諾氟沙星與卵清蛋白相互作用的研究

諾氟沙星與卵清蛋白相互作用的研究

諾氟沙星與ova間的相互作用蛋白質(zhì)是生物中不可或缺的活性物質(zhì)。關(guān)于蛋白質(zhì)的研究一直是科研工作者感興趣的內(nèi)容。蛋白質(zhì)與內(nèi)源性化合物及許多藥物分子之間可以發(fā)生相互作用而結(jié)合為復(fù)合物。目前,光譜法在這方面的研究主要針對(duì)血清白蛋白,對(duì)于其他蛋白質(zhì)的研究很少。從不同角度考察不同蛋白質(zhì)與藥物之間的相互作用對(duì)于更全面地了解藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程以及闡明蛋白質(zhì)與藥物小分子相互作用的化學(xué)本質(zhì)都具有非常重要的意義。卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)是單體磷糖蛋白,由于卵清蛋白具有較好的起泡性、親水性和乳化性能,加熱后又易形成凝膠,而被廣泛應(yīng)用于嬰兒食品、肉加工業(yè)、面包和甜點(diǎn)制造業(yè)中。諾氟沙星(norfloxacin,NRF)是第三代喹諾酮類合成抗菌藥,對(duì)革蘭陰性菌、金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的殺菌作用。本文應(yīng)用熒光光譜法研究了不同酸度,不同溫度條件下諾氟沙星與卵清蛋白的相互作用,利用諾氟沙星對(duì)蛋白質(zhì)熒光的猝滅求出了諾氟沙星與卵清蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù),并計(jì)算了它們之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)。同時(shí)還利用紫外吸收光譜法考察了諾氟沙星對(duì)OVA構(gòu)象的影響。這對(duì)闡明蛋白質(zhì)與藥物之間的作用方式有一定的指導(dǎo)意義。1實(shí)驗(yàn)部分1.1phs-2ca型精密酸度計(jì)RF-540型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司),Lambda-17型紫外-可見分光光度計(jì)(美國Perkin-Elmer公司),PHS-2C(A)型精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)。卵清蛋白(OVA,聯(lián)星生物公司)1.0×10-4mol·L-1儲(chǔ)備液,諾氟沙星(河南天方藥業(yè)股份有限公司提供):2.0×10-3mol·L-1水溶液,緩沖溶液pH值分別為5.8,7.4的磷酸鹽緩沖液,pH值為8.4的Tris-HCl緩沖液(均含0.01mol·L-1的NaCl)。所有試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。1.2熒光光譜的測定將一定量的OVA與NRF溶液依次加入到10mL容量瓶中,以相應(yīng)的緩沖溶液稀釋至刻度,混勻,于水浴中恒溫。測定熒光發(fā)射光譜的激發(fā)波長為280nm,掃描范圍為300～500nm。將一定量的OVA與NRF溶液依次加入到10mL容量瓶中,以相應(yīng)的緩沖溶液稀釋至刻度,混勻。以相應(yīng)的NRF溶液為參比,測定紫外吸收光譜。2結(jié)果與討論2.1熒光nrf熒光文化遺產(chǎn)的熒光實(shí)物蛋白質(zhì)中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基而產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源熒光,NRF在與OVA相互作用過程中能猝滅OVA的熒光強(qiáng)度。圖1為30℃,pH7.4時(shí)NRF猝滅OVA的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)波長為280nm時(shí),蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的最大熒光強(qiáng)度的波長分別位于約340和300nm左右。由圖可以看出,隨著溶液中NRF濃度的增大,OVA在338nm處的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)了明顯的猝滅現(xiàn)象,說明蛋白質(zhì)與NRF結(jié)合使色氨酸周圍的微環(huán)境發(fā)生了改變,OVA分子的空間構(gòu)象也發(fā)生了變化。從圖中還可看出,隨著NRF濃度的增加,在蛋白質(zhì)熒光猝滅的同時(shí),熒光發(fā)射峰的峰位也出現(xiàn)了明顯的紅移現(xiàn)象,說明色氨酸的親水性增加。對(duì)于NRF,激發(fā)波長為280nm時(shí),在約415nm處有熒光發(fā)射峰,當(dāng)不斷增加NRF濃度時(shí),發(fā)射峰強(qiáng)度不斷增加。一般情況下,熒光猝滅過程通?？梢苑譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。熒光猝滅數(shù)據(jù)通常用Stern-Volmer方程來進(jìn)行分析F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)F0/F=1+Κqτ0[Q]=1+ΚSV[Q](1)式中:F0和F分別是不存在和存在猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù),τ0為無猝滅劑時(shí)熒光體的熒光壽命,對(duì)于生物大分子,τ0=10-8s,[Q]是猝滅劑的濃度;KSV稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。根據(jù)Stern-Volmer方程,以F0/F對(duì)[Q]作圖,由直線斜率可得到NRF對(duì)OVA的猝滅速率常數(shù)Kq為6.31×1012L·mol-1·s-1。