痰標(biāo)本的前處理

痰標(biāo)本的前處理方法消化一除菌（美國(guó)CDC建議方法）1.N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法（NALC-NaOH）（使用3D培養(yǎng)儀，推薦）N-乙酰-L-半胱胺酸是一種黏液溶解劑，可用來(lái)快速地將痰標(biāo)本消化，并除去雜菌，NaOH在痰標(biāo)本中的最終濃度為1%。在標(biāo)本處理液中乙酰半胱胺酸會(huì)很快地失去活性，因此消化液應(yīng)每日新鮮配制。消化液中會(huì)含有吸附了重金屬離子的檸檬酸鈉，它可以使乙酰半胱胺酸失去活性。* 所需材料N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉溶液（NALC-NaOH）離心管，50ml培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基，參閱書中7H-10或7H-11；蛋黃培養(yǎng)基，查閱Lowentein-Jensen（LJ）或美國(guó)Trudeau學(xué)會(huì)0.067M磷酸緩沖液，pH6.8或無(wú)菌蒸餾水。0.2%牛白蛋白鹽水溶液試劑準(zhǔn)備1）將NaOH和檸檬酸鈉混合均勻（見(jiàn)表一）放帶有螺旋蓋子的燒瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?dāng)加入乙酰半胱胺酸后，此標(biāo)本處理液應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)使用，因?yàn)橐阴０腚装匪峋弥煤髸?huì)失去液化活性。表一NALC-NaOH消化處理液的配制消化液體積4%NaOH*檸檬酸鈉2H2O**NALC(ml)(ml)(ml)（克）5025250.2510050500.520010010015002502502.5010005005005.00*4.0克NaOH加到100ml蒸餾水中**2.9克檸檬酸鈉2H2O（或2.6克無(wú)水檸檬酸鈉）加到100ml蒸餾水中2） 0.067M磷酸緩沖液，pH6.8儲(chǔ)存液：（a）磷酸氫二鈉：將9.47克無(wú)水Na2HPO4溶解于1升蒸餾水中。（b）將9.07克KH2PO4溶解于1升蒸餾水中。pH6.8緩沖液：將50ml（a）液與50ml（b）液混合，調(diào)整pH至6.8。加入⑴液或b液可分別增加或降低溶液的pH值。3） 0.2%牛白蛋白液（使用3D培養(yǎng)瓶培養(yǎng)無(wú)須此試劑）2%儲(chǔ)存液：將0.85克NaCL溶解在100ml蒸餾水中，加入2克牛白蛋白片斷V,用旋渦振蕩混勻，或用磁性攪拌器輕輕攪拌混勻。用4%NaOH調(diào)整pH為6.8,用過(guò)濾膜或Seitz過(guò)濾除菌。0.2%應(yīng)用液：將上述儲(chǔ)存液用0.85%無(wú)菌鹽水作1：10的稀釋。痰標(biāo)本的處理過(guò)程將不超過(guò)10ml的痰標(biāo)本加入到50ml的塑料離心管內(nèi)，加入等體積的NALC-NaOH溶液。可使用同一臺(tái)離心機(jī)處理多個(gè)標(biāo)本（例如，同時(shí)處理8個(gè)標(biāo)本）。加入消化液后，旋緊離心管的蓋子，用攪拌器充分混勻至標(biāo)本液化為止（約5-20秒/管），顛倒混勻離心管，以確保NALC-NaOH溶液與管內(nèi)標(biāo)本充分接觸。注意：避免極劇烈的震動(dòng)，以減少乙酰半胱胺酸的氧化及失活。將離心管放室溫15分鐘除菌。為達(dá)到更佳的除菌效果，可將NaOH的濃度增加至5%-6%，而不是增加標(biāo)本消化處理時(shí)間。用無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌磷酸緩沖液（pH6.8）將已消化一除菌的標(biāo)本稀釋至離心管上50ml的標(biāo)志處，在標(biāo)本離心之前減少NaOH的繼續(xù)作用，防止分支桿菌被破壞。蓋緊蓋子，旋渦震蕩或顛倒混勻。3000Xg離心15分鐘（適當(dāng)RCF結(jié)合時(shí)間可獲得95%的沉淀），最好使用能密封的離心杯，以防止氣溶膠播散。如無(wú)這種可密封的離心杯，可適當(dāng)調(diào)整離心過(guò)程，可參照Hall的方法。離心后，將上清液倒入盛有消毒劑的容器內(nèi)，用侵過(guò)消毒劑的紗布擦凈試管的邊緣，再蓋上試管蓋子。在沉淀物中加入1-2ml的磷酸緩沖液（用于3D培養(yǎng)）或0.2%的牛白蛋白溶液（用于涂片）混勻備用。Petroffs氫氧化鈉法（NaOH）NaOH不僅對(duì)非抗酸菌有毒性，而且對(duì)分枝桿菌也具有毒性；因此整個(gè)消化過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行。消化液NaOH的濃度應(yīng)為2%-4%，這樣才能更有效的將痰標(biāo)本消化及除菌。?所需材料NaOH溶液（2%-4%）2N鹽酸（HCl）溶液或鹽酸-酚紅指示劑（HCl-phenolred）?試劑準(zhǔn)備NaOH將2克NaOH（或4克）溶解在100ml蒸餾水中，使之成為2%（或4%）的濃度，高壓滅菌。2NHCl將33ml濃HCl緩緩加入到200ml水中（注意應(yīng)將酸加到水中，無(wú)將水往酸中加），高壓滅菌。酚紅指示劑將20ml酚紅溶液（4%NaOH中加0.4）和85ml濃HCl加入到蒸餾水中，使最終體積為1000ml.注意：酚紅溶液也可單獨(dú)使用。?痰標(biāo)本處理過(guò)程1） 將10ml標(biāo)本加到50ml刻度的帶螺旋蓋子的試管中。加入等體積的上述NaOH溶液。2） 用振蕩儀充分振搖15分鐘，如果同時(shí)能進(jìn)行攪拌以利于消化，則效果更好，然后放置15分鐘。3） 3000Xg離心15分鐘。4） 離心沉淀后，將上清液棄去，再加鹽酸?？梢韵燃?滴指示劑溶液，再一滴一滴的加鹽酸；也

可以直接加鹽酸一酚紅指示劑，當(dāng)指示劑的顏色由紅變?yōu)榉€(wěn)定的黃色時(shí)，即可停止加鹽酸。5） 將沉淀混勻后即可接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。6） 涂片、自然干燥、加熱固定、染色，然后進(jìn)行鏡檢。注意：1，對(duì)于任何消化除菌過(guò)程，允許的污染率為5%-3%。如果污染率明顯地高于5%，則應(yīng)檢查消化過(guò)程，消化不足培養(yǎng)物會(huì)被高度污染。消化過(guò)度會(huì)使得污染率低于3%，并有可能影響培養(yǎng)的陽(yáng)性率。當(dāng)這兩種情況出現(xiàn)時(shí)