不同蛋白源替代飼料中的魚(yú)粉對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)血液生理生化指標(biāo)的影響

不同蛋白源替代飼料中的魚(yú)粉對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)血液生理生化指標(biāo)的影響

隨著世界水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，水產(chǎn)飼料企業(yè)對(duì)魚(yú)粉的需求急劇增加，但魚(yú)粉資源的逐漸減少，價(jià)格急劇上升。因此，尋找能夠代表魚(yú)粉而不是所有硫酸人的蛋白質(zhì)來(lái)源是近年來(lái)水產(chǎn)飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)。在保證水產(chǎn)養(yǎng)殖品種正常生長(zhǎng)的前提下,以廉價(jià)的動(dòng)植物蛋白原替代魚(yú)粉既可以降低飼料成本,又有助于保護(hù)海洋漁業(yè)資源。由于血液生理生化參數(shù)能夠反應(yīng)魚(yú)類健康狀況、營(yíng)養(yǎng)水平及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等,是重要的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo),因而被廣泛用作飼料利用效果綜合評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19]。褐點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelusfuscoguttatus),又稱棕點(diǎn)石斑魚(yú),俗稱老虎斑、虎頭斑,隸屬于鱸形目鮨科石斑魚(yú)屬(Epinephelus),為暖水島礁性魚(yú)類,近年來(lái)已經(jīng)成為海南、廣東、福建等地海水養(yǎng)殖的重要名優(yōu)品種之一。褐點(diǎn)石斑魚(yú)配合飼料的配方以及在配合飼料用廉價(jià)蛋白源替代魚(yú)粉已有報(bào)道,但相關(guān)研究主要著眼于實(shí)驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)狀況等表觀指標(biāo),而替代蛋白飼料對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)血液生理等內(nèi)在指標(biāo)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用豆粕、玉米蛋白粉和啤酒酵母粉等3種蛋白源替代部分魚(yú)粉制成飼料,研究其對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)大規(guī)格種苗血液生理生化指標(biāo)的影響,以期為褐點(diǎn)石斑魚(yú)大規(guī)格種苗培育及高效配合飼料研制提供依據(jù)。1材料和方法1.1飼料原料顆粒制備實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5種等氮等能飼料,原料均購(gòu)自粵海飼料廠,以全魚(yú)粉飼料(D1組)作對(duì)照,用豆粕替代10%、20%的魚(yú)粉蛋白(D2、D3組),玉米蛋白粉替代10%的魚(yú)粉蛋白(D4組),啤酒酵母替代10%的魚(yú)粉蛋白(D5組)。飼料原料粉碎過(guò)孔徑0.212mm的篩,在攪拌器中混勻后加工成直徑3.0mm的顆粒,風(fēng)干,于-20℃下冷藏備用。飼料配方和化學(xué)組成見(jiàn)表1。1.2幼魚(yú)的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)取自廣東海洋大學(xué)魚(yú)類研究課題團(tuán)隊(duì)自繁自育種苗,從育苗場(chǎng)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于數(shù)個(gè)玻璃鋼水槽(100cm×100cm×70cm)用全魚(yú)粉飼料馴養(yǎng)10d,選取規(guī)格大小接近的幼魚(yú)(體長(zhǎng)9.00±0.63cm,體重22.48±3.83g)共180尾,隨機(jī)置于各實(shí)驗(yàn)水槽中,進(jìn)行5個(gè)飼料組的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn);每組3個(gè)平行組,共15個(gè)循環(huán)水槽,養(yǎng)殖密度12尾/水槽。