分子免疫學-之-抗體的制備及應用課件

分子免疫學_之_抗體的制備及應用怎樣思想，就有怎樣的生活分子免疫學_之_抗體的制備及應用分子免疫學_之_抗體的制備及應用怎樣思想，就有怎樣的生活抗體的制備及應用一、抗體的一些基本概念單克隆抗體(MonoclonalAntibody,McAb)單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體(PolyclonalAntibody)多個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體

一、通過轉變教育觀念提升學生的批判性思維在傳統(tǒng)的高中歷史教育觀念中，一直不能有效地突出學生的主體地位，都是講究教師權威、教材的唯一性，這不利于培養(yǎng)和提升學生的批判性思維。高中歷史教師必須要全面轉變自己的教育觀念，摒棄那種所謂歷史教科書是最權威、最精確的知識；教師的知識就是比學生多；教師的講話就是比學生重要；學生需要進一步教化等思想。其實任何的知識只不過是對客觀世界的一種解釋，這并不是永恒的，也不是最終的答案和終極真理，而會隨著社會的發(fā)展和科學技術的不斷進步被新的知識和新的理論所代替、所超越。由此可見，如果將教科書視作權威、視作真理，這是一種不正確的理念。以歷史教科書為例，其編寫者、審定者的指導思想以及世界觀、價值觀、個人知識、學術修養(yǎng)等諸多主觀因素，都會制約著歷史教材主流導向或者存在不同程度的片面性。但正是因為這個客觀存在的現實為深入開展批判性學習拓展了一定的空間，同時也使培養(yǎng)和提升學生的批判性思維成為不可或缺的教學任務。長期以來，在學生眼里歷史學科幾乎就是等同于一門記憶和背誦的學科，這主要是因為傳統(tǒng)的歷史課堂教學一直都在讓學生被動地接受歷史知識，而從來不鼓勵和引導學生主動積極地去探究歷史知識，從而使歷史教學只能成為一種記憶型教學，歷史學科也成為一門記憶型學科。其實這是一個誤解，同時也證明了在高中歷史教學中提升學生批判性思維的重要性。這就要求教師在歷史教學中不斷轉換教育理念，不僅要批判性地分析自己的思想與行為，還要引導學生批判性地分析自己，教師只有持有這樣的觀念進行教學，才能不斷沖擊學生思維的局限，從而逐漸培養(yǎng)和提升學生的批判性思維，這也是學生提升自己、超越自己的重要渠道。二、通過鼓勵學生質疑問難提升學生的批判性思維在歷史教學中要想提升學生的批判性思維，就要不斷鼓勵學生勇于質疑問難、敢問敢想，敢于對權威提出質疑，并能夠有自己的思維。歷史教師在教學中要通過鼓勵和激發(fā)的手段，不斷引導高中學生獨立思考，通過組織學生對歷史教材進行閱讀、開展歷史基礎知識訓練等手段，不斷引導學生主動積極地去思考、去分析，從而有效誘導學生以批判性思維來看待問題、思考問題。教師在教學實踐中，還要想方設法鼓勵學生能夠用不同的思維方式來思考，從而不斷突破常規(guī)去探根究底，尋求多種解決問題的辦法。在此過程中，學生的批判性思維就迸發(fā)了。教師應該對學生的不同看法和不同見解都要尊重，樂于聽取學生不同的，哪怕是幼稚的意見。教師在教學中要多多引導那些有批判性思維潛質的的學生，從而確保那些學生能夠起到以點帶面的作用，通過他們與別人不同的批判性思維來激發(fā)其他學生的批判性意識。在教學實踐中，教師要盡可能用熱情的鼓勵和比較恰當的評價，這樣就可以激發(fā)學生不斷地迸發(fā)更大的批判性意識，從而促進學生發(fā)揮出更大的聰明才智，不斷另辟蹊徑，大膽地去標新立異，大膽質疑問難，逐漸培養(yǎng)他們多方面、多角度思考問題，解決問題的習慣。教師在教學過程中，也可以引用以下事例：如果沒有李四光對“中國貧油論”的懷疑就沒有大慶油田的發(fā)現；如果愛因斯坦沒有懷疑就不可能沖破牛頓的絕對時空觀，從而提出相對論等。從而不斷優(yōu)化學生的批判性思維品質，真正將邏輯的理性與學生批判性激情有機結合起來。三、通過培育獨立人格提升學生的批判性思維教育的本質就是對學生的人格進行教育，從而提升學生的全面素質。歷史教育是教育的重要組成部分，所以，歷史教育應該注重培養(yǎng)學生的健全人格。學生的獨立人格就是指將學生作為個體有其自己獨立自主的地位。所以，要培育學生的批判性思維就是要破除學生對教科書、學者和教師的迷信，讓學生能夠積極、主動的進行批判性思維。當然，批判性思維不是為了批判而批判，更不是為了挑戰(zhàn)權威或個人出風頭而批判，而是因為自己的經驗和學識可以重新審視傳統(tǒng)的觀點是否有道理，是否能成立，是否有邏輯，從而能夠去不斷地去探尋真理，去發(fā)現真理，如此地批判性思維才有真正意義和真正價值。求真務實是歷史教學的第一位要素。培育學生的批判性思維需要教師在教學中不斷引導學生對事實進行冷靜的邏輯分析和客觀的細致推理。比如：在以往的中學歷史教學中由于受傳統(tǒng)觀點的影響，一直都認為在古代中國的君主專制是落后的、封建的。學生如果缺乏批判性思維，就必然對這種在歷史上存在過的政治體制少一種清醒的辨析，必然會導致學生對中國古代政治制度在認識上存在偏頗，從而使中國的古代政治文明長期在學生的印象中是黑暗的、專制的、封建的、落后的。如何辯證看待中國的古代文明，這就要求學生具備獨立思考能力，也要具有獨立的人格，這樣才能為學生獨立思考提供內驅力。教師在教學中，可以通過“開放型”作業(yè)，為學生的獨立思考拓展空間，著眼于幫助學生形成獨立的價值觀、學術觀，不斷促使高中學生更加關注歷史本來面目，從而在追求思想真理的道路上越走越遠，真正完成從“自然的高中生”向“獨立的高中生”的華麗過渡。[在傳統(tǒng)的大學英語聽力課堂上，由于受應試教育及英語四六級考試的影響，教師起主導作用，是課堂的管理者和知識的灌輸者。課堂上教師經常使用的是“播放錄音一核對答案一重放錄音”這種教學模式。這種“三部曲”式的聽力模式單調乏味，無形中把聽力課堂轉變?yōu)槁犃y試課，從而導致課堂氣氛緊張、學生亦倍感壓力。這種聽力訓練機械、被動，難以激發(fā)學生的興趣和注意力，長此以往，學生將喪失英語學習的主動性和積極性。上述這種單向、線性的聽力課堂模式弊端在于教師只重視聽力練習，缺乏和學生間的雙向互動及情感溝通，從而割裂了知識習得與情感交流間的內在聯系，造成聽力課堂上師生關系不和諧。為改變這種傳統(tǒng)落后的聽力教學觀念，就要實施情感教學策略。情感教學是指在教學過程中，教師在認知因素的基礎上，運用一定的教學手段，通過語言、態(tài)度、行為等情感因素來激發(fā)、調動有利于學生學習的積極情感因素，增強學生學習的動機、自信心、主動性和目的性，促進教學效果的積極化及教學效率的最大化，最終實現師生關系和諧發(fā)展，學生個性及素質的提高。