米曲霉產(chǎn)糖化酶培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

米曲霉產(chǎn)糖化酶培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

“小麥酒和酒精”是中國黃酒的特點(diǎn)。這是中國古代工人根據(jù)長期積累的寶貴經(jīng)驗(yàn)提出的一項(xiàng)偉大的發(fā)明。麥曲是以小麥為主要原料，在開放式的制曲過程中，通過自然培育，富集環(huán)境中的有益微生物而形成的復(fù)雜體系。在黃酒發(fā)酵中，麥曲作為復(fù)合糖化發(fā)酵粗酶制劑，同時(shí)具有生香、增味、成色的多種功能，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到黃酒的質(zhì)量和產(chǎn)量，其內(nèi)在品質(zhì)與黃酒品質(zhì)之間相輔相成。成品麥曲中糖化酶活性的高低是目前衡量麥曲質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，也是影響出酒率的關(guān)鍵因素。黃酒企業(yè)為了保證成品麥曲的糖化酶活性，采用麩皮培養(yǎng)基對米曲霉進(jìn)行純種培養(yǎng)獲得高糖化酶活性的麩曲，而后將麥曲和麩曲按一定比例混合，然后用于黃酒釀造。所以高糖化酶活性的麩曲對黃酒生產(chǎn)顯得很重要。米曲霉是一種既能產(chǎn)糖化酶也能產(chǎn)液化酶的絲狀真菌。日本清酒生產(chǎn)用的米曲就是以純種米曲霉培養(yǎng)而成的，它的作用是將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖。中國黃酒生產(chǎn)中所用的純粹培養(yǎng)麥曲也以米曲霉(大多采用米曲霉蘇-16)為生產(chǎn)菌種。因此，獲得高產(chǎn)糖化酶的菌種以及對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化顯得十分重要。響應(yīng)面法(responsesurfacemethodology,RSM)是一種優(yōu)化生物過程的綜合技術(shù)，采用該法可以建立連續(xù)變量曲面模型，可同時(shí)對影響生物產(chǎn)量的各因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)，因此它可快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件。目前該法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各類培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)踐中。本實(shí)驗(yàn)主要采用RSM法，對影響米曲霉產(chǎn)糖化酶活性的一些關(guān)鍵因素進(jìn)行研究。1材料和方法1.1zeaao-1的ao-1麩皮、馬鈴薯市場購買。米曲霉(A.oryzae)AO-01為本課題組從黃酒麥曲中分離篩選所得。醋酸鈉、醋酸、可溶性淀粉、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、硫酸和硫代硫酸鈉。1.2設(shè)備和技術(shù)指標(biāo)LRH-250型生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；TGL-16C型臺(tái)式高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；1086型精密水浴鍋德國GFL公司；HYG-II型迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶機(jī)上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備成套廠；UV-2100型紫外分光光度計(jì)UNICO(上海)儀器公司；LS-350L型立式壓力蒸氣滅菌鍋上海醫(yī)用核子儀器廠；MP2000D型電子天平精科儀器(上海)有限公司；DG-2B多功能恒溫箱上海醫(yī)療器械修造廠；超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司。1.3瓊脂糖添加量斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L,pH自然。麩皮培養(yǎng)基：麩皮:水=1:1。培養(yǎng)基均采用0.1MPa下滅菌20minㄢ1.4方法1.4.1培養(yǎng)條件確定孢子懸浮液制備：取30℃培養(yǎng)3d的試管斜面菌種，加入無菌生理鹽水洗下孢子，無菌條件下過濾至帶玻璃珠的無菌三角瓶中搖勻，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)至106個(gè)/mlㄢ固態(tài)發(fā)酵：取1ml孢子懸浮液接入麩皮培養(yǎng)基中，置30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔4h搖瓶一次。1.4.2酶溶液的制備固態(tài)發(fā)酵后，向麩曲中加入生理鹽水，于30℃、120r/min振蕩浸提1h。三層紗布過濾，所得濾液用于測定糖化酶酶活。1.4.3糖化酶的測定按參考文獻(xiàn)測定糖化酶活性，結(jié)果用U/g干曲表示。1.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.5.1單因素影響測試主要考察培養(yǎng)時(shí)間(h)、溫度(℃)、固水比等因素對糖化酶活性的影響。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)，取其平均值進(jìn)行分析。1.5.2box-behnkenlh模型Box-Behnken模型設(shè)計(jì)法每個(gè)因素取三個(gè)水平，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。采用Box-Behnken模型，以糖化酶活性為響應(yīng)值，培養(yǎng)時(shí)間(h)，溫度(℃)，固水比這三個(gè)外界因子為自變量，分別以X1、X2、X3來表示，并以編碼值+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平(見表1)，且真實(shí)值與編碼值符合方程(1)。該模型通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為：式中，Y為預(yù)測響應(yīng)值；Xi和Xj為自變量編碼值；C0為常數(shù)項(xiàng)；Ai為線性系數(shù)；Bij為二次系數(shù)；n為因子數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中為3。