淀粉樣多肽誘導阿爾茲海默癥的研究進展

淀粉樣多肽誘導阿爾茲海默癥的研究進展

阿爾茨海默綜合征（ad）是最常見的老年人疾病，于1906年首次報告。其臨床表現(xiàn)為認知功能退化,記憶力和學習能力降低,最終喪失自主生活能力。隨著我國人口老齡化程度的加劇,阿爾茲海默癥已經(jīng)成為了我國國民重要的健康隱患。目前對于阿爾茲海默癥尚無有效的早期診斷手段和治療方法,已發(fā)現(xiàn)的病理特征為神經(jīng)元內(nèi)部的神經(jīng)纏結(jié)和細胞外的淀粉樣斑塊。神經(jīng)纖維纏結(jié)是由一種微管結(jié)合蛋白(tau蛋白)因過磷酸化從微管上脫離并且自聚集成為纖維狀蛋白所導致的。此聚集容易造成神經(jīng)元細胞骨架崩解,進而引發(fā)神經(jīng)炎癥,同時聚集的纖維在細胞內(nèi)堆積會造成神經(jīng)信號通路的敏感性降低。淀粉樣斑塊是由β淀粉樣多肽(amyloid-β,Aβ)在大腦的海馬區(qū)及皮層發(fā)生沉積(聚集)造成的,Aβ是一段長度為40多個氨基酸的多肽,由其前體——淀粉樣蛋白前體(amyloidprecusorprotein,APP)水解得到。APP是一個一次跨膜蛋白,其N端暴露在細胞外,在β分泌酶(β-secretase,又稱betasiteAPPcleavingenzyme,BACE1)和γ分泌酶(γ-secretase)的共同切割下可以得到完整的Aβ蛋白,如圖1所示。由于切割位點的多樣性,得到的蛋白會含有不同數(shù)量的氨基酸殘基,在人體內(nèi)含量較多的Aβ形式是含有40個氨基酸的Aβ1-40(Aβ40)和含有42個氨基酸的Aβ1-42(Aβ42)。目前的研究進展表明,Aβ蛋白的聚集在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中有著重要的作用,是最重要的致病因素之一;而且,在神經(jīng)系統(tǒng)中有著關鍵生理作用的朊蛋白在Aβ誘發(fā)阿爾茲海默癥的過程中有著重要的調(diào)控作用;因此,筆者旨在討論朊蛋白在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中所起到的復雜作用,同時對多種復雜關系進行分析,對以朊蛋白為靶點的治療手段進行了預測。1由于a'的遺傳過程和氨基酸磷的生理功能1.1對細胞毒性和神經(jīng)系統(tǒng)退行如圖2所示,在Aβ的聚集過程中,通常會經(jīng)過2種狀態(tài),首先形成球狀的可溶性寡聚體,寡聚體再進一步形成纖維絲狀結(jié)構(gòu)沉淀在細胞膜表面。從單體到寡聚體再到纖維絲要經(jīng)歷不同的構(gòu)象,通常Aβ蛋白形成纖維絲時會呈現(xiàn)出大量的反向平行的β折疊結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)對于細胞膜會有傷害并引發(fā)細胞凋亡。然而,有研究表明,在Aβ聚集的過程之中,寡聚體往往具有更大的毒性。實驗證明將寡聚體注射到小鼠腦內(nèi)會造成小鼠的學習記憶能力降低,大量細胞實驗也證明寡聚體對于細胞具有更大的毒性,甚至有研究表明tau蛋白的過磷酸化也可能是由于Aβ寡聚體造成的。目前,普遍認為Aβ寡聚體通過兩種方式造成細胞毒性和神經(jīng)系統(tǒng)退行:一方面是Aβ寡聚體能夠附著于細胞膜上從而改變細胞膜通透性。有實驗表明,Aβ蛋白形成的寡聚體在膜環(huán)境下,往往傾向于形成α螺旋的構(gòu)象,這一構(gòu)象容易插入磷脂膜內(nèi)形成跨膜蛋白。計算研究發(fā)現(xiàn)多個這樣的跨膜單位能夠組成跨膜通道,進而使得膜內(nèi)外的水分子和離子的通透性大大增加,最終由于滲透壓的改變導致細胞膜的崩解和神經(jīng)元的凋亡。在體外的模擬實驗中,也觀察到Aβ蛋白能夠改變磷脂脂質(zhì)體的離子通透性。另一方面,Aβ寡聚體能夠與受體結(jié)合,介導細胞凋亡和細胞炎癥的相關通路。即Aβ蛋白寡聚體不直接與磷脂膜作用時,而是作為信號分子或信號分子的抑制劑與細胞膜表面的Aβ受體結(jié)合,導致細胞內(nèi)異常通路的激活或者正常通路的抑制[30。