情感作為學生精神生活的主宰，是學生學習的催化劑。尤其在英語聽力課堂中，教師應合理調節(jié)和利用情感，努力調動學生的非智力因素。心理學研究表明，要想聽懂某一聽力材料，除了具備相應的專業(yè)知識，還須具備聽的動機、自然放松的心境、較好的記憶力及意志力。如果學生處于焦慮、緊張的心態(tài)就會分散注意力，從而嚴重干擾聽力理解，也就是語言輸入的“情感過濾”問題。所以，從這點出發(fā)，軍校英語教師要樹立“以生為本”的素質教育理信念，激發(fā)學習動機、明確學習目的，強化學習興趣，培養(yǎng)合作精神。軍校學生是個特殊的群體，他們具有學生和軍人雙重身份。與同齡大學生相比，他們具有明顯的三個特點：其一，接受正規(guī)化管理，具有嚴格的紀律要求，生活作息緊湊緊張；其二，生活空間相對固定，接觸外界的時間和精力非常有限；其三，思維不夠活躍，課堂氣氛緊張而活潑不足。上述三個特點的形成與軍校這個特定環(huán)境是密不可分的，首先，軍校學生除了上課，課余時間還要參加體能訓練、接受思想政治教育、學習條令條例，因此自由支配的時間非常有限。除此之外，軍校更強調嚴格紀律的養(yǎng)成，學生接觸的人和事非常單一，因此學生認知局限大、壓力大，心理容易產生疲倦，易受外界干擾而產生焦慮或情緒波動。所以，根據軍校學生生理、心理和認知特征，從英語學科的特點出發(fā)，筆者認為在英語聽力課堂上應該從以下幾方面實施情感教學。（一）加強英語聽力策略訓練，激發(fā)學生興趣受應試教育影響，很多學生在高中階段沒有接受正規(guī)聽力訓練，所以在大學英語聽力課堂上聽懂的非常有限，于是就會產生緊張焦慮感。所以教師首先通過向學生闡釋聽力的特點、過程及方法，加強對學生的聽力策略訓練。任何活動的開展都以動機為前提，聽力活動的有效進行同樣依賴于學生動機的激發(fā)。學習動機能維持學生的學習活動，從來源上動機可以分為兩類：內在動機和外在動機。內在動機直接與學習本身有關，由于學習活動本身能激發(fā)學生的濃厚興趣，學習活動本身就是他們所追求的目的。外在動機是由外部力量和外部環(huán)境（即誘因）激發(fā)而來，與活動沒有內在聯系。在學校教育中，有多種多樣的外部條件，可以吸引、激勵學生，成為他們的動力源泉，如父母的鼓勵、教師的表揚、競爭的獎勵等等。（二）合理設計評價激勵機制，激發(fā)學員參與性軍校學生接受正規(guī)化管理，尤其重視教師對自己的評價。教師的評價直接影響學生的成就感及參與課堂積極性。所以，教師要采取多種評價、激勵措施滿足學生的需求。但在現行教育體制下，語言評價更多的是依靠單一的終結性評價，尤其是依靠試卷，這種評價方式不能全面地評價學生的進步，嚴重挫傷了學生學習語言的積極性，也對英語教學形成了負面影響。我國教育部制定的《大學英語課程教學要求》中明確提出教學評價分形成性評價和終結性評價兩種：形成性評價是基于對學生學習全過程的持續(xù)觀察、記錄、反思做出的一種全新發(fā)展性評價方式，其目的是培養(yǎng)學生對自己進步過程的意識，使學生從被動接受評價轉變成評價的主體和積極參與者。因此，在聽力課堂中，教師不僅要重視終結性評價，更要重視學生在聽力課堂上的表現，跟蹤教學過程，如：學生主動發(fā)言、參與課堂小組活動等，更多地采取寬容、多元化的形成性評價方式，使學生逐漸養(yǎng)成主動獲取知識和反我反思的學習習慣。（三）采取分組等合作方式，科學設置各種集體活動軍校大學生由于受環(huán)境的制約，沒有地方大學生的鍛煉機會多，不利于聽力能力的提高，所以教師更要在聽力課堂上開展豐富多彩的活動促進對聽力內容的理解及吸收。聽力教學可以圍繞語言目標，在學生對所聽材料有一定理解的基礎上、根據學生層次興趣有效組織多種課堂活動，如：雙人對話、小組討論、分角色表演、復述聽力內容等。另外，課堂聽力活動可以結合網絡、多媒體等現代化教學手段，增加活動的趣味性。這些活動一方面能鼓勵學生參與其中，在真實的交際語境中達到培養(yǎng)語言交際能力的目的。在此過程中，學生也會把自身感情當作評估自己的標準，當感覺自己是群體中不可缺少的一員時，學生就會對自我價值產生認可。另一方面，學生能通過這些合作活動消除聽力中的思想焦慮、促進合作意識，提高合作能力，體驗集體榮譽感。而合作意識正是當代大學生必備的基本素質。當然，教師作為聽力課堂活動的設計者，要充當好組織者、鼓勵者和評價者的多重身份。（四）創(chuàng)設寬松、愉快、和諧的聽力課堂氣氛課堂不僅僅是教師教學、學生學習的地方交流，更是師生情感相互碰撞交融的地方。好的課堂氣氛是一種隱性教育，指各種教學要素和關系達到一種動態(tài)的平衡與和諧，它對學生的自主性學習具有巨大的潛在影響，因為在這種氛圍中，學生能輕松地獲取知識，減輕自身學習焦慮感，并能激發(fā)學生學習英語的熱情，變“厭學”為“愿學”。為了達到良好的互動交際，教師首先要保證課堂內外師生關系的平等，使學生在心理上覺得安全。鼓勵學生大膽提出問題，喚起他們的成功欲望；要盡量給焦慮感強的學生提供感受學習成就感的機會，增強他們的自信心，幫助其形成良好的自我形象及對教師的依賴。對學生的語言輸出錯誤要采取寬容的態(tài)度，并以委婉的態(tài)度引導他們自己發(fā)現并糾正錯誤，從而使不同層次水平的學生都能發(fā)揮自身的最大潛力。（五）教師要提高個人魅力及素養(yǎng)，調控教員自身的情緒狀態(tài)教師除了要關注學員心理狀態(tài)，在聽力課堂上自身也要善于表達積極情感，用信任的目光、贊許的微笑、和藹的語言，多給學生動口的機會，盡力做到對學生不指責、不呵斥、不急躁，多給予熱情鼓勵和引導，讓他們在語言實踐中主動發(fā)現問題、解決問題。從而表達出對學生的關心和愛護，消除師生之間的情感障礙，滿足學生的情意需求。另一方面，在日常生活中要不斷地與學生進行情感交流，以求進一步融洽師生感情。教師應把對學生的愛化為一個溫柔的眼神、一個會意的微笑、一句暖心的話語、一個贊許的姿態(tài)、一個體貼入微的動作，公平公正地對待學生。對他們的點滴進步都給以鼓勵，這樣會使學生感覺到教師的關心、賞識和可敬，心理上就會產生一種說不出的愉悅與滿足，激發(fā)他們的求知欲，鼓起他們英語聽力的自信。這樣，學生就會“親其師而信其道”，更加熱愛學習?？傊?，情感策略在大學英語聽力實踐中的積極作用是不容忽視的。軍校大學英語教師應該關注學生在聽力學習過程中的各種聽力需求，通過有效的教學策略，培養(yǎng)他們的學習動機、學習興趣。教師一定要結合實際情況，樹立正確的人文教育觀念，積極調動學生的人格因素，有效地利用現用的教學資源，努力幫助學生營造和諧、輕松、自然地學習氛圍。分子免疫學_之_抗體的制備及應用怎樣思想，就有怎樣的生活分子1抗體的制備及應用抗體的制備及應用2一、抗體的一些基本概念單克隆抗體

