以病人大便為主。采便方法用滅菌的棉拭采集排出的新鮮大便，亦可用直腸棉拭或用采便管由肛門插入3cm?5cm采集。一般要求水樣便采集1ml?3ml,固形便采取蠶豆大小糞量。有時(shí)病人的嘔吐物、沾染大便的衣物和尸體的腸內(nèi)容物亦可作為檢材。帶菌者的大便可用棉拭或直腸棉拭采取。標(biāo)本的送檢：采取的標(biāo)本應(yīng)立即接種培養(yǎng)基，典型病人的水樣便含有大量病菌(106/ml?109/ml)，可直接做分離培養(yǎng)并同時(shí)增菌培養(yǎng)。不需做直接分離的均可接種堿性蛋白胨水增菌。并立即送檢驗(yàn)室。標(biāo)本運(yùn)送途中較遠(yuǎn)，也可將標(biāo)本放入文臘氏保存液或卡里一布萊爾運(yùn)送培養(yǎng)基。標(biāo)本與保存液的比例為8ml?10ml保存液加1ml?3ml水樣便或蠶豆大的固形便。也可用厚吸墨紙條吸飽水樣便放入小塑料袋內(nèi)封好送檢。送檢標(biāo)本時(shí)，必須認(rèn)真填寫送檢單，標(biāo)本必須妥善包裝，專人送檢，并防止污染，注意安全，送檢箱用后要嚴(yán)密消毒。檢驗(yàn)方法培養(yǎng)方法增菌培養(yǎng)：所有標(biāo)本都應(yīng)經(jīng)過(guò)增菌，尤其是恢復(fù)期病人、帶菌者或用過(guò)抗生素的病人標(biāo)本，需增菌后再分離。堿胨水接種后放37°C6?8小時(shí)，夏日可將運(yùn)送時(shí)間計(jì)算在內(nèi)。保存液內(nèi)的標(biāo)本取1ml種入堿胨水中。培養(yǎng)后慢慢地從堿胨水生長(zhǎng)的菌膜下，取一接種環(huán)表層培養(yǎng)物接種于4號(hào)或慶大霉素瓊脂平板。標(biāo)本含菌少時(shí)，可實(shí)行二次增菌。取第一次堿胨水增菌后的表層液0.1?0.2ml,接種于另一堿胨水中，37°C6-8小時(shí)再做分離。分離培養(yǎng)：急性典型病人標(biāo)本在增菌的同時(shí)直接做分離培養(yǎng)，這樣既可縮短檢出的時(shí)間，還可避免標(biāo)本中如有不凝集弧菌經(jīng)增菌后大量繁殖，影響霍亂弧菌的分離。其它標(biāo)本均應(yīng)增菌后再做分離培養(yǎng)。當(dāng)前的習(xí)慣多為堿性蛋白胨水增菌，再用強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基分離，37C12?6小時(shí)長(zhǎng)出的菌落，可供做玻片凝集用。血清凝集：選擇生長(zhǎng)16小時(shí)的圓形、扁平、光滑、濕潤(rùn)、半透明、稍隆起、略帶青灰色或中心變黑的菌落、如在TCBS瓊脂上為黃色菌落3?5個(gè)與霍亂O1群多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)。30秒內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集為陽(yáng)性。凝集的菌落應(yīng)以生理鹽水排除自凝并用單價(jià)血清分型。對(duì)菌落典型O1群血清不凝者，可用O139群霍亂血清做凝集試驗(yàn)，有陽(yáng)性者要立即報(bào)告。在流行后期可能出現(xiàn)O1群粗糙型，應(yīng)該用粗糙型血清做凝集試驗(yàn)。已凝集的菌落應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)種普通瓊脂斜面或半固體瓊脂，以備進(jìn)一步鑒定和保留菌種。對(duì)現(xiàn)有霍亂診斷血清不凝集的，凡粘絲試驗(yàn)或氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，確定為弧菌者，亦可保留菌種上送。血清分型：方法是用小川型和稻葉型單價(jià)血清作玻片凝集試驗(yàn)。凡與小川型血清凝集，與稻葉型血清不凝集者為小川型；反之為稻葉型，在兩個(gè)單價(jià)血清中都有明顯凝集者為彥島型。應(yīng)注意小川型菌株型有時(shí)在稻葉型單價(jià)血清中出現(xiàn)弱凝集，不要誤認(rèn)為是彥島型。必要時(shí)應(yīng)以兩個(gè)單價(jià)血清的試管凝集滴度確定彥島型。試管凝集試驗(yàn)：將霍亂多價(jià)診斷血清用生理鹽水自1:20起倍比稀釋，每管含稀釋血清0.25ml。然后將被檢菌的16?24小時(shí)普通瓊脂培養(yǎng)物，制成0.2%福爾馬林生理鹽水懸液，每毫升含20億菌體，各血清稀釋管均加入0.25ml。搖勻，置37C3小時(shí)觀察初步結(jié)果，再放室溫過(guò)夜，觀察最后結(jié)果。