生物技術細胞工程

第三章細胞工程當前1頁，總共155頁。主要內容第一節(jié)概述第二節(jié)植物細胞工程第三節(jié)動物細胞工程第四節(jié)微生物細胞工程(發(fā)酵工程)當前2頁，總共155頁。第一節(jié)概述細胞工程概念2.細胞工程的發(fā)展3.細胞工程的基礎知識4.細胞工程的相關技術5.細胞工程的應用當前3頁，總共155頁。細胞工程（cellengineering）：在細胞水平上，采用類似工程設計的方法，運用精巧的細胞學技術，有計劃地改造遺傳結構，從而獲得特定的細胞及產(chǎn)物的有關理論和技術方法的學科。1.

細胞工程概念當前4頁，總共155頁。廣義的細胞工程

包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養(yǎng)技術狹義的細胞工程

指細胞融合和細胞培養(yǎng)技術。1.

細胞工程概念當前5頁，總共155頁。根據(jù)不同的研究層次，細胞工程分為染色體工程、染色體組工程、細胞質工程、和細胞融合工程1.

細胞工程概念當前6頁，總共155頁。染色體工程是按人們需要，添加，削減或替換生物染色體的技術，根據(jù)操作對象的不同，分為動物染色體工程和植物染色體工程。染色體組工程改變染色體組數(shù)的技術。如單倍體轉變?yōu)槎啾扼w，三倍體西瓜當前7頁，總共155頁。細胞質工程又稱細胞拆合工程，是通過物理或化學方法將細胞質與細胞核分開，再進行不同細胞間核質重新組合，重新建成新細胞細胞融合工程是利用自然或人工的方法使兩個或幾個不同細胞融合為一個細胞的過程當前8頁，總共155頁。根據(jù)研究對象不同，細胞工程可分為動物細胞工程植物細胞工程微生物細胞工程當前9頁，總共155頁。2、細胞工程的發(fā)展當前10頁，總共155頁。細胞工程的發(fā)展植物細胞培養(yǎng)起源：20世紀初20世紀30年代，植物細胞培養(yǎng)研究取得突破1955年，激動素能促使培養(yǎng)細胞分裂20世紀60年代，建立植物原生質體培養(yǎng)和融合技術20世紀70年代，外源基因能夠植入植物細胞體內1983年，第一個轉基因植物培育成功20世紀90年代后，轉基因植物進入產(chǎn)業(yè)化當前11頁，總共155頁。動物細胞工程起源于疫苗的生產(chǎn)，1920-1950年，開發(fā)出病毒或細菌疫苗1951年開發(fā)能促使動物細胞體外培養(yǎng)技術50年代以后開始大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)生物制品70年代基因基因重組和雜交瘤技術的研究1982年重組人胰島素研究成功，標志著細胞工程商業(yè)化的開始當前12頁，總共155頁。細胞工程的發(fā)展前景當前13頁，總共155頁。過程離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化植物激素：細胞分裂素、生長素再分化植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)條件：

含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時光照等。當前14頁，總共155頁。當前15頁，總共155頁。當前16頁，總共155頁。植物細胞A植物細胞B原生質體A原生質體B原生質體融合正在融合的原生質體再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株去細胞壁纖維素酶果膠酶物理方法化學方法：離心振動電刺激聚乙二醇細胞分裂植物組織培養(yǎng)植物細胞融合酶解法人工誘導方法過程當前17頁，總共155頁。白菜甘藍白菜－甘藍當前18頁，總共155頁。細胞分化和全能性

多細胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功能都不同的細胞群所組成。高等動、植物由受精卵細胞開始的胚胎發(fā)生過程隨著細胞分裂次數(shù)的增加而使得早期胚胎的細胞數(shù)量也增加許多。其中有些細胞在形態(tài)、結構和功能上逐漸發(fā)生了差異，這種細胞之間差異的發(fā)生過程就是細胞分化。個體發(fā)育的過程就是細胞分化的過程，個體的各種器官和組織都是通過細胞分化形成的。3.細胞工程的基礎知識當前19頁，總共155頁。爪蟾的細胞核移植實驗，證明細胞核的全能性當前20頁，總共155頁。4.