由于生物信號具有很大的擴增作用,在發(fā)病過程中這種效應往往能夠發(fā)生更大的效用。在目前的研究中,被發(fā)現(xiàn)的受體分子有胰島素受體等。不同的受體會有不同的功能,其中朊蛋白是較為特殊的一種受體。1.2蛋白基因?qū)ι窠?jīng)的影響朊蛋白是動物體內(nèi)一種高度保守的蛋白,在神經(jīng)系統(tǒng)中有較高的表達。成熟的朊蛋白包含209個氨基酸殘基并有較為復雜的糖基化修飾,它的C端通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞膜的脂筏上,并暴露在細胞膜外側(cè)。游離的朊蛋白容易與糖基化磷脂酰肌醇結(jié)合并定位在脂筏上。在其N端有若干個八肽重復序列,據(jù)報道和銅離子有較好的結(jié)合能力。雖然錯誤折疊的朊蛋白會引發(fā)瘋牛病、羊搔癢癥等很多傳染性神經(jīng)退行疾病,但是正常的朊蛋白(也稱細胞型朊蛋白,cellularprionprotein,prpc)在神經(jīng)系統(tǒng)中有著較為重要的功能。目前發(fā)現(xiàn)敲除了朊蛋白基因核心區(qū)段的小鼠在低齡期已發(fā)生神經(jīng)退行,而敲除不同區(qū)段的朊蛋白基因會對神經(jīng)系統(tǒng)有不同的影響,說明其對于神經(jīng)發(fā)育有著較為重要而復雜的作用。同時,朊蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中還有調(diào)節(jié)細胞膜內(nèi)外氧化壓力以及離子平衡的作用,是神經(jīng)系統(tǒng)中表達量較高而且較為重要的一種蛋白。2信號分子受體目前對于朊蛋白在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中的影響主要有兩種觀點:其一認為朊蛋白作為膜錨定蛋白能夠起到信號分子受體的作用,通過與細胞外的Aβ寡聚體結(jié)合引發(fā)細胞內(nèi)的通路而產(chǎn)生毒性;另一觀點認為朊蛋白能夠影響Aβ的生成從而起到神經(jīng)保護作用。實際上,由于朊蛋白本身結(jié)構(gòu)特點以及糖基化修飾的復雜性導致了其本身具有多種功能,此二種功能可能在體內(nèi)同時存在并且均發(fā)揮一定的作用。2.1蛋白化合物引起的神經(jīng)毒性2.1.1誘導細胞毒性Lauren等在2009年的報道稱,敲除了朊蛋白基因的細胞系對于Aβ寡聚體介導的神經(jīng)毒性不敏感。Bate等發(fā)現(xiàn)向敲除朊蛋白基因的細胞的培養(yǎng)基中加入游離的朊蛋白時,Aβ寡聚體對細胞的毒性會隨著加入的朊蛋白量的增加而逐漸恢復敏感性,說明很有可能Aβ蛋白寡聚體誘發(fā)細胞毒性的過程中需要朊蛋白介導。且AlunWilliams課題組還發(fā)現(xiàn),朊蛋白的表達量并沒有影響Aβ蛋白的聚集程度。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn),朊蛋白能夠介導Aβ引起多種生理反應,包括電位失常、突觸損傷、跨膜物質(zhì)運輸效率降低甚至細胞凋亡等。在體外利用Aβ蛋白寡聚體和朊蛋白的實驗證據(jù)表明,Aβ蛋白寡聚體和細胞膜上的朊蛋白能夠直接結(jié)合,而此結(jié)合是細胞毒性產(chǎn)生的原因。Lauren、Freir等利用朊蛋白的單克隆抗體與兩種蛋白的結(jié)合位點相互作用而阻斷朊蛋白和Aβ寡聚體的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒性也隨之消失。Freir等還在體外利用免疫學實驗證明二者之間的結(jié)合具有特異性,而且結(jié)合位點位于朊蛋白的91~119位氨基酸之間。Lauren也發(fā)現(xiàn)95~110位氨基酸是朊蛋白和Aβ42蛋白的結(jié)合位點,敲除這些位點或者利用單克隆抗體與這一位點結(jié)合后,細胞對于Aβ寡聚體所誘導的毒性再次顯示出不敏感性。