1.3實(shí)驗(yàn)用水及水質(zhì)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在60cm×50cm×70cm的玻璃鋼水槽內(nèi)進(jìn)行,每個(gè)水槽水體體積150L,24h充氣,每天9:00和15:00定時(shí)投喂餌料至飽食。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)沉淀及沙濾的天然海水,海水鹽度27~32,自然光周期及自然水溫。采用流水養(yǎng)殖,每天水交換量100%~150%。每天測(cè)1次水溫,每周測(cè)1次水體溶氧和氨氮,水溫范圍26~32℃,氨氮濃度小于0.5mg/L,溶氧高于5mg/L,pH7.8~8.0,實(shí)驗(yàn)歷時(shí)8周,沒(méi)有實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡。1.4血常規(guī)和生化指標(biāo)檢測(cè)分別從每個(gè)平行組中隨機(jī)取褐點(diǎn)石斑魚(yú)3尾,用2mL一次性無(wú)菌注射器從尾靜脈抽血1mL左右。一部分血液(約0.2mL)加入有抗凝劑的采血管中,用ABXPentra60血細(xì)胞分析儀測(cè)定血常規(guī)指標(biāo);其余血液(約0.8mL)注入玻璃采血管中,于4℃條件下靜置,以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,取血清在日立7020全自動(dòng)生化分析儀中測(cè)定其生化指標(biāo);Na+、K+、Ca2+、Cl-等無(wú)機(jī)離子用S-2000電解質(zhì)分析儀測(cè)定。1.5dunpan’s多重比較用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析后,進(jìn)行Duncan’s多重比較,p<0.05為差異顯著,p>0.05為差異不顯著。2結(jié)果與分析2.1質(zhì)量生產(chǎn)情況投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,D1到D5組實(shí)驗(yàn)魚(yú)終體質(zhì)量見(jiàn)表2。表2可見(jiàn),D5組終體質(zhì)量顯著小于D1組和D2組(p<0.05),其他各組間差異不顯著(p<0.05)。2.2嗜中性紅細(xì)胞密度和巨大不成熟細(xì)胞比例表3表明,D3組血紅蛋白濃度、血栓細(xì)胞密度和平均血栓細(xì)胞體積顯著低于D1組(p<0.05),D4組嗜中性粒細(xì)胞密度和巨大不成熟細(xì)胞比例顯著高于D1組(p<0.05),各組其他指標(biāo)無(wú)顯著差異(p>0.05)。2.3各組各各組未顯著差異表4表明,D3組褐點(diǎn)石斑魚(yú)血清中總蛋白(TP)含量顯著低于D1、D4組(p<0.05),其他組之間無(wú)顯著差異(p>0.05);各組白蛋白(ALB)含量無(wú)顯著差異(p>0.05);D3組球蛋白(GLB)含量顯著低于D1組(p<0.05),其他組之間無(wú)顯著差異(p>0.05);D3組白、球蛋白比顯著高于其他組(p<0.05),其他組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。2.3氨酶、尿素氮以及尿酸含量由表5可見(jiàn),各組褐點(diǎn)石斑魚(yú)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮以及尿酸含量均無(wú)顯著差異(p>0.05);D5組的肌酐含量顯著高于D1組(p<0.05),與D2、D3、D4組無(wú)顯著差異(p>0.05)。2.4其他組之間比較由表6可見(jiàn),D3組褐點(diǎn)石斑魚(yú)血清中的血糖(Bloodsugar,BLS)含量顯著低于D1組(p<0.05),其他組之間無(wú)顯著差異(p>0.05);D2、D3、D5組的甘油三酯(Triglyceride,TG)含量顯著低于D1、D4組(p<0.05);各組總膽固醇(Cholesterol,CHOL)含量均無(wú)顯著差異(p>0.05)。