細胞工程的相關技術無菌操作技術細胞培養(yǎng)技術細胞融合技術細胞核移植胚胎移植染色體工程克隆當前21頁，總共155頁。無菌操作技術細胞工程的所有試驗都要求再無菌條件下進行，要求十分嚴格的無菌操作。1、無菌室；2、超凈工作臺；3、生物材料的消毒；4、試驗器械、器皿和藥品的滅菌。當前22頁，總共155頁。無菌操作室的滅菌與消毒緩沖間無菌室首次啟用的無菌室一般可采用福爾馬林熏蒸（5～6m2無菌室用KMnO450g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盤），冒濃煙，24hr，氨水中和至無甲醛味），經(jīng)常使用的無菌室在每次實驗前必須開啟紫外燈照射0.5至l小時，然后避光0.5至l小時后方可進入操作

當前23頁，總共155頁。無菌室上風口下風口當前24頁，總共155頁。緩沖間當前25頁，總共155頁。培養(yǎng)器材的消毒干熱滅菌法：玻璃器皿、金屬器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小時；濕熱滅菌法：橡膠制品、無菌衣、帽和口罩以及除菌過濾器的清毒，高壓蒸汽滅菌115℃20—30分鐘；紫外線照射滅菌：多孔培養(yǎng)板的滅菌－30分鐘。抽濾除菌：培養(yǎng)基等（培養(yǎng)基通過0.22m過濾裝置－除菌）當前26頁，總共155頁。細胞培養(yǎng)技術

細胞培養(yǎng)是指動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件的保存和生長。1、取材和除菌；2、配制培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進行滅菌；3、接種、培養(yǎng)和傳代。當前27頁，總共155頁。兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生分子重排，導致細胞合并、染色體等遺傳物質重組的過程稱為細胞融合。細胞融合技術的主要過程：1、制備原生質體；2、誘導細胞融合；3、篩選雜合細胞。細胞融合技術當前28頁，總共155頁。細胞核移植：利用顯微操作技術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中，或將兩個細胞的細胞核(或細胞質)進行交換，從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種的一項技術。細胞核移植童魚——世界上第一條沒有父母的魚“鯽金核質雜交魚”當前29頁，總共155頁。也稱受精卵移植，是指把優(yōu)良種畜的早期胚胎從供體母畜體內取出來，移到受體母畜的輸卵管或子宮，“借腹懷胎”繁殖后代的技術。它是首先應用于繁殖家畜而發(fā)展起來的一種生物工程。試管嬰兒胚胎移植當前30頁，總共155頁。克隆是指生物體通過細胞進行無性繁殖形成基因型完全相同的后代個體，簡稱“無性繁殖”。例：多莉、克隆猴治療性克隆

克隆技術當前31頁，總共155頁。多利

克隆猴當前32頁，總共155頁。277次乳腺細胞核移植實驗；獲得29個發(fā)育為8細胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。當前33頁，總共155頁。預想的克隆人技術路線當前34頁，總共155頁。5.

細胞工程的應用通過細胞培養(yǎng)物獲得藥物和其他有用的物質如人參皂甙通過植物細胞和組織培養(yǎng)獲得快速繁殖的無性系植物產(chǎn)品，包括良種苗木、名貴花卉、稀有資源等如蘭花細胞融合產(chǎn)品如單克隆抗體、番茄薯“二層樓”從細胞培養(yǎng)中篩選合乎希望的突變細胞株、再生突變植株，可培育新品種生殖工程上的應用如借腹懷胎、試管嬰兒

當前35頁，總共155頁。當前36頁，總共155頁。美夢終究沒有成功!!番茄薯“二層樓”當前37頁，總共155頁。第二節(jié)植物細胞工程1.植物組織培養(yǎng)2.