按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對方程(2)中各項(xiàng)回歸系數(shù)需要15組試驗(yàn)。采用SAS(Version8.0)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。采用SAS典型性分析預(yù)測米曲霉(A.oryzae)AO-01產(chǎn)糖化酶的最佳發(fā)酵條件以及最大值。2結(jié)果與分析2.1單因素試驗(yàn)和發(fā)酵條件2.1.1不同培養(yǎng)時(shí)間對糖化酶活性的影響在培養(yǎng)溫度為30℃、固水比1:1條件下，考察培養(yǎng)時(shí)間對糖化酶活性的影響。不同培養(yǎng)時(shí)間對A.oryzaeAO-01產(chǎn)糖化酶的影響如圖1。由圖1可見，在時(shí)間低于33h時(shí)糖化酶升高比較明顯，以后逐漸下降。在第33h酶活性最高，達(dá)到1359.4U/g干曲。這表明，糖化酶活性與培養(yǎng)時(shí)間密切相關(guān)。時(shí)間過短，糖化酶產(chǎn)出不夠，而時(shí)間過長又會(huì)影響糖化酶的活力，使其活力降低。2.1.2培養(yǎng)溫度對糖化酶活性的影響在固水比為1:1，培養(yǎng)時(shí)間30h，研究不同培養(yǎng)溫度(25～35℃)對A.oryzaeAO-01產(chǎn)糖化酶的影響，結(jié)果如圖2所示。溫度是影響微生物生長以及酶活力的最重要的因素之一。從本實(shí)驗(yàn)所選擇的培養(yǎng)溫度可以看出，溫度為25℃時(shí)，糖化酶活力約為1000U/g干曲。隨著培養(yǎng)溫度的提高，酶活逐漸增高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，糖化酶活性最高，達(dá)到1398.2U/g干曲。但溫度過高糖化酶活力稍有降低，可能是因?yàn)楦邷貤l件下酶失活的結(jié)果，這與大多數(shù)酶活力測定結(jié)果一致。2.1.3aeao-2011產(chǎn)糖化酶的變化在固定溫度33℃、培養(yǎng)時(shí)間33h的條件下，改變不同的固水比，研究固水比對A.oryzaeAO-01產(chǎn)糖化酶的影響，結(jié)果見圖3。麥曲中微生物的產(chǎn)酶均屬于固態(tài)發(fā)酵過程。因此，發(fā)酵過程中水的用量是影響微生物產(chǎn)酶的重要因素。從圖3中可以看出，固水比的增加對糖化酶活力有明顯的效果，當(dāng)固水比在1:1.2時(shí)，酶活最高，達(dá)到1431.5U/g干曲。2.2糖化酶活性的顯著性通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)時(shí)間、溫度和固水比對A.oryzaeAO-01產(chǎn)糖化酶的酶活均有影響。根據(jù)BoxBehnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，做三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。1～12組為析因試驗(yàn)，13～15組為中心試驗(yàn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。利用SAS軟件，通過表2中糖化酶試驗(yàn)數(shù)據(jù)對方程(2)進(jìn)行多元回歸擬合，可以得到糖化酶活性對編碼自變量發(fā)酵時(shí)間、溫度和固水比的二次多項(xiàng)式方程：從表3對模型的方差分析結(jié)果可見，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(Pmodel=0.002535)，其校正決定系數(shù)R2adj為91.81%，表明只有約9%的糖化酶活性總變異不能由此模型進(jìn)行解釋。相關(guān)系數(shù)R2為97.07%，表明糖化酶活性的實(shí)測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度。從表3可以看出，發(fā)酵時(shí)間和固水比對糖化酶活性的曲面效應(yīng)顯著，培養(yǎng)溫度不顯著；培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度的交互作用影響不顯著，而其它兩兩交互作用均顯著；線性影響效應(yīng)中發(fā)酵時(shí)間和固水比顯著，而培養(yǎng)溫度不顯著。通過方程(3)所作的曲面圖和等高線圖如圖4～6所示。每張等高線圖中都含有一個(gè)中心點(diǎn)，說明在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)所選的因素水平較合理。此外，各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過圖直觀反映出來，圖中等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反。圖4顯示了固水比位于中心水平時(shí)(X3=0)，培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度對糖化酶活性的交互影響。從其等高線圖可以直觀地看出此兩因素的交互作用不顯著。當(dāng)培養(yǎng)溫度處于中心水平時(shí)(X2=0)，培養(yǎng)時(shí)間和固水比對糖化酶活性的交互影響見圖5?？梢钥闯鲞@兩因素的交互作用對糖化酶活性的影響顯著。由圖6可見，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間處于中心水平時(shí)(X1=0)，培養(yǎng)溫度和固水比對糖化酶活性具有較強(qiáng)的交互作用。擬合方程(3)對X1、X2、X3分別求偏導(dǎo)，可以得到模型的極值，即為最大的糖化酶活性。解方程(3)，得到最大值Y1=1625.4，此時(shí)編碼值X1=-0.0647,X2=-0.665,X3=0.744。預(yù)測糖化酶的最大酶活為1625.4U/g干曲時(shí)，對應(yīng)的培養(yǎng)條件：發(fā)酵時(shí)間32.8h，培養(yǎng)溫度31.2℃，固水比1:1.24ㄢ2.3糖化酶發(fā)酵條件優(yōu)化為了驗(yàn)證預(yù)測值，用以上得到的最優(yōu)培養(yǎng)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，結(jié)果分別為：1588.2、1563.9、1645.1U/g干曲，平均為1599.0U/g干曲，與預(yù)測值有較好的擬合性，證明了響應(yīng)曲面法優(yōu)化糖化酶發(fā)酵條件的可行性。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，最高酶活1645.1U/g干曲，比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最低酶活656.2U/g干曲提高了1