2.5不同劑量石斑魚(yú)飼料對(duì)蛋白代謝的影響由表7可以看出,各組褐點(diǎn)石斑魚(yú)血清中K+、Na+、Cl-、Ca2+的濃度均無(wú)顯著性差異(p>0.05),可見(jiàn)該石斑魚(yú)飼料中蛋白質(zhì)成分的變化對(duì)其血清無(wú)機(jī)離子的影響較小。3討論3.13血糖、血脂和嗜中性細(xì)胞有研究表明,魚(yú)類處于饑餓狀態(tài)時(shí)其血紅蛋白含量會(huì)顯著上升。陳惠群等觀察到,饑餓8d會(huì)導(dǎo)致鰻鱺(Anguillajaponica)血紅蛋白含量顯著上升,而紅細(xì)胞數(shù)則顯著下降。喬志剛等則發(fā)現(xiàn),短期饑餓(7d)的鲇(Silurusasotus)紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量呈上升趨勢(shì);而饑餓至21d,血紅細(xì)胞數(shù)低于饑餓處理前,血紅蛋白含量雖略高于饑餓處理前,但也呈下降趨勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)中,豆粕替代20%魚(yú)粉組的血紅蛋白含量顯著小于全魚(yú)粉飼料組,而其他各組與全魚(yú)粉飼料組無(wú)顯著差異,說(shuō)明攝食替代蛋白飼料的實(shí)驗(yàn)魚(yú)并未處于饑餓狀態(tài)。豆粕替代20%魚(yú)粉組的血紅蛋白含量較低可能是由于豆粕蛋白的氨基酸組成不平衡造成的,可見(jiàn)豆粕替代20%魚(yú)粉的飼料無(wú)法滿足褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)快速生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求,長(zhǎng)期投喂(56d)會(huì)對(duì)其血紅蛋白合成產(chǎn)生不良影響。此外,本實(shí)驗(yàn)在豆粕、玉米蛋白粉、啤酒酵母替代一定比例的魚(yú)粉后,各組紅細(xì)胞密度、白細(xì)胞密度和平均紅細(xì)胞體積無(wú)顯著性差異,這可能是因?yàn)楹贮c(diǎn)石斑魚(yú)屬肉食性魚(yú)類,對(duì)血液生理指標(biāo)有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。魚(yú)類血栓細(xì)胞具有與哺乳動(dòng)物血小板相似的凝血功能。在本實(shí)驗(yàn)中,20%豆粕替代魚(yú)粉組血栓細(xì)胞密度、平均血栓細(xì)胞體積相對(duì)于對(duì)照組顯著降低,而其他組差異不顯著,說(shuō)明飼料中大豆蛋白含量增加會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚(yú)血栓細(xì)胞體積減小和數(shù)量減少,可能是大豆蛋白中存在的紅細(xì)胞凝集素影響了褐點(diǎn)石斑魚(yú)血栓細(xì)胞的生成。嗜中性粒細(xì)胞是魚(yú)類重要的非特異性免疫細(xì)胞。研究表明,攝食大豆蛋白飼料的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)白細(xì)胞數(shù)量、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活力上升,表明實(shí)驗(yàn)魚(yú)可能存在過(guò)敏或炎癥反應(yīng)。此外,巨大不成熟細(xì)胞增加也表明魚(yú)類可能發(fā)生了血液病變。在本實(shí)驗(yàn)中,玉米蛋白替代10%魚(yú)粉組的嗜中性粒細(xì)胞密度和巨大不成熟細(xì)胞比例顯著高于其他組,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)魚(yú)可能處于受脅迫或過(guò)敏狀態(tài)。3.23大豆分離蛋白替代飼料對(duì)魚(yú)粉比例的影響生物血清中的總蛋白(TP)含量變化能夠反映生物肝臟合成功能異常和腎臟病變而造成蛋白質(zhì)丟失的狀況,被用作魚(yú)體對(duì)環(huán)境應(yīng)激因子反應(yīng)的指示物。