(MonoclonalAntibody,McAb)單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體

(PolyclonalAntibody)多個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體

一、抗體的一些基本概念單克隆抗體3抗原（antigen，Ag）表位，抗原結合位點，抗原決定簇（epitope）Ag1234抗原（antigen，Ag）表位，抗原結合位點，抗原決定簇4Ag

單克隆抗體

B1B2B3B4B3B3B3B32

多克隆抗體341Ag單克51、單克隆抗體的特點特異性強，具有抗原結合位點的專一性。（不是抗原的專一性！）因結合位點的單一性，有時不易捕捉抗原，一株單克隆抗體與抗原不易產生凝集反應或沉淀反應。

抗體的性質相同，容易純化、標記。1、單克隆抗體的特點特異性強，具有抗原結合位點的專一性。（不6腦垂體分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素hLH促黃體生成素hTSH促甲狀腺激素hCG#絨毛膜促性腺激素βαβαα

β

βα腦垂體分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素βαβααβ7

單克隆抗體有交叉反應是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反應）,或有相似的表位（不同程度的交叉反應）。單克隆抗體有交叉反應是由于不同的抗原上有8產生凝集反應的原理113323221111112232322113產生凝集反應的原理1133232211111122323229購買抗體時要注意廠商的標注適合于做什么實驗,使用濃度多少WB（Westernblotting，免疫印跡)IH(Immunohistochemistry,免疫組織化學)IC(Immunocytochemistry,免疫細胞化學)IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫電鏡)FCM(FlowCytometry,流式細胞儀)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶聯免疫吸附實驗,酶聯免疫分析)購買抗體時要注意廠商的標注適合于做什么實驗,使用濃度多少102、多克隆抗體的特點

