外涂5%益智雪花膏對紫外線誘導(dǎo)的小鼠光老化皮膚的影響

外涂5%益智雪花膏對紫外線誘導(dǎo)的小鼠光老化皮膚的影響

近年來，由于大氣臭氧層的破壞，輻射到表面的紫外強度逐漸增加，導(dǎo)致各種皮膚的損傷。皮膚的老化包括兩個過程、內(nèi)部老化和光老化。前者主要受遺傳和代謝因素的影響，可以通過改善自己的營養(yǎng)和代謝平衡來預(yù)防。后者主要受長期紫外輻射的影響，只能避免陽光直射和使用抗過性藥物，但在實際生活中，后者很難避免。減少自由基的產(chǎn)生，消除老化代謝產(chǎn)品，提高氧化酶活性，是減少皮膚衰老的有效方法。在中藥中，找不到效率低下的自然自由基去除劑的研究已成為醫(yī)學(xué)和日用化合科學(xué)領(lǐng)域中一個非?；钴S的研究領(lǐng)域。益智(Alpiniaoxyphylla)系姜科山姜屬多年生草本植物,主要分布在海南澄邁、瓊中等地,為海南地道藥材之一,也是我國四大南藥之一,廣東和廣西等地區(qū)亦有栽培.益智仁為益智的干燥成熟果實,是益智入藥的主要部分,分為生品和鹽炙品.生品性溫味辛,主歸脾、腎經(jīng),具有溫脾止瀉,攝唾涎,治療脾寒泄瀉、腹中冷痛、口多唾涎等疾病.鹽炙品可緩其辛燥,主入腎經(jīng),以補腎縮尿澀精為主,治療腎虛遺尿、小便頻數(shù)、遺精白濁等疾病.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,益智具有神經(jīng)保護、抗氧化、抗癌癥、強心和舒張血管等作用.本研究選擇清潔級雌性昆明種小鼠為研究對象,建立小鼠光老化動物模型,以益智油雪花膏外用,通過HE染色觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)改變,通過羥脯氨酸(HYP)、超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA)的的測定分析皮膚膠原含量變化,觀察益智油雪花膏抗皮膚光老化的生物學(xué)效應(yīng).1材料和機器1.1實驗動物中心昆明種小鼠,清潔級,雌性,體重28±2(g),購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,合格證號:省科學(xué)技術(shù)委員會2000A024,省醫(yī)學(xué)實驗動管會26-2001A009.1.2實驗試劑盒總抗氧化能力試劑盒、HYP試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所.1.3智能油提取參見文獻.1.4加熱、冷卻分別稱量硬脂酸20.0g、鯨蠟醇0.5g、甘油8.0g、三乙醇胺1.2g、尼泊金異丙酯0.5g以及5%的益智油適量于250mL燒杯中,氫氧化鈉0.3g、去離子水73mL稱量后加入另一250mL燒杯中.分別加熱至90℃,使物料熔化、溶解均勻.裝水相的燒杯在90℃下保持20min滅菌,在攪拌下將水相慢慢加入到油相中,繼續(xù)攪拌,靜置、冷卻至室溫.1.5nm、電動離心、功率離心檢測紫外線燈管(UVA,40w,光譜集中在365nm;UVB,36w,光譜集中在297nm,北京電光源研究所);721可見光分光光度計(上海光學(xué)儀器五廠);800型電動離心機(金壇市富華儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);HPM-500B電子調(diào)溫電熱套(金壇市金南儀器制造有限公司);TP-214型電子分析天平(丹佛儀器(北京)有限公司).2實驗方法2.1各組大鼠模型外涂雪花膏、模型+外涂雪花膏的各組i組、模型+外涂雪花膏組組、模型+外涂雪花膏組iii組小鼠28只,隨機分為4組,每組7只:正常對照組(I組)、模型組(Ⅱ組)、模型+外涂5%益智雪花膏組(Ⅲ組)、模型+外涂雪花膏組(IV組).2.2uva的照射劑量參考國內(nèi)光老化動物模型方法建立動物模型.