植物細胞培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)3.單細胞分離技術4.植物體細胞雜交5.植物細胞原生質體制備與融合6.單倍體植物的誘發(fā)與利用7.人工種子當前38頁，總共155頁。1.

植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)（概念）是在無菌和人為控制外因（營養(yǎng)成分、光、溫度、濕度）條件下，研究、培養(yǎng)植物組織器官，甚至進而從中分化、發(fā)育出整體植株的技術。植物細胞的全能性（理論基礎）

指具有完整細胞核的植物細胞，在一定條件下能不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的潛在能力。當前39頁，總共155頁。1.

植物組織培養(yǎng)的相關概念脫分化

植物分化細胞進入細胞分裂周期，形成愈傷組織。再分化

脫分化的組織或細胞在一定的條件下可分化為各種不同組織的細胞類型。愈傷組織植物組織表面形成的一團無序生長的薄壁細胞團。外植體

能被誘發(fā)產(chǎn)生無性增殖系的器官或組織切段。當前40頁，總共155頁。初代培養(yǎng)最初建立的外植體的無菌培養(yǎng)階段繼代培養(yǎng)將已形成愈傷組織或已分化出根、莖、葉、花等的培養(yǎng)物重新切割，轉移到新的培養(yǎng)基上以進一步擴大培養(yǎng)試管苗通過組織培養(yǎng)所獲得的再生植株當前41頁，總共155頁。植物細胞工程的基礎技術無菌操作技術組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)花藥及花粉培養(yǎng)離體胚培養(yǎng)原生質體培養(yǎng)當前42頁，總共155頁。植物組織培養(yǎng)應用試管苗的快速繁殖無病毒植物的培育提取次生代謝產(chǎn)物人工種子的培育轉基因植物的生產(chǎn)當前43頁，總共155頁。植物組織培養(yǎng)的研究意義運用組織培養(yǎng)方法可以在人為的條件下研究細胞、組織或器官的繁殖、生長和分化，研究環(huán)境條件對植物生長發(fā)育的影響。在工廠化育苗技術上，組織培養(yǎng)是工廠化育苗的生產(chǎn)配方研究和無病毒種苗擴繁必須經(jīng)歷的階段；細胞培養(yǎng)技術在中草藥方面的研究不僅可以探索藥用植物生理遺傳和成分生物合成等一系列理論問題，而且還可以為大規(guī)模細胞發(fā)酵生產(chǎn)藥物提供理論依據(jù)和技術參數(shù)；在轉基因植物種苗的研究與開發(fā)中，組織培養(yǎng)技術即是基本的研究手段，又是規(guī)模開發(fā)的基本生產(chǎn)形式。當前44頁，總共155頁。外植體愈傷組織新植株當前45頁，總共155頁。1.