多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質是一個群體綜合的性質。特異性一般比單抗差因為由不同性質的抗體組成，只要其中含交叉反應的抗體，多抗就有交叉反應，所以多抗更容易有交叉反應。2、多克隆抗體的特點多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質11

比單抗更容易捕捉抗原。

因為含有抗不同表位的抗體，多種抗

體都可與抗原結合。

抗體的純化、標記比單抗難因為含有各種不同類型、亞類的抗體，提純、標記的方法有所差別。同時,血清中含有的雜蛋白比較多.比單抗更容易捕捉抗原。

因為含有抗不同表位的抗體，多12二、抗體的制備1、單克隆抗體的制備無法采用生物化學的方法從多抗中分離必須采用細胞雜交的方法來制備能否篩選到理想的單克隆抗體有技術問題也有機遇問題

二、抗體的制備1、單克隆抗體的制備13制備單克隆抗體的基本原理：

致敏的B淋巴細胞骨髓瘤細胞（myeloma）

（能夠分泌特異性的抗體，（不能分泌特異性的抗體，不能在體外長期生存）但能在體外長期生存）

陽性雜交瘤細胞(hybridoma)

（既能分泌特異性抗體，又能夠在體外長期生存）克隆化培養(yǎng)

（產生單克隆的陽性雜交瘤細胞）生產單克隆抗體

1222212制備單克隆抗體的基本原理：1222212142、多抗的制備常用的免疫動物免疫的基本步驟如何免疫兔子2、多抗的制備151）常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠）1）常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，16羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國外實驗室常用。羊（sheep、goat）：常用于較大批量地172）免疫的基本步驟基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（ComplateFreund’adjuvand,含礦物油,卡介苗等).加強免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).2）免疫的基本步驟基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全18取血測效價：加強免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：最后一次免疫后7-10天放血。(在三角瓶中加一些生理鹽水，放血放置一段時間，凝固，吸取血清，離心，分裝，凍存)取血測效價：193)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,無病原（小鼠20g，大鼠200g）基礎免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆?？乖?0.5ml佛式完全佐劑(CFA)（小鼠0.2ml）制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）3)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,無病原（小鼠20加強免疫間隔2-4周,可進行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射加強免疫21免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價酶聯法：1:104以上，能達到1:106。免疫雙擴散：1:16以上，能達到1:64效價達到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動脈)也可多次取血(耳靜脈)

免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價22單抗與多抗的區(qū)別

單抗多抗抗體組成單一復雜

抗體性質個體的屬性群體綜合的性質純化標記容易，效果好難度高一些種屬來源絕大多數是小鼠兔子、羊、豚鼠等制備周期長(最短4個月）短（2個月）制備技術復雜簡單經費多少單抗與多抗的區(qū)別23什么情況需要制備單抗目的蛋白有結構類似物抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑什么情況需要制備單抗目的蛋白有結構類似物24三、抗體的純化鹽析法（硫酸銨沉淀)辛酸-硫酸銨沉淀法離子交換法親和層析法凝膠過濾法三、抗體的純化鹽析法（硫酸銨沉淀)251、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質在水中的溶解度降低而產生沉淀硫酸銨是最常用的中性鹽不同蛋白質的鹽析常數不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示(100%飽和度:767g/L)1、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理26主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4℃高速離心,棄上清,溶解沉淀；

可反復操作,逐級降低硫酸銨的濃度:50%飽和度:0.313g/ml45%飽和度:0.277g/ml40%飽和度:0.243g/ml最后一次離心后,用少量PBS溶解沉淀,透析，測定濃度。主要步驟27特點成本低，步驟簡單?？贵w的回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標記。需要高速離心機。特點282、正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白.正辛酸是一種有機酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀.2、正辛酸-硫酸銨沉淀法原理29主要步驟：調節(jié)樣品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),攪拌30分；。室溫高速離心(10000g，30分鐘),收集上清液；再加入硫酸銨（40%飽和度）；4℃高速離心(10000g，15分鐘),棄上清；溶解沉淀，透析，測定濃度。主要步驟：30特點成本較低，步驟較復雜?？贵w回收率很低。抗體純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標記。需要高速離心機，耐高速離心的玻璃離心管。特點313、離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離.DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品的pH值調至等電點以上,使樣品帶負電荷.采用鹽溶液洗脫,通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分.

3、離子交換法原理32+++++--------

帶負電荷的被吸附上帶負電荷少的先被置換帶負電荷多的后被置換+++++帶負電荷帶負電荷少帶負電荷多33

NaClTris

梯度混合儀

連續(xù)梯度洗脫:NaClTris連續(xù)梯度洗脫:34

階段洗脫:T離子強度蛋白濃度T倒入一定濃度的NaCl溶液通過離心來分離階段洗脫:T離子強度蛋白濃度T倒入一定濃度的Na35主要步驟

先用硫酸銨沉淀抗體，粗提；將樣品過柱；洗去沒有結合的物質；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計測量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。主要步驟36特點成本較低，步驟較簡單?？贵w回收率較高。抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動收集器。特點374、親和層析法原理利用蛋白質之間的特異性結合（抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結合,捕捉與它相配的物質。洗脫一般采用改變pH值的方法4、親和層析法原理38使用前樣品結合(Binding)洗脫(Elution)使用前樣品結合(Binding)洗脫(Elution)39主要步驟

