生物化學(xué)分子生物學(xué)基礎(chǔ)

第十章

DNA的生物合成

中心法則(TheCentralDogma)

轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制第一節(jié)DNA的復(fù)制一、DNA復(fù)制的定義生物以親本DNA為模板，由DNA聚合酶催化，根據(jù)堿基配對原則，合成與親本DNA完全相同的DNA分子，稱為DNA的復(fù)制。復(fù)制(replication)

是指以親代DNA為模板合成子代DNA的過程。即遺傳物質(zhì)的傳代。復(fù)制親代DNA子代DNA第一節(jié)DNA的復(fù)制二、DNA復(fù)制的特點(diǎn)1、半保留性每個子代DNA分子的一條鏈來自母本DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻摹?、半不連續(xù)性

DNA分子復(fù)制時，新合成的鏈一條是連續(xù)合成，另一條是不連續(xù)的。第一節(jié)DNA的生物合成方向相反

堿基配對規(guī)則

（A=TG≡C）AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

半保留復(fù)制半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證明同位素示蹤法用15N標(biāo)記DNA，然后放入14N環(huán)境中培養(yǎng)，觀察后代兩種含同位素的鏈的比例，用氯化銫等密度離心法顯示結(jié)果。半保留復(fù)制的意義通過半保留復(fù)制，子代DNA與親代DNA的堿基序列完全一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，保證了物種遺傳的穩(wěn)定性(高保真性、保守性)，是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。

解鏈方向半不連續(xù)性復(fù)制（復(fù)制叉）35353′5′3′5′3′5′

先導(dǎo)鏈(leadingstrand

)

隨從鏈(laggingstrand

)岡崎片段（Okazakifragment）先導(dǎo)鏈leadingstrand——合成方向與復(fù)制叉解鏈方向相同，并可連續(xù)合成的子鏈。隨從鏈laggingstrand——合成方向與復(fù)制叉解鏈方向相反，并且是不連續(xù)合成的子鏈。

岡崎片段okazakifragment——

在DNA復(fù)制過程中，隨從鏈上初合成的不連續(xù)的DNA片段，長約1000bp。半不連續(xù)性復(fù)制

——在DNA復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制。

1）模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈2）底物(substrate)

：dATP、dGTP、dCTP、dTTP3）引物(primer)：復(fù)制需要一小段RNA作引物4）能源：需ATP供能5）酶和蛋白質(zhì)因子：DNA聚合酶(polymerase)等三、DNA復(fù)制的條件解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶（1）解鏈酶（helicase）作用：利用ATP供能，解開DNA雙鏈消耗2ATP/解開1bp

可隨復(fù)制叉的伸展向前移動也稱：解螺旋酶（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶

（topoisomerase，Topo）Topo：拓?fù)涫侵肝矬w或圖像作彈性位移而又保持物體不變的性質(zhì)分為TopoⅠ(減少負(fù)超螺旋)與TopoⅡ(引入負(fù)超螺旋)作用：松馳DNA超螺旋（開始前與復(fù)制過程中），克服扭結(jié)現(xiàn)象解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase，Topo）（3）單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

(singlestrandDNAbindingprotein)作用：能與DNA單鏈可逆的結(jié)合，其作用有二解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶也稱：DNA結(jié)合蛋白（DNAbindingprotein，DBP)①防止DNA復(fù)性②防止DNA單鏈模板被水解（4）引物酶（primase）模板以DNA單鏈為模板底物NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）按堿基配對原則（A=UG≡C）按5→3

方向解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DDDP-ⅢDDDP-Ⅰ連接酶作用：復(fù)制起始時催化生成RNA引物本質(zhì)：是一種RNA聚合酶（可以使兩個游離的NTP聚合，不同于催化轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶）

引發(fā)體引發(fā)體：解鏈酶，引物酶、RNA引物的復(fù)合體。（5）DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶

(DNAdependentDNApolymerase)簡稱：DNApol（DDDP）解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNAPOLⅢDNAPOLⅠ連接酶A.Kornberg試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)加有:模板、底物、引物該酶可催化新鏈DNA生成（5）DNA聚合酶DNApol主要作用：5→3的聚合活性解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNAPOLⅢDNAPOLⅠ連接酶dTTP3'3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppiT（5）DNA聚合酶機(jī)理：使核苷酸之間生成3，5磷酸二酯鍵主要作用：5→3的聚合活性模板以DNA雙鏈為模板底物dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物以小片段RNA為引物,

按堿基配對原則（A=TG≡C）按5→3

方向在RNA引物的

3

-OH末端上開始逐個添加dNTP解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNAPOLⅢDNAPOLⅠ連接酶解鏈方向35353′3′3′

先導(dǎo)鏈(leadingstrand)