植物組織培養(yǎng)進行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個階段：1.預備階段；2.誘導去分化階段；3.繼代增殖階段；4.生根成芽階段；5.移栽成活階段。當前46頁，總共155頁。預備階段(1)選擇合適的外植體；外植體的部位、年齡及大小。(2)除去病原菌及雜菌；對外植體除菌的一般程序如下：外植體自來水多次漂洗消毒劑處理無菌水反復沖洗無菌濾紙吸干(3)配制適宜的培養(yǎng)基。當前47頁，總共155頁。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分無機營養(yǎng)物，包括氮、磷、鉀、鈣、硫和鎂等大量元素以及一些微量元素如錳、鋅、銅、鐵、硼碳源，如糖類，2％~4%的蔗糖或葡萄糖是適宜的碳源。維生素，維生素B1(硫胺素)是必需的。當前48頁，總共155頁。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分生長調節(jié)劑(植物激素)植物生長素，如IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸)。細胞分裂素，如BAP(芐氨基嘌呤)、6-BA(芐基腺嘌呤)、2-ip(異戊烯氨基嘌呤)、激動素(呋喃氨基嘌呤)。有機附加物，一般是蛋白質水解物、酵母提取物、麥芽提取物和椰汁。當前49頁，總共155頁。培養(yǎng)環(huán)境條件光照強度、光質、光周期溫度24-28度；最佳24-26度相對濕度容器相對濕度高達96%-100%；培養(yǎng)室70%-80%當前50頁，總共155頁。誘導去分化階段使各種細胞重新處于旺盛有絲分裂的分生狀態(tài)，培養(yǎng)基中應添加較高濃度的生長素，其結果形成愈傷組織。當前51頁，總共155頁。繼代增殖階段繼代培養(yǎng)及時分離愈傷組織成適當大小轉移到新配制的培養(yǎng)基上，促進愈傷組織生長增殖。當前52頁，總共155頁。生根成芽階段誘導胚狀體的形成。胚狀體：在組織培養(yǎng)中分化產(chǎn)生的具有芽端和根端類似合子胚的構造。該階段需細胞分裂素和光照。當前53頁，總共155頁。咖啡的愈傷組織咖啡的胚狀體當前54頁，總共155頁。移栽成活階段適度的光、溫、濕條件?？稍谌斯夂蚴抑绣憻捯欢螘r間。當前55頁，總共155頁。煉苗的原因試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度，近100%的相對濕度環(huán)境條件下生長從葉片上看，試管苗的角質層不發(fā)達，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗

當前56頁，總共155頁。石斛組培苗煉苗當前57頁，總共155頁。組織培養(yǎng)的應用脫毒快速繁殖

快速繁衍珍稀瀕危植物、名優(yōu)特新品種和脫毒苗。植物種質資源的保存、挽救瀕于滅絕的植物通過花藥和花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株、縮短育種年限當前58頁，總共155頁。脫毒原因：大多數(shù)農(nóng)作物，特別是通過無性繁殖的植物，受到一種或多種病毒的侵染，導致產(chǎn)量和品質下降。外植體：莖尖或頂端分生組織有時莖尖培養(yǎng)需要與熱處理或化學處理方法結合，才能起到有效的脫毒結果。脫毒苗：利用組織培養(yǎng)獲得的無病毒植株。當前59頁，總共155頁。草莓當前60頁，總共155頁?？焖俜敝持参锝M培苗快速繁殖的四個階段無菌苗的建立組培苗的增殖生根移栽當前61頁，總共155頁。百合當前62頁，總共155頁。組培室當前63頁，總共155頁。大花蕙蘭當前64頁，總共155頁。種質資源的保存保存一個細胞就相當與保存一粒種子，但所占的空間僅為原來的幾萬分之一，而且在-193度的液氮中可以長時間保存，不像種子那樣需要年年更新或經(jīng)常更新。

當前65頁，總共155頁。獲得單倍體植株、縮短育種年限通過花藥和花粉組織培養(yǎng)可以獲得單倍體植物，大大縮短了育種時間。使新品種的培育過程大大簡化當前66頁，總共155頁。2.