將ProteinA與活化的柱子相結合(買商品柱)；將腹水或血清處理后過柱；用結合緩沖液洗柱子，直到A280值為零；用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液；測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。主要步驟40葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA,SPA)金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白分子量42000,等電點pH5.1可與大多數動物Ig的Fc段結合一個SPA分子有4個相似的活性部位與IgG的結合最強,與IgM,IgA的結合較差

葡萄球菌A蛋白41特點成本高，步驟較簡單?？贵w回收率低?？贵w純度高，適合于各種標記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要自動收集器。特點425、凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質,由于流經路徑的差異,使不同分子質量的組分分離.大分子物質直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小分子物質進入凝膠顆粒的內部再出來，走得慢。適合于IgM類抗體的純化

(五聚體,分子量約800KD)5、凝膠過濾法(分子篩)原理43分子免疫學_之_抗體的制備及應用課件44主要步驟將腹水或血清處理后上柱,樣品要濃；(可用G-200，柱子要長，80-100cm)待樣品入柱后,用緩沖液過柱；等量收集洗脫液,測定洗脫液的A280值。收集第一峰。主要步驟45特點成本高，步驟較簡單?？贵w回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響。抗體純度較高。需要自動收集器。特點4641、學問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥。——阿卜·日·法拉茲

42、只有在人群中間，才能認識自己?！聡?/p>

43、重復別人所說的話，只需要教育；而要挑戰(zhàn)別人所說的話，則需要頭腦?！旣悺づ宓俨┒鳌て諣?/p>

44、卓越的人一大優(yōu)點是：在不利與艱難的遭遇里百折不饒?！惗喾?/p>

45、自己的飯量自己知道?！K聯41、學問是異常珍貴的東西，從任何源泉吸收都不可恥?！⒉?7分子免疫學_之_抗體的制備及應用怎樣思想，就有怎樣的生活分子免疫學_之_抗體的制備及應用分子免疫學_之_抗體的制備及應用怎樣思想，就有怎樣的生活抗體的制備及應用一、抗體的一些基本概念單克隆抗體(MonoclonalAntibody,McAb)單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體(PolyclonalAntibody)多個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體