Bate和Freir等通過實驗和計算中發(fā)現(xiàn),朊蛋白往往以2︰1甚至更高的比例和Aβ蛋白寡聚體相結(jié)合,與多個朊蛋白結(jié)合使得Aβ寡聚體與細胞膜表面的朊蛋白集合更牢固。而且有報道表明,Aβ蛋白寡聚體能夠使得細胞膜表面的朊蛋白增加并富集在Aβ寡聚體周圍。因此,由于朊蛋白暴露在細胞膜外,Aβ蛋白寡聚體可能通過與朊蛋白結(jié)合導致其引發(fā)細胞膜內(nèi)的代謝異常;同時,由于朊蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的生理功能,Aβ寡聚體與大量的朊蛋白結(jié)合后會造成朊蛋白正常的功能紊亂;因此可以推測朊蛋白在Aβ寡聚體誘導神經(jīng)毒性的過程中有著重要的作用。2.1.2蛋白誘導a寡聚體的細胞磷脂酶激活和激活在研究朊蛋白介導的Aβ蛋白寡聚體誘發(fā)神經(jīng)毒性的過程中,可以通過對細胞內(nèi)各種功能物質(zhì)和反應的變化來確定朊蛋白受體引發(fā)的細胞內(nèi)反應。2009年Bate等發(fā)現(xiàn)細胞中突觸泡蛋白的量會隨著外源朊蛋白加入量的增加而減少,而細胞內(nèi)被激活的細胞磷脂酶(cellularphosphalipaseA2,cPLA2)會隨之增加。由于突觸泡蛋白是跨膜蛋白,細胞膜的損傷會造成膜蛋白脫落,因而細胞膜的損傷顯然是由于細胞磷脂酶的激活引起的。細胞磷脂酶被激活之后,能夠使得細胞膜崩解、突觸退化、運輸能力降低以及突觸膜蛋白脫落等一系列神經(jīng)損傷。因此,根據(jù)AlunWilliams小組的工作,朊蛋白介導Aβ蛋白誘導神經(jīng)毒性的機理很可能是其激活了細胞磷脂酶。雖然朊蛋白不是跨膜蛋白,但是其依然能夠傳遞生物信號,這很可能是因為朊蛋白錨定在細胞膜的脂筏區(qū),而脂筏是細胞膜功能特異性的區(qū)域,在此區(qū)域朊蛋白和Aβ蛋白寡聚體的結(jié)合或許會影響細胞正常的生理代謝功能。Bate等在離心細胞裂解物時發(fā)現(xiàn)激活的細胞磷脂酶主要出現(xiàn)在脂筏所存在的組分中,說明細胞磷脂酶轉(zhuǎn)移到了脂筏上并且很可能定位到朊蛋白附近;而從細胞裂解物中分離出脂筏后,利用免疫化學方法能夠確定該組分中有Aβ蛋白寡聚體、朊蛋白和細胞磷脂酶的共同存在。這說明在Aβ蛋白寡聚體與朊蛋白相結(jié)合的時候,會使激活的細胞磷脂酶轉(zhuǎn)移到脂筏上,而此時激活的細胞磷脂酶在細胞膜附近時會對其造成傷害。但如果在細胞裂解物中加入能使脂筏崩解的表面活性劑,則離心之后無法得到3種蛋白的共聚物,說明了這三者并非直接作用,而是依賴于脂筏這一復雜的多功能結(jié)構(gòu)相結(jié)合。Bate還通過分析朊蛋白和Aβ寡聚體的復合物發(fā)現(xiàn),在此誘導毒性的過程中,Aβ蛋白的寡聚體與朊蛋白以1︰2的比例結(jié)合,若使用有兩個朊蛋白表位單克隆抗體與細胞直接作用時,發(fā)現(xiàn)細胞毒性和細胞磷脂酶的激活與Aβ寡聚體的作用結(jié)果相同。這說明Aβ寡聚體很可能并不是必需的,而只需要兩個朊蛋白分子互相靠近即可。因此推測朊蛋白介導Aβ寡聚體的細胞毒性的作用機理有可能是Aβ寡聚體其導致細胞膜表面的朊蛋白的二聚化或相互靠近所導致的,如圖3所示。因此,朊蛋白介導Aβ寡聚體毒性的關鍵是二者在脂筏區(qū)的結(jié)合以及隨后誘導的細胞磷脂酶的激活和定位。Bate等利用抑制劑抑制細胞磷脂酶的作用后,發(fā)現(xiàn)朊蛋白介導Aβ寡聚體誘發(fā)神經(jīng)毒性的能力也消失了。結(jié)合Lauren和Freir等利用單克隆抗體的方法,可知朊蛋白和Aβ寡聚體的結(jié)合以及細胞磷脂酶的激活是AD發(fā)病過程中的重要步驟,同時也應是治療AD的重要靶點。2.2蛋白的表達程度雖然大量的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)朊蛋白是Aβ產(chǎn)生毒性的重要因素,但是同樣有報道發(fā)現(xiàn)朊蛋白的表達程度的增加,Aβ蛋白的產(chǎn)生量會有所降低,即朊蛋白能夠減少Aβ的產(chǎn)生,從而有一定的神經(jīng)保護作用。