植物細胞培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)植物細胞培養(yǎng)的發(fā)展植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)植物細胞培養(yǎng)的應用當前67頁，總共155頁。植物細胞培養(yǎng)的發(fā)展1956年，Routier和Nickell提出工業(yè)化培養(yǎng)植物細胞以提取其天然產(chǎn)物。之后，用此方法生產(chǎn)了哈爾堿、人參皂角苷、維斯納精、紫杉醇等。目前，最大批量工業(yè)化培養(yǎng)細胞(煙草細胞)已達20噸。我國，培養(yǎng)紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉醇(抗腫瘤)當前68頁，總共155頁。植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)適于大量快速地增殖細胞，但不利于次生物質的積累。固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)細胞生長緩慢而次生物質含量高。當前69頁，總共155頁。懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮細胞的來源：愈傷組織需分散細胞，其方法：用果膠酶打破細胞間的連接增加生長激素的濃度，加快細胞分裂和生長速度起始培養(yǎng)把已建立的愈傷組織轉移到適當容器里的液體培養(yǎng)基中，然后置于搖床上不斷振蕩。當前70頁，總共155頁。進液管排液管進氣管出氣管封閉式植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點：結構簡單，易于操作缺點：次生代謝物積累較少當前71頁，總共155頁。固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)固定化細胞方法：包埋、吸附載體：海藻酸鈣、K-角叉菜膠、瓊脂及瓊脂糖、聚丙烯酸凝膠、纖維膜、硅藻土、中空纖維、陶瓷等固定化細胞培養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)：平床培養(yǎng)系統(tǒng)、立柱培養(yǎng)系統(tǒng)當前72頁，總共155頁。平床培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點：設備簡單，能更有效的合成次生代謝產(chǎn)物缺點：占地面積大，次生代謝產(chǎn)物累計不均勻，氧氣供應有限當前73頁，總共155頁。立柱培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點：次生代謝產(chǎn)物的合成度增強，占地面積小當前74頁，總共155頁。固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點：穩(wěn)定反應槽內的細胞量，使反應活性穩(wěn)定，能長期連續(xù)運行；能提高反應效率在生物反應器中固定化細胞的密度比懸浮培養(yǎng)密度增加2~4倍包埋細胞抵抗剪切的能力增強，可使用簡單的生物反應器當前75頁，總共155頁。固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)固定化細胞培養(yǎng)使細胞與培養(yǎng)基隔離，下游加工胞內產(chǎn)物得到簡化，產(chǎn)物易于細胞分離。細胞生長和有效產(chǎn)物形成不偶聯(lián)，優(yōu)化產(chǎn)物形成而不影響細胞生長。使培養(yǎng)液的粘度極大降低，避免了懸浮培養(yǎng)中出現(xiàn)的細胞結團和透氣差的問題。當前76頁，總共155頁。3.單細胞分離技術

機械法酶解法當前77頁，總共155頁。機械法葉片消毒－撕取也表皮暴露葉肉細胞－刮取細胞－培養(yǎng)葉片消毒－過濾、離心凈化細胞－培養(yǎng)當前78頁，總共155頁。酶解法果膠酶處理細胞，使細胞游離出來酶解液的滲透壓偏低，會造成原生質體在細胞內崩解當前79頁，總共155頁。當前80頁，總共155頁。4.植物體細胞雜交

用兩個來自不同植物的體細胞融合成一個雜種細胞，且把雜種細胞培育成新的植物體的方法稱為植物體細胞雜交當前81頁，總共155頁。植物細胞A植物細胞B原生質體A原生質體B原生質體融合正在融合的原生質體再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株去細胞壁纖維素酶果膠酶物理方法化學方法：離心振動電刺激聚乙二醇細胞分裂植物組織培養(yǎng)植物細胞融合酶解法人工誘導方法過程當前82頁，總共155頁。5.植物細胞原生質體制備與融合原生質體的制備原生質體的融合雜合體的鑒別與篩選當前83頁，總共155頁。原生質體的制備取材與除菌材料來源植物的各組織和器官主要來源：葉片、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞、莖尖、根尖、子葉、胚性組織細胞(花粉)除菌肥皂水－清水（3）－酒精（70％）－次氯酸鈉（3％）當前84頁，總共155頁。原生質體的制備酶解常用的酶：纖維素酶、果膠酶、崩潰酶、半纖維素酶、蝸牛酶需要在酶液中加入適量的滲透穩(wěn)定劑，常用的滲透穩(wěn)定劑是甘露醇和山梨醇等糖醇。

分離過濾、低速離心、比重漂浮當前85頁，總共155頁。原生質體的制備洗滌鑒定形態(tài)觀察臺盼藍、熒光素雙醋酸酯當前86頁，總共155頁。分離原生質體步驟當前87頁，總共155頁。當前88頁，總共155頁。熒光顯微鏡下的原生質體煙草當前89頁，總共155頁。原生質體的融合原生質體融合也稱體細胞雜交，就是使分離下來的不同親本的原生質體之間在人工控制的條件下，像性細胞受精作用那樣互相融合成一體。

