外源基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)

外源基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)1980年至1982年三年的時(shí)間里，外源蛋白在小鼠體內(nèi)表達(dá)的概念從一個(gè)想法變成現(xiàn)實(shí)。在此期間幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室致力于引入新的基因和外源表達(dá)蛋白，首先是在小數(shù)的胚胎十細(xì)胞內(nèi)，其次是成熟的小鼠體內(nèi)。拉爾夫Brinster和理查德Palmiter是這一領(lǐng)域的先驅(qū)。在1981年，他們首次演示了病毒基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。背景：用一個(gè)有效的方法來研究基因和控制他所編碼的蛋白在細(xì)胞和整個(gè)生物體的表達(dá)。DNA重組技術(shù)問世之前，生物學(xué)家通過將外源的mRNA注入青蛙的卵母細(xì)胞來研究mRNA所編碼蛋白的生物活性。分子生物學(xué)革命使得基因被融合到特意的啟動(dòng)子上，從而使他們在所需的細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)。使得生物學(xué)家可以研究人工培養(yǎng)細(xì)胞的基因的功能，他們甚至想研究活機(jī)體的基因。這需要特定外源基因在胚胎肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，將外源基因引入到動(dòng)物基因組中，并檢測其在生物體內(nèi)的功能。在1970s初期，Brinster表明，外源基因可以通過將癌細(xì)胞注射到中年鼠的由早期囊胚形成的胚胎干細(xì)胞內(nèi)，使其在小鼠體內(nèi)表達(dá)的方法來實(shí)現(xiàn)。然而這種方法使得外源基因在所需的細(xì)胞類型中表達(dá)是非常困難的。這需要將外源基因?qū)胄∈蟮幕蚪M內(nèi)。1980年生物學(xué)家表明可以將含有DNA的病毒質(zhì)粒注入到小數(shù)的受精卵中，然后檢測新生小鼠中的病毒序列。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是確定外源基因整合到小鼠基因組中形成的功能性蛋白能否表達(dá)。實(shí)驗(yàn)：Brinster的挑戰(zhàn)是設(shè)計(jì)這樣一個(gè)方案，設(shè)計(jì)一個(gè)簡單明了的實(shí)驗(yàn)證明外源蛋白存在于小鼠內(nèi)。要做到這一點(diǎn)，Brinster選擇了一個(gè)表達(dá)容易測定的酶，而不是他的具有生物學(xué)意義的第一只轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白，他選擇的是單純皰疹病毒(HSV)的酪氨酸激酶，這個(gè)選擇有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，首先，這個(gè)基因來源于人類病毒，其序列與小鼠的內(nèi)源基因不同，可以更容易的整合的小鼠的基因組中。其次磷酸酪氨酸激酶可以根據(jù)放射性標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)化為胸苷一磷酸來測定。最后HSV的胸苷激酶活性的抑制劑不能抑制小鼠內(nèi)源酶的活性。使得研究人員能夠明確的檢測外源蛋白的活性?；蚪Y(jié)合在蛋白編碼區(qū)DNA序列的上游的啟動(dòng)子區(qū)被表達(dá)的，啟動(dòng)子能夠控制何時(shí)、何地的基因被表達(dá)，病毒基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)需要生物學(xué)家去除啟動(dòng)子控制區(qū)的基因，并使病毒基因去啟動(dòng)子融合且在小鼠細(xì)胞內(nèi)具有活性。Brinster與Palmiter合作，研究了小鼠小鼠金屬硫蛋白-1(MT-1)基因的啟動(dòng)子，Palmiter將HSV胸苷激酶基因融合到小鼠金屬硫蛋白-1(MT-1)基因的啟動(dòng)子上，這樣可以確認(rèn)是否一個(gè)外源蛋白能在小鼠體內(nèi)表達(dá)。為了產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠，Brinster與Palmiter將含有HSV胸苷激酶和MT-1啟動(dòng)子融合基因的質(zhì)粒注射到小鼠受精卵的細(xì)胞核中，再將其植回到雌性小鼠體內(nèi)，科學(xué)家使其與正常的小鼠交配，并分析子代小鼠中含HSVDNA量和胸苷激酶的活性。用Southern印跡分析，他們檢測了MT-1啟動(dòng)子/胸苷激酶融合基因，被稱為轉(zhuǎn)基因。他們分離出基因組DNA，然后用限制性核酸內(nèi)切酶切割，根據(jù)切割的DNA片段的大小利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，兩個(gè)科學(xué)家后用雜交放射性標(biāo)記的探針對膜進(jìn)行分析。分析顯示，該基因已被成功地整合到四個(gè)子代小鼠的基因組中。接著，為了確定轉(zhuǎn)基因是否表達(dá)了功能性蛋白，Brinster和Palmiter在小鼠MT-1高表達(dá)的肝臟勻漿中分析胸苷激酶的活性，該小鼠肝組織勻漿含有比

其同窩小鼠的肝組織勻漿約200倍以上的胸苷激酶活性。這只小鼠是轉(zhuǎn)基因整合到基因組中的四只中的一只。為了證明這種活性的增加是病毒胸苷激酶表達(dá)的結(jié)果，他們利用抑制劑作用于肝臟勻漿，特異性的阻斷了HSV胸苷激酶的活性。抑制劑作用后轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟勻漿中胸苷激酶的活性顯著降低，而沒有轉(zhuǎn)基因的小鼠肝臟勻漿中的激酶的活性沒有改變。（表8.1）從而Brinster和Palmiter證實(shí)病毒胸苷激酶活性的存在，并表明外源蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)在小鼠。|ExpressionofViralThymidineKinaseinTransgenicMiceMouseTransgencDNAThymidineKinaseActivity—Inhibitor-I-Inhibitor—Inhibitor-I-Inhibitor23-123-21450023-123-214500497,000[AdaptedfromR.L.Brinsteret1981,Ceti27:223-231.]討論，研究人員嘗試外源蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)在胚胎學(xué)和分子生物學(xué)中的進(jìn)展已經(jīng)相當(dāng)成熟，BrinsterandPalmiter仔細(xì)選擇容易測定的HSV胸苷激酶基因放置在金屬硫蛋白啟動(dòng)子的控制下，說明了這種技術(shù)的可行性。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生使得基因功能研究變的生動(dòng)可貴。在此