電針手厥陰心包經(jīng)穴對(duì) MCAO 大鼠血清、腦組織中 NGF 和 Nogo

電針手厥陰心包經(jīng)穴對(duì)MCAO大鼠血清、腦組織中NGF和Nogo〔〕:

摘要：目的討論電針心經(jīng)穴對(duì)腦缺血損傷的干預(yù)效應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)、血管新生的作用。方法將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、心經(jīng)組、肺經(jīng)組，每組10只。采用頸外動(dòng)脈插入線栓法復(fù)制局灶性腦缺血模型。心經(jīng)組取"靈道";"極泉";"少海";"神門(mén)";穴，肺經(jīng)組取"天府";"尺澤";"列缺";"太淵";穴，于造模后6、24、48、72h進(jìn)展電針治療，每次30min。用TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子〔Nogo-A〕的含量，免疫組化法檢測(cè)腦梗死區(qū)Nogo-A的表達(dá)程度。結(jié)果與正常組、假手術(shù)比擬，模型組血清Nogo-A含量增多〔P0.05〕。結(jié)論電針可降低血清、腦組織中Nogo-A的含量，且心經(jīng)組作用優(yōu)于肺經(jīng)組，對(duì)腦缺血后神經(jīng)修復(fù)具有一定促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：MCAO大鼠；電針；心經(jīng)穴

本文引用格式：馬紋蕊,武娟,灑玉萍,等.電針手厥陰心包經(jīng)穴對(duì)MCAO大鼠血清、腦組織中NGF和Nogo-A的影響[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2022,19(80):221-223.

0引言

腦梗死是由于動(dòng)脈狹窄或完全閉塞，導(dǎo)致腦組織缺氧、缺血、壞死，從而引起的一種腦血管疾病。根據(jù)臨床報(bào)告顯示，目前腦缺血疾病的治療普遍應(yīng)用針灸，研究發(fā)現(xiàn)針灸可以干預(yù)腦缺導(dǎo)致血發(fā)病相關(guān)的多種危險(xiǎn)因素[1-2]，對(duì)患者語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)、神志等功能的進(jìn)步和預(yù)防并改善并發(fā)癥都有顯著的促進(jìn)作用[3-5]。大量文獻(xiàn)記載[6-7]電針"內(nèi)關(guān)";和"神門(mén)";對(duì)腦缺血損傷后心腦組織細(xì)胞凋亡與炎性損傷有抵抗作用，電針"內(nèi)關(guān)";、"曲澤";有促進(jìn)腦缺血血管新生的作用。此次實(shí)驗(yàn)擬以大鼠局灶性腦缺血模型〔MCAO〕為觀察對(duì)象，觀察電針心經(jīng)穴對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、微血管密度以及對(duì)大鼠血清和腦組織中Nogo-A表達(dá)的影響。探究電針心經(jīng)穴對(duì)腦缺血損傷的干預(yù)效應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)、血管新生的作用，為心經(jīng)穴治療腦血管病及從心治腦的研究提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組

SPF級(jí)安康成年雄性SD大鼠50只，體重220~250g。其飼養(yǎng)籠具、墊料、飼料、飲水均按照SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求進(jìn)展制備和消毒，造模前禁食1d。

動(dòng)物分組采用先造模后分組的方式，將大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。正常組：不作處理；模型組：MCAO模型對(duì)照組；假手術(shù)組：大鼠切開(kāi)頸部皮膚，別離CCA及ICA至PPA，不插栓線；手少陰心經(jīng)穴組：造模＋電針心經(jīng)穴；手太陰肺經(jīng)穴組：造模＋電針?lè)谓?jīng)穴。

1.2主要試劑與儀器

主要試劑：Nogo-A酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒；Nogo-A兔抗鼠抗體；SABC免疫組化染色試劑盒；

主要儀器：SDZ-II華佗電針治療儀、華佗牌0.30mmx15mm毫針；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)；酶標(biāo)儀；電熱恒溫枯燥箱；石蠟切片機(jī);雙目顯微鏡；顯微攝像系統(tǒng)；高明晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