照射組動物置于自制鼠盒、絲狀盒蓋固定,背部暴露.模擬日光照射儀在距光源50cm處同時進行UVA和UVB照射.每日1次,每次UVA的照射劑量為10J/cm2;UVB為30mJ/cm2,平均每次照射時間15min,連續(xù)UV照射共20周.照射前用嬰兒剃毛器剃除小鼠背部的絨毛,脫毛范圍(2cm×3cm),脫毛區(qū)給藥(Ⅲ組益智雪花膏外用,IV組雪花膏外用,每次Ⅲ組、IV組雪花膏的量相同,照射前預(yù)防性涂抹2周).實驗期間每1-2d對I、Ⅱ、Ⅲ、IV組小鼠進行剃毛處理,使用專用刷子將藥物均勻涂布于小鼠的試驗區(qū)域,照射期間若發(fā)現(xiàn)小鼠實驗區(qū)域發(fā)紅潰爛,長水泡等情況即停止照射2日.2.3小鼠皮膚長期毒性試驗20周后,眼眶采血用于測定HYP、SOD、MDA含量.然后處死全部小鼠,立即取下背部脫毛區(qū)全層皮膚,1/3皮膚用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液浸泡48h,石蠟包埋,切片,HE染色,樹脂封片.2.4統(tǒng)計處理采用SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)處理.計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.3結(jié)果與討論3.1小鼠背毛時嘴唇增生惡果實驗期間小鼠狀況良好,進食正常,體重變化見表1.初期由于剃毛的不適應(yīng)性,剃毛區(qū)域稍有紅腫,隨著剃毛次數(shù)增加,紅腫漸漸消失.照射8周半后,發(fā)現(xiàn)背部毛發(fā)生長緩慢,遂將體毛周期改為每天剃毛一次.14周后部分實驗小鼠背部裸露皮膚出現(xiàn)紅斑、水皰等現(xiàn)象,停照1-2d后,該狀況消失.3.2小鼠血液中t-aoc、mda的變化由表2可知,Ⅱ組小鼠血液與Ⅰ組相比,SOD、HYP活性明顯下降,MDA含量增加.Ⅲ組小鼠血液SOD、HYP含量明顯高于Ⅱ組,MDA含量低于Ⅱ組.Ⅳ組SOD、HYP含量低于Ⅲ組,MDA含量高于Ⅱ組.Ⅲ組或Ⅳ組小鼠血液的T-AOC、SOD活力顯著高于Ⅰ組,MDA含量顯著低于Ⅰ組.3.3病理組織學(xué)檢測膠原纖維增生與膠原蛋白合成有關(guān),皮膚成纖維細胞合成的蛋白質(zhì)主要是膠原.Ⅰ組:復(fù)層鱗狀層次清晰,真皮內(nèi)膠原纖維分布均勻,細胞胞漿著色鮮艷,核漿比列無異常,核呈梭形,體積較小,染色細致.Ⅱ組:真皮內(nèi)成纖維增生一般,纖維細胞分化成熟,胞漿不豐富,胞核呈梭形,但體積不大,染色細致,間有少量淋巴細胞浸潤.Ⅲ組:復(fù)層鱗狀上皮真皮內(nèi)膠原纖維增生明顯,纖維細胞分化成熟,胞漿豐富,淡紅色,胞核呈梭形,較肥胖,染色質(zhì)細致,間有少量淋巴細胞浸潤.Ⅳ組:真皮內(nèi)成纖維增生稍為明顯,細胞分化成熟,胞漿豐富,胞核呈梭形,染色細致,間有少量淋巴細胞浸潤.經(jīng)益智雪花膏涂抹及未經(jīng)涂抹紫外線照射的小白鼠真皮層均有不同程度的膠原纖維組織增生及多少不等的炎細胞浸潤,纖維細胞分化成熟.4皮膚長期保護作用本實驗通過建立小鼠光老化模型,發(fā)現(xiàn)光老化組小鼠皮膚SOD活力降低,提示抗氧化能力下降,羥脯氨酸含量降低,說明細胞的膠原含量減少,并且細胞氧化程度增加,