常用的融合方法化學法誘導融合物理誘導融合當前90頁，總共155頁。化學法誘導融合聚乙二醇(PEG)結合高鈣高pH誘導融合法雙親原生質體滴加PEG滴加高鈣高pH溶液洗滌離心篩選，再生當前91頁，總共155頁。PEG介導當前92頁，總共155頁。物理誘導融合電融合電融合處理一般可分兩步進行，先給兩極交變電流，產(chǎn)生電泳效應，使原生質體沿著電場的方向排列成串珠狀，這時再給予瞬間的高強度電脈沖，使原生質體膜局部破損而導致融合。

當前93頁，總共155頁。電融合當前94頁，總共155頁。上圖：電流作用下原生質體排成列右上：兩個原生質體融合右下：三個原生質體融合當前95頁，總共155頁。雜合體的鑒別與篩選雜合細胞的顯微鑒別利用親本原生質體大小、顏色的差異互補篩選雜合細胞遺傳互補法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，使雜種細胞表現(xiàn)正常功能如白化互補(aaBB×AAbb)當前96頁，總共155頁。雜合體的鑒別與篩選互補篩選雜合細胞生長互補法：利用原生質體對培養(yǎng)基成分要求與反應的差異性來選擇雜種細胞的方法抗性互補篩選法：利用親本原生質體對抗生素、除草劑及其他有毒物質的抗性差異來選擇雜種細胞代謝互補法當前97頁，總共155頁。親本細胞1親本細胞2同型融合細胞異核融合細胞未融合細胞含藥物A和B的培養(yǎng)基存活死亡死亡對藥物B敏感對藥物A敏感當前98頁，總共155頁。雜合體的鑒別與篩選利用細胞與分子生物學的方法鑒別雜合體根據(jù)融合處理后再生長出的植株的形態(tài)特征進行鑒別當前99頁，總共155頁。6.

單倍體植物的誘發(fā)與利用單倍體生物是指細胞中僅含一組染色體的個體。單倍體植物種質純，不受顯性等位基因的掩蓋與遮蔽效應影響，人們易于從中挑選出具有可用性狀的隱性突變體，其經(jīng)濟意義十分顯著。自然發(fā)生途徑？當前100頁，總共155頁。6.

單倍體植物的誘發(fā)與利用實驗室誘導單倍體植株的途徑花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)雜交法獲單倍體植株當前101頁，總共155頁。花藥培養(yǎng)

選取成熟度適中的花蕾或幼穗?；ㄋ庮A處理：高滲，高溫或低溫。選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件。當前102頁，總共155頁?；ǚ叟囵B(yǎng)由于花藥培養(yǎng)時一些二倍體的花藥壁細胞也形成愈傷組織，從而增加了培育單倍體植株的難度。1974年Nitsch等首創(chuàng)用擠壓法分離花粉進行培養(yǎng)的方法，只得到約5%的花粉植株。1977年，Sunderland等提出了自然散開法收集花粉的方法，使花粉成株率有所提高，但與花藥培養(yǎng)相比仍低得多。當前103頁，總共155頁。未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)

子房、胚珠中的成熟胚囊由6個單倍體細胞（包括一個卵細胞）和一個具兩個極核的中央細胞構成。1976年，SanNoeum首先從大麥未授粉子房培養(yǎng)獲單倍體植株。由于誘導出的植株大多是單倍體綠苗，因此這可能是一個發(fā)展方向。當前104頁，總共155頁。雜交法獲單倍體植株

雜交，特別是遠源雜交，雜種胚在胚胎發(fā)育過程中往往會將一方親本的染色體逐步排出，最終將得到僅含一方染色體的單倍體植物。1970年Kasha利用該原理將球莖大麥與普通大麥雜交，培育出了普通大麥的單倍體胚和植株。由本方法得出的單倍體胚長成的植株都是綠苗，這是本法的突出優(yōu)點。當前105頁，總共155頁。單倍體培養(yǎng)物的加倍在誘發(fā)單倍體植株的各階段（愈傷組織、幼胚及小苗），都可用0.2%—0.4%秋水仙素處理24-48小時，然后按常規(guī)途徑培養(yǎng)，即可獲得染色體加倍的能正常開花、結果的二倍體植株。當前106頁，總共155頁。7.