一、通過轉變教育觀念提升學生的批判性思維在傳統(tǒng)的高中歷史教育觀念中，一直不能有效地突出學生的主體地位，都是講究教師權威、教材的唯一性，這不利于培養(yǎng)和提升學生的批判性思維。高中歷史教師必須要全面轉變自己的教育觀念，摒棄那種所謂歷史教科書是最權威、最精確的知識；教師的知識就是比學生多；教師的講話就是比學生重要；學生需要進一步教化等思想。其實任何的知識只不過是對客觀世界的一種解釋，這并不是永恒的，也不是最終的答案和終極真理，而會隨著社會的發(fā)展和科學技術的不斷進步被新的知識和新的理論所代替、所超越。由此可見，如果將教科書視作權威、視作真理，這是一種不正確的理念。以歷史教科書為例，其編寫者、審定者的指導思想以及世界觀、價值觀、個人知識、學術修養(yǎng)等諸多主觀因素，都會制約著歷史教材主流導向或者存在不同程度的片面性。但正是因為這個客觀存在的現實為深入開展批判性學習拓展了一定的空間，同時也使培養(yǎng)和提升學生的批判性思維成為不可或缺的教學任務。長期以來，在學生眼里歷史學科幾乎就是等同于一門記憶和背誦的學科，這主要是因為傳統(tǒng)的歷史課堂教學一直都在讓學生被動地接受歷史知識，而從來不鼓勵和引導學生主動積極地去探究歷史知識，從而使歷史教學只能成為一種記憶型教學，歷史學科也成為一門記憶型學科。其實這是一個誤解，同時也證明了在高中歷史教學中提升學生批判性思維的重要性。這就要求教師在歷史教學中不斷轉換教育理念，不僅要批判性地分析自己的思想與行為，還要引導學生批判性地分析自己，教師只有持有這樣的觀念進行教學，才能不斷沖擊學生思維的局限，從而逐漸培養(yǎng)和提升學生的批判性思維，這也是學生提升自己、超越自己的重要渠道。二、通過鼓勵學生質疑問難提升學生的批判性思維在歷史教學中要想提升學生的批判性思維，就要不斷鼓勵學生勇于質疑問難、敢問敢想，敢于對權威提出質疑，并能夠有自己的思維。歷史教師在教學中要通過鼓勵和激發(fā)的手段，不斷引導高中學生獨立思考，通過組織學生對歷史教材進行閱讀、開展歷史基礎知識訓練等手段，不斷引導學生主動積極地去思考、去分析，從而有效誘導學生以批判性思維來看待問題、思考問題。教師在教學實踐中，還要想方設法鼓勵學生能夠用不同的思維方式來思考，從而不斷突破常規(guī)去探根究底，尋求多種解決問題的辦法。在此過程中，學生的批判性思維就迸發(fā)了。教師應該對學生的不同看法和不同見解都要尊重，樂于聽取學生不同的，哪怕是幼稚的意見。教師在教學中要多多引導那些有批判性思維潛質的的學生，從而確保那些學生能夠起到以點帶面的作用，通過他們與別人不同的批判性思維來激發(fā)其他學生的批判性意識。在教學實踐中，教師要盡可能用熱情的鼓勵和比較恰當的評價，這樣就可以激發(fā)學生不斷地迸發(fā)更大的批判性意識，從而促進學生發(fā)揮出更大的聰明才智，不斷另辟蹊徑，大膽地去標新立異，大膽質疑問難，逐漸培養(yǎng)他們多方面、多角度思考問題，解決問題的習慣。教師在教學過程中，也可以引用以下事例：如果沒有李四光對“中國貧油論”的懷疑就沒有大慶油田的發(fā)現；如果愛因斯坦沒有懷疑就不可能沖破牛頓的絕對時空觀，從而提出相對論等。從而不斷優(yōu)化學生的批判性思維品質，真正將邏輯的理性與學生批判性激情有機結合起來。三、通過培育獨立人格提升學生的批判性思維教育的本質就是對學生的人格進行教育，從而提升學生的全面素質。歷史教育是教育的重要組成部分，所以，歷史教育應該注重培養(yǎng)學生的健全人格。學生的獨立人格就是指將學生作為個體有其自己獨立自主的地位。所以，要培育學生的批判性思維就是要破除學生對教科書、學者和教師的迷信，讓學生能夠積極、主動的進行批判性思維。當然，批判性思維不是為了批判而批判，更不是為了挑戰(zhàn)權威或個人出風頭而批判，而是因為自己的經驗和學識可以重新審視傳統(tǒng)的觀點是否有道理，是否能成立，是否有邏輯，從而能夠去不斷地去探尋真理，去發(fā)現真理，如此地批判性思維才有真正意義和真正價值。求真務實是歷史教學的第一位要素。培育學生的批判性思維需要教師在教學中不斷引導學生對事實進行冷靜的邏輯分析和客觀的細致推理。比如：在以往的中學歷史教學中由于受傳統(tǒng)觀點的影響，一直都認為在古代中國的君主專制是落后的、封建的。學生如果缺乏批判性思維，就必然對這種在歷史上存在過的政治體制少一種清醒的辨析，必然會導致學生對中國古代政治制度在認識上存在偏頗，從而使中國的古代政治文明長期在學生的印象中是黑暗的、專制的、封建的、落后的。如何辯證看待中國的古代文明，這就要求學生具備獨立思考能力，也要具有獨立的人格，這樣才能為學生獨立思考提供內驅力。教師在教學中，可以通過“開放型”作業(yè)，為學生的獨立思考拓展空間，著眼于幫助學生形成獨立的價值觀、學術觀，不斷促使高中學生更加關注歷史本來面目，從而在追求思想真理的道路上越走越遠，真正完成從“自然的高中生”向“獨立的高中生”的華麗過渡。[在傳統(tǒng)的大學英語聽力課堂上，由于受應試教育及英語四六級考試的影響，教師起主導作用，是課堂的管理者和知識的灌輸者。課堂上教師經常使用的是“播放錄音一核對答案一重放錄音”這種教學模式。這種“三部曲”式的聽力模式單調乏味，無形中把聽力課堂轉變?yōu)槁犃y試課，從而導致課堂氣氛緊張、學生亦倍感壓力。這種聽力訓練機械、被動，難以激發(fā)學生的興趣和注意力，長此以往，學生將喪失英語學習的主動性和積極性。上述這種單向、線性的聽力課堂模式弊端在于教師只重視聽力練習，缺乏和學生間的雙向互動及情感溝通，從而割裂了知識習得與情感交流間的內在聯系，造成聽力課堂上師生關系不和諧。為改變這種傳統(tǒng)落后的聽力教學觀念，就要實施情感教學策略。情感教學是指在教學過程中，教師在認知因素的基礎上，運用一定的教學手段，通過語言、態(tài)度、行為等情感因素來激發(fā)、調動有利于學生學習的積極情感因素，增強學生學習的動機、自信心、主動性和目的性，促進教學效果的積極化及教學效率的最大化，最終實現師生關系和諧發(fā)展，學生個性及素質的提高。情感作為學生精神生活的主宰，是學生學習的催化劑。尤其在英語聽力課堂中，教師應合理調節(jié)和利用情感，努力調動學生的非智力因素。心理學研究表明，要想聽懂某一聽力材料，除了具備相應的專業(yè)知識，還須具備聽的動機、自然放松的心境、較好的記憶力及意志力。