1.3造模方法

采用大鼠大腦中動(dòng)脈持久性局灶性缺血模型。參照Z(yǔ)eaLonga和Koizumi[8-9]報(bào)道的方法，即用頸外動(dòng)脈插入線栓法建立MCAO腦缺血模型。造模完成后對(duì)各組大鼠采用ZeaLonga5級(jí)4分制評(píng)分：無(wú)神經(jīng)功能缺損計(jì)0分；梗死對(duì)側(cè)前爪內(nèi)收、伸直障礙計(jì)1分；向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈者計(jì)2分；行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒計(jì)3分；意識(shí)喪失、不能行走計(jì)4分。選取評(píng)分為1-3分的大鼠納入觀察。假手術(shù)組僅暴露頸部正中切口，不做其他處理。

1.4針刺方法

根據(jù)?實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)?[10]動(dòng)物穴位圖譜及擬人比照法定位：按照經(jīng)脈"從胸走手";的循行方向，依次選取癱瘓側(cè)肢體不同節(jié)段的常用穴位，作為心經(jīng)、肺經(jīng)的代表穴。手少陰心經(jīng)選取神門(mén)、靈道、少海、極泉；手太陰肺經(jīng)選取太淵、列缺、尺澤、天府。

于造模后6、24、48、72h時(shí)進(jìn)展治療，針刺癱瘓側(cè)上肢，以15mm、36號(hào)毫針刺入穴位，針刺深度3-4mm，接SDZ-Ⅱ型電針治療儀。"神門(mén)";"靈道";一組，"少海";"極泉";一組，"太淵";"列缺";一組，"尺澤";"天府";一組，正極接近心端穴位，負(fù)極接遠(yuǎn)心端穴位，采用連續(xù)波，頻率為20Hz，輸出電壓2-4V，輸出電流4-6mA以部分組織輕顫為度，時(shí)間30min。

1.5觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

大鼠血清Nogo-A含量的檢測(cè)：治療完畢后，所有大鼠用10%水合氯醛〔0.3mL/100g〕腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈插管取血4-5mL，靜置30min后離心(3000r/min,15min)，用移液槍抽取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清Nogo-A的濃度。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度(OD)值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

Nogo-A在腦梗死區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)：處死大鼠，斷頭取腦，切取病灶側(cè)腦組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、透蠟、包埋、切片，切片厚度4um，選取相鄰的切片分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)梗死區(qū)腦組織的Nogo-A表達(dá)量。詳細(xì)步驟：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，采用高壓修復(fù)，當(dāng)高壓鍋漸漸噴氣時(shí)，計(jì)時(shí)2min，自然冷卻，蒸餾水水洗，PBS洗5minx3次，3%H2O2室溫20min，PBS洗2minx3次，滴加一抗兔抗鼠〔1:100〕，4℃過(guò)夜，PBS洗2minx3次，滴加二步法二抗通用工作液，室溫30min，PBS洗3minx3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，分片。免疫組化后，Nogo-A在腦細(xì)胞胞質(zhì)及突起內(nèi)標(biāo)記為棕黃色的顆粒。應(yīng)用高明晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，每只大鼠取5張切片，每張切片選取患側(cè)腦組織海馬區(qū)C1、C2、C3周邊選擇3個(gè)高倍〔x400〕視野進(jìn)展NGF和Nogo-A陽(yáng)性表達(dá)吸光度值測(cè)定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差〔s〕表示。所有資料進(jìn)展正態(tài)性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布者，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD法和SNK法，方差不齊者用Tambane"sT2或Dunnett"sT3法。不符合正態(tài)分布者，采用多個(gè)獨(dú)立樣本比擬的秩和檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析，結(jié)果以P0.05〕,說(shuō)明模型成功復(fù)制，治療前組間具有可比性；〔3〕組內(nèi)比擬：與2h比，心經(jīng)組在24h、48h、72h神經(jīng)功能缺損評(píng)清楚顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，心經(jīng)組神經(jīng)功能缺損評(píng)清楚顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕;〔4〕組間比擬：與模型組各時(shí)相點(diǎn)比，心經(jīng)組在48h、72h神經(jīng)功能缺損評(píng)分有不同程度的下降〔P0.05〕；與肺經(jīng)組各時(shí)相點(diǎn)比，心經(jīng)組評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示電針心經(jīng)穴組可較好的改善大鼠神經(jīng)功能缺損的病癥，肺經(jīng)穴組未見(jiàn)明顯的改善。