人工種子的研制人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素以及其他成分的人工膠囊。當前107頁，總共155頁。人工種子的構成及特點人工胚乳胚狀體人工種皮當前108頁，總共155頁。人工種子的構成及特點人工種子具有以下突出的優(yōu)點：不受環(huán)境因素制約，可以進行工廠化生產(chǎn)；經(jīng)無性繁育產(chǎn)生，有利于保存優(yōu)良性狀；與試管苗相比，成本更低，適合機械化耕種；可根據(jù)需要在人工胚乳中添加營養(yǎng)物、農(nóng)藥等。當前109頁，總共155頁。人工種子的制備胚狀體的制備及其同步生長人工胚乳的制備配制包埋劑及包埋當前110頁，總共155頁。胚狀體的制備及其同步生長誘導胚狀體同步化生長的措施：低溫法抑制劑法：DNA合成抑制劑分離法通氣法：氮氣、乙烯滲透壓法自然干燥4-7天當前111頁，總共155頁。人工胚乳的制備常用的人工胚乳：MS(SH、White)培養(yǎng)基+馬鈴薯淀粉水解物0.5×SH培養(yǎng)基+麥芽糖當前112頁，總共155頁。配制包埋劑及包埋海藻酸鈉中添加營養(yǎng)成分CaCl2溶液中形成人工種皮約10分鐘，使之固化無菌水沖洗后即可播種當前113頁，總共155頁。人工種子的貯存與萌發(fā)人工種子的貯存與萌發(fā)使迄今尚未攻克的難關。一般要將人工種子保存在低溫（4-7℃）、干燥（<67%相對濕度）條件下。費用昂貴。當前114頁，總共155頁。挪威云杉的人工種子當前115頁，總共155頁。桉樹的人工種子（發(fā)芽中）當前116頁，總共155頁。第三節(jié)動物細胞工程1.

細胞組織培養(yǎng)2.

動物細胞融合3.

單克隆抗體技術4.

細胞拆合5.干細胞工程當前117頁，總共155頁。動物細胞工程理論基礎胚胎干細胞與全息胚學說-細胞全能性動物細胞工程與植物細胞工程的比較目的，技術手段，理論基礎，誘導手段等當前118頁，總共155頁。當前119頁，總共155頁。動物細胞工程技術手段一、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術1、培養(yǎng)條件：35-37度2、培養(yǎng)方式：貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)3、抗凋亡技術當前120頁，總共155頁。細胞培養(yǎng)法組織培養(yǎng)法培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物的長期保存1.細胞組織培養(yǎng)當前121頁，總共155頁。大多數(shù)動物細胞具有貼壁生長的特性，其大規(guī)模培養(yǎng)方法有：微導管培養(yǎng)法微載體培養(yǎng)法葡聚糖聚合物微膠囊培養(yǎng)法褐藻酸鈉細胞培養(yǎng)法當前122頁，總共155頁。組織培養(yǎng)法將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰新潔爾滅浸泡消毒，迅速進入無菌室。