血液中的白蛋白(ALB)是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)載體,是機(jī)體蛋白質(zhì)的來(lái)源之一,可以維持血漿滲透壓,修補(bǔ)組織,并提供能量。血液中的球蛋白(GLB)由漿細(xì)胞分泌,是機(jī)體抵抗力高低的反映。徐奇友等研究發(fā)現(xiàn),隨大豆分離蛋白替代飼料魚(yú)粉比例的增加,肉食性的哲羅魚(yú)(Huchotaimen)血清中總蛋白含量逐漸減低,球蛋白的含量先下降后上升,但差異都不顯著;大豆蛋白完全替代魚(yú)粉時(shí)血漿白蛋白顯著降低,可能是因?yàn)檎芰_魚(yú)對(duì)替代飼料的采食量下降,影響了體內(nèi)氨基酸的合成。Rumsey等的研究發(fā)現(xiàn),與攝食全魚(yú)粉的虹鱒(O.mykiss)相比,攝食大豆蛋白飼料的虹鱒血清總蛋白和免疫球蛋白含量都有所上升。劉襄河等研究發(fā)現(xiàn),隨著飼料中豆粕替代魚(yú)粉比例的增加,牙鲆(Paralichthysolivaceus)血清總蛋白含量逐漸降低,當(dāng)動(dòng)植物蛋白比為1∶1時(shí)差異顯著。本實(shí)驗(yàn)表明,3種蛋白源替代魚(yú)粉都導(dǎo)致褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)血清中總蛋白和球蛋白含量降低,其中豆粕替代20%魚(yú)粉組與對(duì)照組差異顯著,說(shuō)明用豆粕替代20%魚(yú)粉飼料已對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)的免疫機(jī)能產(chǎn)生顯著的不良影響。各飼料組實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清中白蛋白含量差異不顯著,說(shuō)明這幾種替代飼料基本能夠滿足褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)的蛋白質(zhì)需求。在本實(shí)驗(yàn)中,投喂20%豆粕替代魚(yú)粉飼料降低了褐點(diǎn)石斑魚(yú)幼魚(yú)的免疫球蛋白含量,導(dǎo)致白球蛋白比顯著上升。3.33不同蛋白源對(duì)魚(yú)粉血清蛋白的影響轉(zhuǎn)氨酶是生物體內(nèi)氨基酸代謝的催化劑,當(dāng)肝臟組織病變而引起肝細(xì)胞膜通透性增加,細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶大量釋放出來(lái)進(jìn)入血液,引起血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)濃度的升高,因此血液中轉(zhuǎn)氨酶的活力也可作為作肝功能的指示物。研究表明,草魚(yú)(Ctenopharynodonidellus)飼料中添加300g/kg的菜籽粕不會(huì)影響血清中ALT和AST的活性,但是在飼料中直接添加菜籽作為脂肪源,會(huì)對(duì)草魚(yú)的肝胰臟造成一定損害,使草魚(yú)血清中轉(zhuǎn)氨酶活力大幅提高,導(dǎo)致其非特異性免疫力下降。在本實(shí)驗(yàn)中,攝食3種蛋白源替代魚(yú)粉飼料的褐點(diǎn)石斑魚(yú)轉(zhuǎn)氨酶的活力無(wú)顯著差異,說(shuō)明這3種蛋白源以較低比例替代魚(yú)粉時(shí)對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)的肝功能無(wú)明顯不良影響,但是D4組轉(zhuǎn)氨酶的活力在各實(shí)驗(yàn)組中最高,提示玉米蛋白替代魚(yú)粉對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)的肝胰臟具潛在威脅。血清中的尿素氮可以反映生物的蛋白質(zhì)代謝狀況,血清中尿酸和肌酐含量則反映了腎臟的功能,研究表明,在草魚(yú)飼料中添加300g/kg的菜籽粕對(duì)血清中的肌酐含量無(wú)顯著影響,大豆分離蛋白替代魚(yú)粉(最高替代100%)也不會(huì)對(duì)哲羅魚(yú)(H.taimen)血漿中肌酐含量產(chǎn)生顯著影響,但是全光照和全避光條件下的中華鱘(Acipensersinensis)幼魚(yú)血漿中肌酐含量均比對(duì)照組含量高,說(shuō)明腎臟受到了不同程度的損傷。