2.2各組大鼠腦梗死體積的比擬

由表2可知，〔1〕各組大鼠全腦體積比擬無(wú)差異〔P>0.05〕，但模型組、肺經(jīng)穴組數(shù)值上相對(duì)偏大，可能與腦缺血后腦組織水胖有關(guān)系；〔2〕正常組、假手術(shù)組大鼠無(wú)腦梗死杜，說(shuō)明手術(shù)本身不會(huì)引起腦缺血改變；〔3〕與正常組和假手術(shù)組比擬，模型組、心經(jīng)肺經(jīng)穴組腦梗死體積、梗死率明顯增大〔P0.05〕，提示三組作用相當(dāng)，電針干預(yù)調(diào)節(jié)暫未能表達(dá)出經(jīng)脈的特異性。

2.3各組大鼠血清中Nogo-A表達(dá)的比擬

由圖一可知：空白組和假手術(shù)組Nogo-A的表達(dá)隨時(shí)間推移無(wú)明顯變化,模型組和假手術(shù)組組Nogo-A的表達(dá)開(kāi)始升高至到達(dá)頂峰,然后明顯下降,但仍稍高于空白組。電針組各時(shí)間點(diǎn)Nogo-A的表達(dá)均低于模型組和假手術(shù)組,后兩組Nogo-A表達(dá)程度無(wú)明顯差異。

2.4各組大鼠腦梗死區(qū)中Nogo-A表達(dá)的比擬

由圖1可知：與正常組、假手術(shù)組比，模型組腦梗死區(qū)NGF陽(yáng)性表達(dá)量均升高〔P0.05〕，說(shuō)明假手術(shù)過(guò)程、造模過(guò)程及電針干預(yù)對(duì)腦梗死區(qū)Nogo-A的表達(dá)無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用，可能與樣本量小或〔和〕Nogo-A在腦缺血急性期腦組織中的變化趨勢(shì)不穩(wěn)定有關(guān)。

3討論

腦缺血后患者的康復(fù)主要取決于中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)，基于腦血管新生為構(gòu)造根底的前提下[11-12]，多種神經(jīng)功能因子之間的互相作用決定神經(jīng)功能修復(fù)的好與壞。多種神經(jīng)功能因子中NGF作為一種重要因子調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及再生和功能性表達(dá)都具有重要的調(diào)控作用；其次Nogo-A作為Nogo蛋白家族中一種，在CNS損傷后抑制軸突再生的才能最為強(qiáng)烈[13]。

大量文獻(xiàn)研究顯示[14-18]，針刺"內(nèi)關(guān)";"足三里";"水溝";"百會(huì)";等穴，均可有效的增加內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而改善大鼠腦缺血后突觸超微構(gòu)造，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，改善肢體功能，到達(dá)抗腦缺血損傷的作用。同時(shí)研究[19-20]還顯示：電針治療可下調(diào)腦堵塞區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)軸突再生，減輕腦梗死后的神經(jīng)損害。

?內(nèi)經(jīng)?中記載心主血脈，心主血脈是人體神志活動(dòng)的物質(zhì)根底，如?素問(wèn)痿論?："心主身之血脈";，?素問(wèn)六節(jié)?："諸血者皆屬于心";，故二者的關(guān)系是功能活動(dòng)和物質(zhì)根底的關(guān)系。

根據(jù)中醫(yī)理論，心具有主血脈的生理功能，而血液對(duì)人體四肢百骸、諸官?gòu)澗兴B(yǎng)作用，腦亦需要血液的滿養(yǎng)。中醫(yī)學(xué)藏象學(xué)說(shuō)，將腦的生理和病理統(tǒng)歸于心而分屬于五臟，認(rèn)為心是"五臟六腑之大主[19]";，人體臟腑器官的功能活動(dòng)，氣血津液的運(yùn)行，以及臟腑之間的聯(lián)絡(luò)和協(xié)調(diào)，均須通過(guò)經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的運(yùn)輸傳導(dǎo)、聯(lián)絡(luò)調(diào)節(jié)得以實(shí)現(xiàn)，并使之成為一個(gè)有機(jī)的整體[20]。心與腦的經(jīng)絡(luò)聯(lián)絡(luò)有：手少陰心經(jīng)經(jīng)目系入腦，其經(jīng)別也與手太陽(yáng)小腸經(jīng)會(huì)于目?jī)?nèi)眥而入腦；心包絡(luò)為心之包膜，與心密不可分，而手厥陰心包經(jīng)絡(luò)于上、中、下三焦，人之頭部〔包括腦〕又歸屬上焦，這樣，又加強(qiáng)了心與腦的聯(lián)絡(luò)；?素問(wèn)骨空論?云：督脈者，入絡(luò)腦上貫心";，通過(guò)督脈，加強(qiáng)了心與腦的聯(lián)絡(luò)；心與小腸相表里，而手太陽(yáng)小腸經(jīng)的經(jīng)筋從目周入腦，這樣，腦與心又多一條聯(lián)絡(luò)途徑。以上為腦與心的直接聯(lián)絡(luò)。因此在心腦病癥的治療方面，臨床或從心而治，或從腦而治，或心腦同冶，均能獲得良好的療效?？梢?jiàn)，心與腦的關(guān)系是非常親密的。說(shuō)明"心腦共主神明";實(shí)際上是以心主血脈為物質(zhì)根底，聯(lián)絡(luò)心腦與絡(luò)脈-血管系統(tǒng)理念相一致的整體觀。