當前123頁，總共155頁。將小白鼠置超凈工作臺上，打開腹腔

當前124頁，總共155頁。用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪，當前125頁，總共155頁。剪碎組織當前126頁，總共155頁。接種組織塊當前127頁，總共155頁。移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止2～3小時，然后將細胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。當前128頁，總共155頁。24～48小時后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養(yǎng)液變成紫色，一般細胞生長不好，則培養(yǎng)液pH過高；若培養(yǎng)液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯示細胞生長良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時見細胞自組織邊緣長出。繼續(xù)培養(yǎng)3～5日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)3～4天，細胞貼滿細胞培養(yǎng)瓶壁時便可進行傳代培養(yǎng)。觀察當前129頁，總共155頁。培養(yǎng)物的傳代懸浮培養(yǎng)的細胞：定期將其轉移到新鮮培養(yǎng)基中組織培養(yǎng)物：需剝離組織當前130頁，總共155頁。經(jīng)典傳代法冷凍保存(液氮)5%-10%的二甲亞砜(DMSO)10%玻璃化保護劑(PVS2)培養(yǎng)物的長期保存當前131頁，總共155頁。2、動物細胞融合用自然或人工的方法使兩個或幾個不同細胞融合為一個細胞（含有原來2個細胞的染色體）的過程。親緣較遠的生物體之間是無法正常雜交的，但他們之間的體細胞卻往往能彼此融合，產(chǎn)生出雜種細胞當前132頁，總共155頁。細胞融合的意義1、克服植物遠緣雜交不親和性、2、擴大遺傳重組范圍、增加變異、創(chuàng)造新品種3、單克隆抗體的生產(chǎn)當前133頁，總共155頁。動物細胞融合有以下三條途徑：

病毒誘導融合化學誘導融合電激誘導融合當前134頁，總共155頁。常用的病毒：

副粘液病毒(副流感病毒如仙苔病毒)、天花病毒、皰疹病毒等促融機制：靠病毒表面含有神經(jīng)氨酸酶一些突起的作用病毒誘導融合當前135頁，總共155頁?；瘜W誘導融合常用的促融劑：

聚乙二醇(PEG)促融機制：PEG降低細胞表面的極性，導致脂雙層不穩(wěn)定，引起細胞融合當前136頁，總共155頁。3.單克隆抗體技術基本原理單抗制備流程當前137頁，總共155頁。淋巴細胞雜交瘤技術：是將可以分泌單一抗體的淋巴細胞與可以無限增殖的骨髓瘤細胞融合，獲得兼具兩種細胞特性的雜交細胞。這種細胞可以大量增殖并產(chǎn)生純一的抗體，即單克隆抗體。這一技術被譽為免疫學上的一次重大革命。單克隆抗體：由單一克隆的B淋巴細胞產(chǎn)生的抗單一抗原的高度特異性抗體，具有專一性強、質地均一、反應靈敏、可大規(guī)模生產(chǎn)等特點基本原理當前138頁，總共155頁?；驹硗ㄟ^融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。兩種細胞：骨髓瘤細胞特征：再培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺失脾淋巴細胞(經(jīng)抗原免疫)特征：分泌抗體功能和能夠在選擇培養(yǎng)基上生長融合后，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆當前139頁，總共155頁。單抗制備流程當前140頁，總共155頁。當前141頁，總共155頁。4.細胞拆合從不同的細胞中分離出細胞器及其成分，在體外將它們重新組裝成具有生物活性的細胞或細胞其的過程稱為細胞拆合。包括核移植和染色體轉移等。當前142頁，總共155頁。

核移植進行核移植研究的目的：異種核質關系研究；中間性狀魚細胞核遺傳全能性的研究。胚胎早期細胞、體細胞當前143頁，總共155頁。爪蟾的細胞核移植實驗，證明細胞核的全能性當前144頁，總共155頁。動物克隆可以分為三個階段：同種胚胎細胞克隆動物同種體細胞克隆動物異種體細胞克隆動物當前145頁，總共155頁。同種胚胎細胞克隆動物1981年Illmenses率先報告用小鼠幼胚細胞核克隆出正常小鼠。隨后，1984年Willadsen用未成熟羊胚細胞核克隆出一頭羊。當前146頁，總共155頁。同種體細胞克隆動物

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