隨從鏈(laggingstrand)岡崎片段5′3′5′3′5′3′DNA聚合反應(yīng)（新鏈生成）的特點(diǎn)需要模板

具方向性新鏈的延長5→3需要引物（5）DNA聚合酶E.coil大腸桿菌DNA聚合酶的作用DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ分子數(shù)/細(xì)胞4004020聚合的核苷酸數(shù)/分鐘100050150,000（2500bp/s）5→3的聚合√√√3→5的外切√√√5→3的外切√××主要作用切除引物填補(bǔ)空隙校讀損傷修復(fù)校讀損傷修復(fù)DNA復(fù)制校讀DNApolⅠ

由一條多肽鏈組成，含鋅原子，用蛋白酶有限水解DNApolⅠ（MW103KD）可得到大片段（MW68KD）與小片段（MW48KD）。大片段又稱為Klenow片段，具3′→5′外切酶性質(zhì)和聚合活性。小片段具5′→3′內(nèi)切酶的活性。DNA聚合酶的特點(diǎn)利于DNA復(fù)制的保真性.為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時的保真性主要與下列因素有關(guān)：

1．遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；

2．DNA聚合酶在復(fù)制時對堿基的正確選擇；

3．對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進(jìn)行校正。

DNApolⅢDNApolⅢ為異二聚體，全酶由10種亞基構(gòu)成，含鋅原子。核心酶由三種亞基構(gòu)成（α2ε2θ2）。α具有聚合活性，ε具有校對功能，θ具有組合核心酶的功能。β亞基有夾住DNA分子的作用。2個γ與δδ′τχψ構(gòu)成夾子裝置器，幫助β亞基夾住DNA。polⅢ結(jié)構(gòu)示意圖DNApolⅣ與DNApolⅤ1999年發(fā)現(xiàn)，DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時誘導(dǎo)產(chǎn)生。與DNA的錯誤傾向修復(fù)有關(guān)，結(jié)果是高突變率，但能克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變細(xì)胞得以存活。（6）DNA連接酶(DNAligase)作用：消耗ATP，將隨從鏈中相鄰的兩個DNA片段連接起來催化同一模板DNA鏈上的兩個相鄰DNA片段的3＇端與5＇端間形成磷酸二酯鍵，把相鄰的兩段DNA連成完整的鏈解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNApolⅢDNApolⅠ連接酶DNA連接酶ATPAMPHO5’3’5’3’3’5’5’3’DNA連接酶的作用機(jī)理能量：細(xì)菌為NAD，動物與噬菌體為ATP。反應(yīng)：ATP或NAD的AMP基團(tuán)首先轉(zhuǎn)移到酶上，然后轉(zhuǎn)移到缺口的5′-磷酸上，形成AMP-DNA，最后形成二酯鍵，釋放AMP。起始復(fù)合物與復(fù)制體四、DNA復(fù)制的過程解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNApolⅢDNApolⅠ連接酶起始延長終止Topo大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)

oriＣ由245bp構(gòu)成，其上有三個含GATC的13bp的重復(fù)序列，四個重復(fù)的9bp序列。作用是起始DNA的復(fù)制。大腸桿菌中與復(fù)制起始有關(guān)的因子DnaA（識別起點(diǎn)），DnaB（解鏈，活化引物酶），DnaC（幫助結(jié)合），HU（促進(jìn)起始），DnaG（引物酶），SSB，RNApol，DNA拓?fù)涿涪颍珼am甲基化酶（甲基化起點(diǎn)的GATC中之A）起點(diǎn)全甲基化后才能起始復(fù)制。剛合成的子代DNA是半甲基化的（新鏈未甲基化）延長:DNApolⅢ(DDDP-Ⅲ)的5→3的聚合活性使核苷酸之間生成3，5磷酸二酯鍵模板以DNA單鏈為模板底物

dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物

以小片段RNA為引物，在RNA引物的

3-OH末端上開始逐個添加dNTP按堿基配對原則

（A=TG≡C）按5→3

方向

DNA復(fù)制的過程解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNApolⅢDNApolⅠ連接酶起始延長終止5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polⅢ目錄DNA復(fù)制的過程解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB引物酶DNApolⅢDNApolⅠ連接酶起始延長終止555DNA-polⅠOHP5DNA-pol

ⅠdNTP55PATP

AMP+Pi55DNA連接酶終止:隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接復(fù)制的終止位點(diǎn)

在終止區(qū)含有多個22bp的復(fù)制終止子（Ter），與復(fù)制終止蛋白（Tus），二者結(jié)合合阻止復(fù)制叉前進(jìn)。復(fù)制終止后，約有50-100bp未復(fù)制，需填補(bǔ)完成。環(huán)狀DNA需Topo酶解環(huán)。過程

酶和蛋白作用復(fù)制的條件小結(jié)1：E.coli（原核生物）DNA復(fù)制

過程酶和蛋白作用復(fù)制的條件起始延長終止小結(jié)1：E.coli（原核生物）DNA復(fù)制

過程酶和蛋白作用復(fù)制的條件起始解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB(DBP)引物酶延長DNA-polⅢ終止DNA-polⅠDNA連接酶小結(jié)1：E.coli（原核生物）DNA復(fù)制