心經(jīng)作為心所屬經(jīng)脈，與心有著親密的聯(lián)絡(luò)。手少陰心經(jīng)起于心中，聯(lián)絡(luò)心系、肺、咽及目系，屬心絡(luò)小腸，淺出腋下，循行于上肢內(nèi)側(cè)后緣，止于小指橈側(cè)端。其絡(luò)脈在腕關(guān)節(jié)后一寸處分出上行，沿本經(jīng)進(jìn)入心中，向上聯(lián)絡(luò)舌相部，歸屬于眼與腦相連的系帶。其經(jīng)別分出后進(jìn)入腋下兩筋之間，歸屬于心臟，向上走到喉呢，成出面部，與手太陽(yáng)小腸經(jīng)會(huì)于目?jī)?nèi)眥。其經(jīng)筋起于手小指內(nèi)側(cè)，結(jié)于碗豆骨處，向上結(jié)于肘內(nèi)，交手太陰經(jīng)筋伏行于孔頭里，結(jié)于胸中，沿腦向下，聯(lián)絡(luò)于臍部。

〔1〕在生理上：手少陰心經(jīng)加強(qiáng)了心與人體體表、官竅及其他臟腑之間的聯(lián)絡(luò)，如?靈樞海論?曰："夫十二經(jīng)脈者，內(nèi)屬于腑臟，外絡(luò)于肢節(jié)";。

〔2〕從病理上：手少陰心經(jīng)為病，就會(huì)表現(xiàn)為：咽喉枯燥，心口痛，口渴；前臂麻木酸痛等，如?靈樞經(jīng)脈?曰："益干，心痛，渴而欲飲，是為臂厥";。?靈樞本神?："心藏脈，脈舍神，心氣虛那么悲，實(shí)那么笑不休";。?靈樞五邪?："邪在心，那么病心痛，喜悲，時(shí)眩仆";。

〔3〕治療上：手少陰心經(jīng)可以治療與心相關(guān)疾病，如?素問(wèn)刺熱?："心熱病者，先不樂(lè)，數(shù)日乃熱。熱爭(zhēng)那么卒心痛，煩悶善喉，頭痛、面赤無(wú)汗刺手少陰、太陽(yáng)";，宋王惟一?新鑄銅人腧穴針灸圖經(jīng)?曰："靈道治心痛悲恐";。

心經(jīng)與腦關(guān)系也很親密。其經(jīng)絡(luò)經(jīng)目系入腦，其經(jīng)別也與手太陽(yáng)小腸經(jīng)會(huì)于目?jī)?nèi)眥而入腦。正是基于此理論，歷代醫(yī)家在治療與腦相關(guān)疾病時(shí)，都會(huì)用到手少陰心經(jīng)的相關(guān)經(jīng)穴。如王惟一?新鑄銅人腧穴針灸圖經(jīng)?曰："少海治寒熱齒麟痛，目瞭發(fā)狂";?；矢χ?jǐn)?針灸曱乙經(jīng)卷七?曰："風(fēng)陵頭痛，少海主之";。楊繼洲?針灸大成?："神門(mén)去心性之呆疾";。徐鳳?針灸大全?："心中驚悸，言語(yǔ)錯(cuò)亂，取少海二穴，少府二穴，心命二穴";，心性呆疾，悲泣不已，取通里二穴，后溪二穴，神門(mén)二穴，大鐘二穴";。近代醫(yī)家根據(jù)以上理論，取手少陰心經(jīng)的相關(guān)經(jīng)穴治療與腦相關(guān)疾病如失眠、郁證、中風(fēng)、癲癇、癡呆、腦萎、神經(jīng)衰弱等疾病，都有非常確切地療效。

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