如果學生處于焦慮、緊張的心態(tài)就會分散注意力，從而嚴重干擾聽力理解，也就是語言輸入的“情感過濾”問題。所以，從這點出發(fā)，軍校英語教師要樹立“以生為本”的素質教育理信念，激發(fā)學習動機、明確學習目的，強化學習興趣，培養(yǎng)合作精神。軍校學生是個特殊的群體，他們具有學生和軍人雙重身份。與同齡大學生相比，他們具有明顯的三個特點：其一，接受正規(guī)化管理，具有嚴格的紀律要求，生活作息緊湊緊張；其二，生活空間相對固定，接觸外界的時間和精力非常有限；其三，思維不夠活躍，課堂氣氛緊張而活潑不足。上述三個特點的形成與軍校這個特定環(huán)境是密不可分的，首先，軍校學生除了上課，課余時間還要參加體能訓練、接受思想政治教育、學習條令條例，因此自由支配的時間非常有限。除此之外，軍校更強調嚴格紀律的養(yǎng)成，學生接觸的人和事非常單一，因此學生認知局限大、壓力大，心理容易產生疲倦，易受外界干擾而產生焦慮或情緒波動。所以，根據軍校學生生理、心理和認知特征，從英語學科的特點出發(fā)，筆者認為在英語聽力課堂上應該從以下幾方面實施情感教學。（一）加強英語聽力策略訓練，激發(fā)學生興趣受應試教育影響，很多學生在高中階段沒有接受正規(guī)聽力訓練，所以在大學英語聽力課堂上聽懂的非常有限，于是就會產生緊張焦慮感。所以教師首先通過向學生闡釋聽力的特點、過程及方法，加強對學生的聽力策略訓練。任何活動的開展都以動機為前提，聽力活動的有效進行同樣依賴于學生動機的激發(fā)。學習動機能維持學生的學習活動，從來源上動機可以分為兩類：內在動機和外在動機。內在動機直接與學習本身有關，由于學習活動本身能激發(fā)學生的濃厚興趣，學習活動本身就是他們所追求的目的。外在動機是由外部力量和外部環(huán)境（即誘因）激發(fā)而來，與活動沒有內在聯系。在學校教育中，有多種多樣的外部條件，可以吸引、激勵學生，成為他們的動力源泉，如父母的鼓勵、教師的表揚、競爭的獎勵等等。（二）合理設計評價激勵機制，激發(fā)學員參與性軍校學生接受正規(guī)化管理，尤其重視教師對自己的評價。教師的評價直接影響學生的成就感及參與課堂積極性。所以，教師要采取多種評價、激勵措施滿足學生的需求。但在現行教育體制下，語言評價更多的是依靠單一的終結性評價，尤其是依靠試卷，這種評價方式不能全面地評價學生的進步，嚴重挫傷了學生學習語言的積極性，也對英語教學形成了負面影響。我國教育部制定的《大學英語課程教學要求》中明確提出教學評價分形成性評價和終結性評價兩種：形成性評價是基于對學生學習全過程的持續(xù)觀察、記錄、反思做出的一種全新發(fā)展性評價方式，其目的是培養(yǎng)學生對自己進步過程的意識，使學生從被動接受評價轉變成評價的主體和積極參與者。因此，在聽力課堂中，教師不僅要重視終結性評價，更要重視學生在聽力課堂上的表現，跟蹤教學過程，如：學生主動發(fā)言、參與課堂小組活動等，更多地采取寬容、多元化的形成性評價方式，使學生逐漸養(yǎng)成主動獲取知識和反我反思的學習習慣。（三）采取分組等合作方式，科學設置各種集體活動軍校大學生由于受環(huán)境的制約，沒有地方大學生的鍛煉機會多，不利于聽力能力的提高，所以教師更要在聽力課堂上開展豐富多彩的活動促進對聽力內容的理解及吸收。聽力教學可以圍繞語言目標，在學生對所聽材料有一定理解的基礎上、根據學生層次興趣有效組織多種課堂活動，如：雙人對話、小組討論、分角色表演、復述聽力內容等。另外，課堂聽力活動可以結合網絡、多媒體等現代化教學手段，增加活動的趣味性。這些活動一方面能鼓勵學生參與其中，在真實的交際語境中達到培養(yǎng)語言交際能力的目的。在此過程中，學生也會把自身感情當作評估自己的標準，當感覺自己是群體中不可缺少的一員時，學生就會對自我價值產生認可。另一方面，學生能通過這些合作活動消除聽力中的思想焦慮、促進合作意識，提高合作能力，體驗集體榮譽感。而合作意識正是當代大學生必備的基本素質。當然，教師作為聽力課堂活動的設計者，要充當好組織者、鼓勵者和評價者的多重身份。（四）創(chuàng)設寬松、愉快、和諧的聽力課堂氣氛課堂不僅僅是教師教學、學生學習的地方交流，更是師生情感相互碰撞交融的地方。好的課堂氣氛是一種隱性教育，指各種教學要素和關系達到一種動態(tài)的平衡與和諧，它對學生的自主性學習具有巨大的潛在影響，因為在這種氛圍中，學生能輕松地獲取知識，減輕自身學習焦慮感，并能激發(fā)學生學習英語的熱情，變“厭學”為“愿學”。為了達到良好的互動交際，教師首先要保證課堂內外師生關系的平等，使學生在心理上覺得安全。鼓勵學生大膽提出問題，喚起他們的成功欲望；要盡量給焦慮感強的學生提供感受學習成就感的機會，增強他們的自信心，幫助其形成良好的自我形象及對教師的依賴。對學生的語言輸出錯誤要采取寬容的態(tài)度，并以委婉的態(tài)度引導他們自己發(fā)現并糾正錯誤，從而使不同層次水平的學生都能發(fā)揮自身的最大潛力。（五）教師要提高個人魅力及素養(yǎng)，調控教員自身的情緒狀態(tài)教師除了要關注學員心理狀態(tài)，在聽力課堂上自身也要善于表達積極情感，用信任的目光、贊許的微笑、和藹的語言，多給學生動口的機會，盡力做到對學生不指責、不呵斥、不急躁，多給予熱情鼓勵和引導，讓他們在語言實踐中主動發(fā)現問題、解決問題。從而表達出對學生的關心和愛護，消除師生之間的情感障礙，滿足學生的情意需求。另一方面，在日常生活中要不斷地與學生進行情感交流，以求進一步融洽師生感情。教師應把對學生的愛化為一個溫柔的眼神、一個會意的微笑、一句暖心的話語、一個贊許的姿態(tài)、一個體貼入微的動作，公平公正地對待學生。對他們的點滴進步都給以鼓勵，這樣會使學生感覺到教師的關心、賞識和可敬，心理上就會產生一種說不出的愉悅與滿足，激發(fā)他們的求知欲，鼓起他們英語聽力的自信。這樣，學生就會“親其師而信其道”，更加熱愛學習。總之，情感策略在大學英語聽力實踐中的積極作用是不容忽視的。軍校大學英語教師應該關注學生在聽力學習過程中的各種聽力需求，通過有效的教學策略，培養(yǎng)他們的學習動機、學習興趣。教師一定要結合實際情況，樹立正確的人文教育觀念，積極調動學生的人格因素，有效地利用現用的教學資源，努力幫助學生營造和諧、輕松、自然地學習氛圍。分子免疫學_之_抗體的制備及應用怎樣思想，就有怎樣的生活分子48抗體的制備及應用抗體的制備及應用49一、抗體的一些基本概念單克隆抗體