通常以肉眼明顯看出凝集（++）的血清最高稀釋倍數(shù)為凝集滴度，生理鹽水對(duì)照不應(yīng)有自凝。形態(tài)學(xué)檢查：按常法涂片進(jìn)行革蘭氏染色，霍亂弧菌均為革蘭氏陰性弧菌。用懸滴或暗視野檢查動(dòng)力呈穿梭狀。用半固體瓊脂穿刺培養(yǎng)基檢查動(dòng)力，37°C16?20小時(shí)霍亂弧菌沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)，為動(dòng)力陽(yáng)性。急性典型病人米泔樣大便的絮片壓片，干燥后甲醇固定，用1:10稀釋石炭酸復(fù)紅染色，可見弧菌呈魚群狀排列。生化學(xué)檢查：將被檢菌的純培養(yǎng)接種入葡萄糖、廿露糖、蔗糖、阿拉伯糖發(fā)酵管、蛋白胨水和硝酸鹽胨水管中。鑒定標(biāo)準(zhǔn)和診斷報(bào)告：霍亂弧菌以血清學(xué)鑒定為主，結(jié)合菌落特征、形態(tài)學(xué)和生化性狀做出判定。凡具備弧菌菌落特征，與O1群霍亂多價(jià)血清玻片凝集陽(yáng)性，并可用單價(jià)血清分型，即可判定。首發(fā)病例可以輔以粘絲試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)，必要時(shí)再做其它試驗(yàn)。進(jìn)一步鑒定O1群霍亂弧菌，還要做古典型和埃爾托型的鑒別及噬菌體型的鑒別。O1群霍亂弧菌的檢驗(yàn)報(bào)告要求迅速準(zhǔn)確，基層單位在收到檢驗(yàn)標(biāo)本后應(yīng)按疑似病人、帶菌調(diào)查、外環(huán)境標(biāo)本分別登記編號(hào)，并迅速放入溫箱培養(yǎng)。一般上午收到標(biāo)本，下午下班前可做分離培養(yǎng)，次日上午可報(bào)告結(jié)果。典型病人水樣便，增菌同時(shí)做直接分離，可提前報(bào)告結(jié)果，首例病人菌株需送上一級(jí)實(shí)驗(yàn)室鑒定和復(fù)核。首例病人確診后再檢出的菌株，經(jīng)血清凝集結(jié)合菌落形態(tài)即可確診。菌株的保存：對(duì)所檢獲的陽(yáng)性菌種或可疑菌種，均應(yīng)接種半固體培養(yǎng)基，37C過(guò)夜培養(yǎng)，用膠塞或石蠟封口，室溫保存，切勿放入冰箱，因霍亂弧菌8。。以下易死亡。同時(shí)填寫菌種保存單，逐級(jí)上送，做進(jìn)一步鑒定?？焖僭\斷：由于霍亂弧菌的診斷以血清學(xué)為主，因此各種快速診斷方法，無(wú)不以血清學(xué)為基礎(chǔ)。目前常用的有制動(dòng)試驗(yàn)、早期片凝、熒光菌球法和SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)等方法，尚有免疫增凝、免疫檢菌、免疫皂土、反向炭凝等方法。制動(dòng)試驗(yàn)：取急性典型病人的水樣便或增菌液1滴（含大量弧菌）于玻璃片上，暗視野（也可直接鏡檢）檢查可見有流星狀運(yùn)動(dòng)之細(xì)菌，當(dāng)加入1滴霍亂免疫血清后，運(yùn)動(dòng)停止，凝集成塊。根據(jù)這種特殊動(dòng)力和制動(dòng)試驗(yàn)，可在幾分鐘內(nèi)做出初步診斷。所用免疫血清要不加防腐劑的。使用血清效價(jià)為1:64，如原效價(jià)為1:1280的血清，1:20稀釋使用。本試驗(yàn)的陽(yáng)性率為50%?85%。以培養(yǎng)出霍亂弧菌為確診。早期片凝法：埃爾托型弧菌在慶大霉素瓊脂上生長(zhǎng)較快，37°C培養(yǎng)10小時(shí)左右，即可長(zhǎng)出直徑1mm左右菌落，取菌落或濕潤(rùn)菌苔直接做霍亂多價(jià)血清玻片凝集，陽(yáng)性者可初步報(bào)告，平皿繼續(xù)培養(yǎng)復(fù)查。免疫熒光菌球法：將水樣便或增菌培養(yǎng)物接種于有霍亂熒光抗體的蛋白胨水中，37C培養(yǎng)4?6小時(shí)，涂片在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的熒光菌球者為陽(yáng)性，并取菌球做細(xì)菌分離，本法適于大量標(biāo)本初篩。SPA協(xié)同凝集反應(yīng)：以金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）為載體，結(jié)合特異的霍亂免疫血清，制成霍亂SPA診斷液。方法是取SPA診斷液一滴于玻片上，加被檢標(biāo)本懸液或胨水增菌液一滴（同時(shí)做不加標(biāo)本和未致敏SPA加標(biāo)本對(duì)照），混勻，搖動(dòng)玻片3分鐘觀察結(jié)果，凝集者記++++、+