本實(shí)驗(yàn)中,各飼料組實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清中尿素和尿酸的含量均無(wú)顯著差異,除攝食酵母蛋白替代飼料(D5組)實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清中的肌酐含量顯著小于攝食全魚(yú)粉飼料(D1組)的實(shí)驗(yàn)魚(yú)之外,其他各飼料組實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清中的肌酐也無(wú)顯著差異,說(shuō)明酵母作為蛋白源可能會(huì)對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)的腎臟功能產(chǎn)生不良影響。3.43玉米蛋白和糖質(zhì)蛋白血糖含量是反映生物碳水化合物代謝水平的重要生化指標(biāo),當(dāng)魚(yú)類積極攝食,健康狀況良好時(shí),血糖濃度較高。王崇等觀察到,飼料中豆粕含量越高,雜食性的異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)血清中的葡萄糖含量越高;而陸陽(yáng)等的研究則表明,隨著膨化豆粕替代魚(yú)粉的比例從20%上升到80%,肉食性的虹鱒血糖濃度有逐漸下降的趨勢(shì),但差異不顯著。本實(shí)驗(yàn)條件下,豆粕替代20%魚(yú)粉飼料組血糖濃度顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明在肉食性魚(yú)類的飼料中添加過(guò)量豆粕等植物性蛋白可能會(huì)導(dǎo)致其碳水化合物吸收不良,致使血糖濃度降低。血液中的甘油三酯和總膽固醇含量是反映魚(yú)類體內(nèi)脂肪代謝水平的重要生理指標(biāo),其含量過(guò)高表明魚(yú)類肝臟中堆積的脂肪較多,容易導(dǎo)致脂肪肝、肝肥大等癥狀;而其含量過(guò)低則表明魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)不良,生長(zhǎng)狀況受到影響。研究發(fā)現(xiàn),隨著飼料中玉米蛋白替代魚(yú)粉比例升高,肉食性的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)血清中膽固醇和甘油三酯的含量顯著降低,生長(zhǎng)狀況受到影響;隨豆粕替代魚(yú)粉比例提高,肉食性的虹鱒(O.mykiss)血漿中的膽固醇也呈現(xiàn)降低趨勢(shì);而雜食性的異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)膽固醇含量顯著降低,但甘油三酯的含量升高,生長(zhǎng)速率顯著降低;劉襄河等的研究則發(fā)現(xiàn),隨著豆粕替代魚(yú)粉比例的增加,肉食性的牙鲆(Paralichthysolivaceus)血清中的膽固醇和甘油三酯的含量逐漸上升,生長(zhǎng)狀況受到影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),3種蛋白源以較低比例替代魚(yú)粉時(shí)對(duì)褐點(diǎn)石斑魚(yú)總膽固醇含量無(wú)顯著影響,玉米蛋白替代魚(yú)粉組對(duì)血液中甘油三酯的含量也無(wú)顯著影響,但豆粕和啤酒酵母這兩種蛋白替代魚(yú)粉顯著降低了血液中甘油三酯的含量,且豆粕替代比例越高,甘油三酯的含量下降越明顯。上述研究結(jié)果表明,過(guò)量植物蛋白替代飼料中的魚(yú)粉會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類血液中甘油三酯和總膽固醇含量產(chǎn)生顯著變化,可能升高也可能降低,對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不良影響;植物蛋白替代飼料中的魚(yú)粉對(duì)魚(yú)類血脂的影響可能與植物蛋白的種類以及魚(yú)類生理特點(diǎn)都有關(guān)系,其內(nèi)在機(jī)理有待深入研究。3.53無(wú)機(jī)離子濃度的變化Na+、K+、Ca2+、Cl-等無(wú)機(jī)離子在維持魚(yú)類血漿滲透壓和酸堿平衡,保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用,在受到環(huán)境的脅迫作用之后血液無(wú)機(jī)離子濃度