(MonoclonalAntibody,McAb)單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體

(PolyclonalAntibody)多個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體

一、抗體的一些基本概念單克隆抗體50抗原（antigen，Ag）表位，抗原結合位點，抗原決定簇（epitope）Ag1234抗原（antigen，Ag）表位，抗原結合位點，抗原決定簇51Ag

單克隆抗體

B1B2B3B4B3B3B3B32

多克隆抗體341Ag單克521、單克隆抗體的特點特異性強，具有抗原結合位點的專一性。（不是抗原的專一性！）因結合位點的單一性，有時不易捕捉抗原，一株單克隆抗體與抗原不易產生凝集反應或沉淀反應。

抗體的性質相同，容易純化、標記。1、單克隆抗體的特點特異性強，具有抗原結合位點的專一性。（不53腦垂體分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素hLH促黃體生成素hTSH促甲狀腺激素hCG#絨毛膜促性腺激素βαβαα

β

βα腦垂體分泌的一些激素：hFSH促卵泡激素βαβααβ54

單克隆抗體有交叉反應是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反應）,或有相似的表位（不同程度的交叉反應）。單克隆抗體有交叉反應是由于不同的抗原上有55產生凝集反應的原理113323221111112232322113產生凝集反應的原理11332322111111223232256購買抗體時要注意廠商的標注適合于做什么實驗,使用濃度多少WB（Westernblotting，免疫印跡)IH(Immunohistochemistry,免疫組織化學)IC(Immunocytochemistry,免疫細胞化學)IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫電鏡)FCM(FlowCytometry,流式細胞儀)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶聯免疫吸附實驗,酶聯免疫分析)購買抗體時要注意廠商的標注適合于做什么實驗,使用濃度多少572、多克隆抗體的特點

多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質是一個群體綜合的性質。特異性一般比單抗差因為由不同性質的抗體組成，只要其中含交叉反應的抗體，多抗就有交叉反應，所以多抗更容易有交叉反應。2、多克隆抗體的特點多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質58

比單抗更容易捕捉抗原。

因為含有抗不同表位的抗體，多種抗

體都可與抗原結合。

抗體的純化、標記比單抗難因為含有各種不同類型、亞類的抗體，提純、標記的方法有所差別。同時,血清中含有的雜蛋白比較多.比單抗更容易捕捉抗原。

因為含有抗不同表位的抗體，多59二、抗體的制備1、單克隆抗體的制備無法采用生物化學的方法從多抗中分離必須采用細胞雜交的方法來制備能否篩選到理想的單克隆抗體有技術問題也有機遇問題

二、抗體的制備1、單克隆抗體的制備60制備單克隆抗體的基本原理：

致敏的B淋巴細胞骨髓瘤細胞（myeloma）

（能夠分泌特異性的抗體，（不能分泌特異性的抗體，不能在體外長期生存）但能在體外長期生存）

陽性雜交瘤細胞(hybridoma)

（既能分泌特異性抗體，又能夠在體外長期生存）克隆化培養(yǎng)

（產生單克隆的陽性雜交瘤細胞）生產單克隆抗體

1222212制備單克隆抗體的基本原理：1222212612、多抗的制備常用的免疫動物免疫的基本步驟如何免疫兔子2、多抗的制備621）常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠）1）常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，63羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國外實驗室常用。羊（sheep、goat）：常用于較大批量地642）免疫的基本步驟基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（ComplateFreund’adjuvand,含礦物油,卡介苗等).加強免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).2）免疫的基本步驟基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全65取血測效價：加強免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：最后一次免疫后7-10天放血。(在三角瓶中加一些生理鹽水，放血放置一段時間，凝固，吸取血清，離心，分裝，凍存)取血測效價：663)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,無病原（小鼠20g，大鼠200g）基礎免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆粒抗原)0.5ml佛式完全佐劑(CFA)（小鼠0.2ml）制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）3)如何免疫兔子2000g(雌雄均可),健康,無病原（小鼠67加強免疫間隔2-4周,可進行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射加強免疫68免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價酶聯法：1:104以上，能達到1:106。免疫雙擴散：1:16以上，能達到1:64效價達到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動脈)也可多次取血(耳靜脈)

免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價69單抗與多抗的區(qū)別

單抗多抗抗體組成單一復雜

抗體性質個體的屬性群體綜合的性質純化標記容易，效果好難度高一些種屬來源絕大多數是小鼠兔子、羊、豚鼠等制備周期長(最短4個月）短（2個月）制備技術復雜簡單經費多少單抗與多抗的區(qū)別70什么情況需要制備單抗目的蛋白有結構類似物抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑什么情況需要制備單抗目的蛋白有結構類似物71三、抗體的純化鹽析法（硫酸銨沉淀)辛酸-硫酸銨沉淀法離子交換法親和層析法凝膠過濾法三、抗體的純化鹽析法（硫酸銨沉淀)721、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質在水中的溶解度降低而產生沉淀硫酸銨是最常用的中性鹽不同蛋白質的鹽析常數不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示(100%飽和度:767g/L)1、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理73主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4℃高速離心,棄上清,溶解沉淀；

可反復操作,逐級降低硫酸銨的濃度:5