第四、五章噬菌體載體及粘粒及目的基因的準(zhǔn)備、重組及重組子的鑒定

J基因到N基因—非必要區(qū)段占DNA總長(zhǎng)度的1/3本文檔共37頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分三、噬菌體的體外包裝*重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染(transfection)作用105~106噬菌斑/gDNA*體外包裝轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)本文檔共37頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分天然包裝過程本文檔共37頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分體外包裝過程尾部突變-頭頭部突變-尾E-72%E--累積尾部蛋白D-與DNA進(jìn)入頭部及頭部成熟有關(guān)D--累積頭部蛋白本文檔共37頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分四、凱倫噬菌體載體(charon)兩類特點(diǎn)：酶切位點(diǎn)多、含LacZ、容量大克隆程序:分離線性噬菌體DNA-酶切分離左右臂+中央?yún)^(qū)段-與外源DNA混合-包裝幾kb~23kb噬菌體載體及派生載體的優(yōu)點(diǎn)：感染效率高本文檔共37頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分五、柯斯質(zhì)粒載體1、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建定義：(cossite-carryingplasmid)eg.pHC79(+pBR322)cos+與噬菌體包裝有關(guān)的序列ori+Ampr+Tetr容量：31~45kb本文檔共37頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分2、柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)*具有噬菌體的特性（環(huán)化）*具有質(zhì)粒載體的特性*高容量3、柯斯克隆優(yōu)點(diǎn)：容量大、非重組體少問題：分子內(nèi)重組成多聚體（堿性磷酸酶處理）基因間連接（電泳分級(jí)分離）本文檔共37頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分六、單鏈DNA噬菌體載體*M13、f1、fd*優(yōu)點(diǎn)：雙鏈復(fù)制型、單雙鏈均可轉(zhuǎn)染宿主、顆粒大小受DNA多寡制約、易測(cè)出插入方向*M13克隆體系特性：LacZ、誘導(dǎo)及組成型的LacZ、成對(duì)構(gòu)建（M13mp8、M13mp9）

本文檔共37頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分七、噬菌體展示載體(phagedisplay)絲狀噬菌體（M13/fd)表面-3~5拷貝geneIII產(chǎn)物-顆粒組裝及F性須吸附G.P.Smith-1985建立-在噬菌體表面表達(dá)蛋白應(yīng)用：噬菌體表面展示文庫*原理*分離hGH變體本文檔共37頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分八、噬菌粒載體(phasmid)M13類的缺陷：-插入后遺傳穩(wěn)定性下降，且與片段大小有關(guān)-實(shí)際上總以正向插入-容量有限（1500bp）改進(jìn)的M13類-噬菌粒-分子小：3kb-容量10kb-雙向性（細(xì)菌質(zhì)粒和phage）本文檔共37頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分T3+T7本文檔共37頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分1、噬菌體載體的類型及其比較。2、噬菌體的體外包裝原理。3、什么是凱倫噬菌體載體？有怎樣的特點(diǎn)？4、什么是柯斯質(zhì)粒載體？有怎樣的特點(diǎn)？5、單鏈DNA噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)。6、噬菌體展示載體的工作原理。7、噬菌粒載體的特點(diǎn)。復(fù)習(xí)提綱本文檔共37頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分第五章目的基因的準(zhǔn)備、重組及重組子的鑒定一、cDNA基因文庫的構(gòu)建（匯集生物體所有cDNA序列的重組DNA群體）1、cDNA基因文庫的優(yōu)點(diǎn)：病毒RNA篩選簡(jiǎn)單表達(dá)測(cè)定基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子外顯子）、時(shí)間調(diào)節(jié)基因表達(dá)特征分析2、缺點(diǎn)：無調(diào)節(jié)序列低豐度mRNA克隆難本文檔共37頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分

Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/g)特異mRNA拷貝數(shù)/總mRNA種類可克隆片段大小/基因組總長(zhǎng)度mRNA豐度克隆基因的大小(載體容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x105本文檔共37頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分3、RNA的制備及純化總RNA的提取mRNA的純化-oligodT-纖維素柱層析特異mRNA的富集（mRNA分級(jí)分離、蔗糖密度梯度離心）特異mRNA的分析鑒定*mRNA體外翻譯（麥胚、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞）*RNA電泳-NorthernBlot本文檔共37頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分4、cDNA兩鏈的合成5、雙鏈cDNA分子與載體的連接*同聚物加尾*linker-連接子6、重組體導(dǎo)入宿主轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電脈沖本文檔共37頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分RNaseH方法本文檔共37頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分Self-priming本文檔共37頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分同聚物加尾本文檔共37頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分重組-linker本文檔共37頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分二、cDNA基因文庫的篩選與特異重組體的鑒定1、遺傳檢測(cè)*利用載體提供的表型特征*插入基因功能表達(dá)2、物理檢測(cè)*凝膠電泳本文檔共37頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分3、核酸探針（screeningalibrary)本文檔共37頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分4、免疫化學(xué)檢測(cè)*標(biāo)記抗體探針*免疫沉淀5、轉(zhuǎn)譯篩選法*雜交抑制的轉(zhuǎn)譯-豐富mRNA*雜交選擇的轉(zhuǎn)譯-低豐度mRNA-insulin6、正負(fù)篩選法組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達(dá)差異本文檔共37頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分本文檔共37頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\14點(diǎn)51分三、基因組DNA文庫的構(gòu)建與篩選1、基因組DNA文庫：匯集生物體所有DNA序列的重組DNA群體2、目的研究結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控序列基因組結(jié)構(gòu)3、目的基因的準(zhǔn)備*限制酶切法-鳥槍法(shot-gunapproach)霰彈法*DNA超聲隨機(jī)切斷*限制酶部分酶切----比較本文檔共37頁；當(dāng)前第34頁；編輯