由于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1,NRF對(duì)OVA的猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于這一數(shù)據(jù),表明此體系的猝滅過程不是由于分子擴(kuò)散和碰撞而引起的動(dòng)態(tài)猝滅,而是分子之間形成了化合物而引起的靜態(tài)猝滅。2.2模式2:動(dòng)態(tài)符合信息模型的f0/f[q]分別測定了30和45℃pH為7.4條件下NRF對(duì)OVA的熒光猝滅光譜。根據(jù)Stern-Volmer方程,作兩個(gè)溫度下的F0/F～[Q]圖(見圖2)。判斷是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅,還可根據(jù)猝滅常數(shù)KSV隨溫度的變化關(guān)系加以判斷。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅作用,溫度升高有利于熒光體和熒光猝滅劑之間的有效碰撞,KSV隨溫度的升高而增大;若是靜態(tài)猝滅,溫度升高,復(fù)合物的穩(wěn)定性降低,靜態(tài)猝滅常數(shù)減小。從圖2可以看出,隨著溫度升高,直線斜率減小,表明猝滅為靜態(tài)猝滅機(jī)理。2.3激發(fā)態(tài)分子發(fā)生突變可能引起通射線峰強(qiáng)和峰位變化分別測定了pH為5.8、7.4和8.4條件下30℃的NRF對(duì)OVA的熒光猝滅光譜(圖略)。結(jié)果顯示,隨著pH值的增大,NRF發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度逐漸減小,且峰位也發(fā)生了改變。原因可能是因?yàn)镹RF分子中含有羰基、羧基和氨基,而氮原子和氧原子在不同酸堿溶液中其激發(fā)態(tài)分子可產(chǎn)生與它在基態(tài)時(shí)明顯不同的結(jié)構(gòu)及電子分布,質(zhì)子遷移反應(yīng)相當(dāng)迅速,可以在分子仍處于激發(fā)態(tài)的情況下發(fā)生,結(jié)果可能就引起了發(fā)射峰強(qiáng)和峰位的變化。根據(jù)Stern-Volmer方程,作不同pH值下的F0/F～[Q]圖(見圖3)。從圖中可以看出,隨著溶液中pH值的增大,直線斜率減小,表明pH值增大,NRF對(duì)OVA的猝滅程度逐漸減小。2.4符合不存在和存在爭議內(nèi)容的重復(fù)免疫法對(duì)于靜態(tài)猝滅過程,熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系符合下述方程log[(F0?F)/F]=logK+nlog[Q](2)log[(F0-F)/F]=logΚ+nlog[Q](2)式中,F0和F分別是不存在和存在猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度,K為蛋白質(zhì)與猝滅劑的結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù),[Q]是猝滅劑的濃度。根據(jù)此方程,把所得到的數(shù)據(jù)以log[(F0-F)/F]對(duì)log[Q]作圖(圖4),由直線的截距和斜率可求得藥物與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。由圖得出,30與45℃下NRF與OVA的結(jié)合常數(shù)分別為2.74×105和1.77×105L·mol-1,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.14和1.10。2.5gs的統(tǒng)計(jì)特性藥物與蛋白質(zhì)之間作用的熱力學(xué)參數(shù),ΔH,ΔG,ΔS,可以根據(jù)以下熱力學(xué)公式算出lnK2K1=ΔHR(1T1?1T2)(3)ΔG=?RTlnK(4)ΔS=(ΔH?ΔG)/T(5)lnΚ2Κ1=ΔΗR(1Τ1-1Τ2)(3)ΔG=-RΤlnΚ(4)ΔS=(ΔΗ-ΔG)/Τ(5)根據(jù)兩個(gè)溫度下得到的結(jié)合常數(shù)經(jīng)計(jì)算得到,30與45℃下的ΔH,ΔG,ΔS分別為-22.61kJ·mol-1,-31.54kJ·mol-1,29.47J·K-1和-22.61kJ·mol-1,-31.95kJ·mol-1,29.37J·mol-1·K-1。Ross等根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,總結(jié)出了判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律,即疏水作用力有可能使體系的ΔH和ΔS增大,氫鍵或者范德華力有可能使體系的ΔH和ΔS減小,靜電作用力使ΔH≈0,ΔS>0。對(duì)于所研究的反應(yīng),ΔH為負(fù)值,ΔS為正值,因此可以認(rèn)為諾氟沙星與OVA之間主要以靜電作用力相結(jié)合。2.6氨基酸殘基對(duì)光照的吸收對(duì)于研究有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)的相互作用,紫外吸收光譜法是一種簡單有效的方法。蛋白質(zhì)之所以能產(chǎn)生紫外吸收光譜,其主要原因是色氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基對(duì)光的吸收引起的,此外還有肽鍵對(duì)光的強(qiáng)烈吸收。在250～280nm之間的吸收峰是由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸三種芳香族氨基酸引起的。為了證明加入NRF后OVA的結(jié)構(gòu)變化,實(shí)驗(yàn)測定了紫外吸收光譜(圖5),由圖可以看出,加入NRF后,OVA在約260nm左右的吸收峰的增強(qiáng),并且峰位發(fā)生藍(lán)移,表明加入NRF后,引起了芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了