過程酶和蛋白作用復(fù)制的條件起始解鏈酶解開DNA雙鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶松馳超螺旋SSB(DBP)①防止復(fù)性②防止被水解引物酶合成RNA引物延長DNA-polⅢDNA鏈的延伸、校讀終止DNA-polⅠ切除引物,填補(bǔ)空隙,校讀DNA連接酶連接DNA片段

小結(jié)1：E.coli（原核生物）DNA復(fù)制

過程酶或蛋白作用條件起始DNA-polⅢ最初幾個堿基的加入模板，底物dNTP起始解鏈酶解開DNA雙鏈ATP拓?fù)洚悩?gòu)酶松馳超螺旋ATPSSB①防止復(fù)性②防止被水解引物酶合成RNA引物NTP延長DNA-polⅢDNA鏈的延伸、校讀底物dNTP終止DNA-polⅠ切除引物,填補(bǔ)空隙,校讀DNA連接酶連接岡崎片段

ATP或NAD小結(jié)1：E.coli（原核生物）DNA復(fù)制

幾個容易混淆的概念復(fù)制子：DNA復(fù)制的單位，含復(fù)制起始點(diǎn)，延長段和終止點(diǎn)。復(fù)制體：復(fù)制叉移動過程中所有蛋白質(zhì)因子和DNA的復(fù)合體。復(fù)制叉：復(fù)制解鏈部位的Y形結(jié)構(gòu)。復(fù)制眼：復(fù)制起始時，兩個復(fù)制叉構(gòu)成的泡狀結(jié)構(gòu)。第二節(jié)真核生物DNA的復(fù)制一、真核生物的DNA結(jié)構(gòu)：真核生物的DNA與組蛋白構(gòu)成染色質(zhì)，染色質(zhì)在復(fù)制期聚合成染色體，呈線形。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。核小體由組蛋白八聚體與DNA組成，長約200bp，相當(dāng)于1.2個負(fù)超螺旋。這決定了真核生物的岡崎片段長200bp左右。染色質(zhì)兩端有端粒結(jié)構(gòu)。

核小體的結(jié)構(gòu)二、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)：

1、多起點(diǎn)復(fù)制。如酵母的17個染色體含有400個復(fù)制起點(diǎn)（又稱自主復(fù)制序列，即ARS）。哺乳動物的復(fù)制子長約100-200kb，人的每個染色體平均有1000個復(fù)制子。

2、復(fù)制速度慢（1000-3000bp/min），約為原核生物的20-50分之一。

3、在全部復(fù)制完成之前不再開始新的復(fù)制。4、DNA復(fù)制需要5種聚合酶。分別為α、β、γ、δ、ε。其中α與δ為核DNA的復(fù)制酶，γ為線粒體DNA復(fù)制酶，β與ε為修復(fù)酶。RNA引物由RNaseH1，MF-1切掉，ε填補(bǔ)缺口。PCNA可形成夾子結(jié)構(gòu)。5、需要端粒酶的參與。人類的DNA多起點(diǎn)復(fù)制

每一條真核生物的染色體都是一條線狀雙鏈DNA分子，若每條染色體只有一個復(fù)制起點(diǎn)的話，在人的細(xì)胞中復(fù)制的速率為2Kb/min，那么將要花費(fèi)830小時才能完成一條染色體的復(fù)制，實(shí)際上人的細(xì)胞周期為72小時。若每個細(xì)胞的周期要比人類胚胎發(fā)育時間還要長的話，那么妊娠的時間就需要許多年而不是“十月”懷胎了。細(xì)菌和真核生物復(fù)制的比較生物復(fù)制子數(shù)復(fù)制子長度復(fù)制速率大腸桿菌14200kb50kb/min酵母50040kb3.6kb/min果蠅350040kb2.6kb/min植物35000300kb第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄一、定義：以RNA為模板,由RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）催化,合成DNA的過程。RNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜交分子二、逆轉(zhuǎn)錄酶：由勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)，具有三種酶的功能：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，核糖核酸酶H（RNaseH）。編碼基因包括：gag，pol，env。其中g(shù)ag編碼基質(zhì)、衣殼和核衣殼；pol編碼蛋白酶、整合酶與聚合酶；env編碼被膜蛋白。逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)三、逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳信息傳遞HIV

本病毒為愛滋病人（Aids）的病原體，系引起細(xì)胞病變的靈長類逆轉(zhuǎn)錄病毒之一，它于1983年Montaginer等首先從1例淋巴腺病綜合征患者分離到。隨后1984年美國Gallo等從愛滋病人分離到逆轉(zhuǎn)錄病毒。至1986年國際病毒命名委員統(tǒng)一稱為人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodificidncyVirus,HIV)。HIV主要型別為HIV-1和HIV-2，愛滋病大多由HIV