2.2.1蛋白表達程度的影響由于朊蛋白在自身序列、糖基修飾以及生理功能上都有一定的復雜性和特殊性,因此其在神經(jīng)退行性疾病中的作用也較為復雜。在不同實驗條件下,有時也會發(fā)現(xiàn)朊蛋白不具有介導Aβ蛋白寡聚體毒性的功能,甚至在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中有一定的神經(jīng)保護功能。Parkin等利用朊蛋白表達程度不同的細胞實驗發(fā)現(xiàn),隨著朊蛋白的表達程度的增加,細胞所產(chǎn)生的Aβ蛋白的量會有所減少,當干擾朊蛋白的表達后,Aβ蛋白的生成又會增加。由于發(fā)現(xiàn)APP蛋白的表達量并沒有減少,而由β分泌酶單獨切割APP蛋白所產(chǎn)生的sAPPβ的量也會減少,可以推測知道朊蛋白具有抑制β分泌酶的作用效果。2.2.2蛋白c端與糖基化為蛋白的運輸目Parkin等利用人工重組質(zhì)粒的方法分析了在這一保護作用中起作用的朊蛋白片段,他在朊蛋白基因上的不同區(qū)段進行突變后,分析了突變體對于細胞分泌Aβ的影響,最終發(fā)現(xiàn)朊蛋白完整的N端和C端是起到這一保護作用的關鍵,如果此二片段被敲除或替換,則朊蛋白不再能夠減少Aβ的分泌。正常的朊蛋白C端上有和糖基化磷脂酰肌醇的連接位點。如果將C端與糖基化磷脂酰肌醇結(jié)合的位點突變成跨膜單位時,即使朊蛋白能夠固定在細胞膜上,也無法行使神經(jīng)保護作用,這說明朊蛋白的保護作用的發(fā)揮依賴于其定位于脂筏上。而正常朊蛋白的N段具有復雜的糖基化修飾,若用肝素將N端糖基上的活性位點占據(jù)或者敲掉N端糖基化的肽段,其也無法行使神經(jīng)保護作用。因此可以推測,朊蛋白上N端修飾的氨基葡聚糖很可能是發(fā)揮作用的活性位點。為了進一步研究朊蛋白對于β分泌酶的抑制機理,Hooper課題組在表達朊蛋白的細胞的培養(yǎng)基中加入β分泌酶,利用朊蛋白抗體進行免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)朊蛋白能夠特異性結(jié)合β分泌酶,而此結(jié)合又能夠被肝素可逆地阻斷。由此可知β分泌酶與朊蛋白N段的糖基有很好的結(jié)合作用。由于朊蛋白在細胞膜表面的分布局限于脂筏上,因此在與朊蛋白上的糖基相結(jié)合之后,β分泌酶行使切割作用范圍在空間上就大大縮小了。最終Aβ蛋白的分泌量降低,對神經(jīng)元的損傷也就降低了。2.2.3蛋白的保護作用目前對于朊蛋白在阿爾茲海默癥中的兩種作用均已被證明存在。實際上,由于朊蛋白的結(jié)構(gòu)和后修飾的復雜性,其生理功能具有多重性和復雜性也不難理解。深入分析以上兩種不同影響的機理可以發(fā)現(xiàn),朊蛋白的有害作用主要是100位氨基酸附近的氨基酸殘基發(fā)揮的作用,該位點和Aβ蛋白寡聚體的直接結(jié)合導致了朊蛋白的分布變化從而導致細胞內(nèi)細胞磷脂酶的激活;而其保護作用主要是通過朊蛋白上修飾的糖基完成,糖基和β-分泌酶的結(jié)合導致了對后者作用的抑制。即朊蛋白的不同區(qū)域發(fā)揮著不同的生理功能。由于Williams課題組控制朊蛋白的量的方式是向敲除了朊蛋白基因的細胞培養(yǎng)基中加入游離的朊蛋白,雖然朊蛋白能夠自發(fā)地與糖基化磷脂酰肌醇結(jié)合并被后者錨定在脂筏上,但是缺乏正常的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾,某些糖基上的位點的作用可能沒有被發(fā)現(xiàn),可能因此只發(fā)現(xiàn)了朊蛋白的毒性作用。在其他的實驗中,Lauren等通過轉(zhuǎn)染的方式控制朊蛋白的表達,依然發(fā)現(xiàn)了完整修飾的朊蛋白有介導細胞毒性的作用,而Parkin也只發(fā)現(xiàn)了朊蛋白能夠?qū)е翧β蛋白的減少,并沒有發(fā)現(xiàn)此作用可以降低細胞毒性,由此推測,這兩種作用中,朊蛋白的介導細胞毒性的作用占主導。實際上,Aβ和朊蛋白能夠相互調(diào)控,APP被切割分泌后的殘基(AICD)能夠加強朊蛋白的表達,而朊蛋白反饋減弱APP的切割,這種調(diào)節(jié)使得